体外方法 相关申请的交叉引用 [0001] 本申请与2022年3月14日提交的欧洲专利申请22161997.6相关并要求其优先权，该申请的全部内容通过引用并入本文。 发明领域 [0002] 本发明涉及改进的方法，该方法使用开放式微灌注(open flow micro‑perfusion)(OFM)组合扩散池装置(特别是静态Franz扩散池(FDC))来表征化合物(例如活性药物成分(API))通过皮肤的扩散。这些方法是使用皮肤外植体的体外方法。 [0003] 发明背景 [0004] 当前的医疗产品开发路径变得越来越具有挑战性、效率低下且成本高昂。美国食品药品管理局(FDA)认为，“尚未开展足够的应用科学工作来创建新工具，以便从根本上更好地回答如何以更快的时间范围、更高的确定性和更低的成本证明新产品的安全性和有效性。在许多情况下，开发人员别无选择，只能使用上个世纪的工具和概念来评估本世纪的候选产品。结果，进入临床试验的绝大多数研究产品都失败了。”(USFDA；2004“Innovation or Stagnation: Challenge and Opportunity on the Critical Path to New Medical Products," at https://www.who.int intellectualproperty/documents/en/ FDAproposals.pdf)。 [0005] 该声明对于有效局部用产品的开发尤其是那些目标作用部位位于皮肤下(例如软组织或关节)的产品特别重要。 [0006] 临床候选药物的选择在很大程度上取决于使用Franz扩散池(FDC)评估其跨皮肤屏障输送活性药物成分(API)的能力。尽管它历史悠久(Franz, T. J., 1975, J. Invest. Dermatol. 64 (3), 190‑195)，但它仍然是局部用药物开发过程中应用最广泛的主力药物。尽管如此，FDC也有局限性，虽然这种方法可以提供与API跨皮肤屏障(角质层或SC)的被动扩散相关的可靠数据，但它几乎无法揭示下游(例如深层真皮)中赋形剂依赖性API的生物分布，因为API不易从皮肤下层释放，因此在受体液中无法检测到。 [0007] 基于生理的药代动力学建模和模拟(PBPK)是一种计算机建模方法，它结合了器官的血流和组织组成来确定药物的药代动力学(PK)。FDA倾向于使用PBPK，因为这种方法可以减少或免除昂贵且冗长的临床试验。然而，与FDC一样，这些方法也有局限性。例如，目前的局部吸收模型包括生物过程，这些过程仅通过使用血浆药代动力学推断进行验证，并且仅在极少数情况下通过组织采样进行验证。使用模型生成的局部和全身API生物利用度预测来比较具有不同组成和/或物理和结构特性的复杂药物制剂仍然是一项艰巨的任务。在存在不同非活性成分的情况下，基于定量结构活性关系(QSAR)估计API透皮扩散的扩散系数(D)和溶质分配系数(K)仍然不够精确，而且考虑到许多赋形剂组合产生的协同效应，通常甚至不可行。 [0008] 因此需要改进方法来表征用于局部给药至皮肤不同层的产品的API递送。 发明内容 [0009] 本发明人发现，开放式微灌注(OFM)可与扩散池装置(尤其是Franz扩散池(FDC))组合使用，以提供改进的体外方法来评估化合物(例如API)向皮肤的扩散。通过首次组合这两种方法(FDC和OFM)，获得了新的、方便的方法来评估赋形剂对API跨SC屏障被动扩散的影响–这是仅单独使用FDC或OFM无法轻易实现的可能性。 [0010] 因此，在第一方面，提供了一种评估化合物向皮肤扩散的体外方法，该方法包括： [0011] (i)将该化合物施加到第一皮肤外植体的表面上，使用扩散池(DC)确定第一皮肤外植体中的化合物的浓度；和 [0012] (ii)将该化合物施加到第二皮肤外植体的表面上，使用开放式微灌注(OFM)确定第二皮肤外植体中的化合物的浓度。 [0013] 该化合物可以是活性药物成分(API)。具体而言，该化合物是包含该化合物和至少一种药学上可接受的载体的组合物的一部分。更具体地说，该化合物是配制用于局部应用的组合物的一部分。在一些实施方案中，该化合物是双氯芬酸或其盐。具体而言，该化合物是双氯芬酸钠或双氯芬酸二乙铵。 [0014] 根据本发明的另一个方面，用于确定包含活性成分和至少一种药学上可接受的载体的局部用药物组合物的皮肤渗透特征的体外方法包括以下步骤： [0015] (i)获取第一皮肤外植体的真皮上层内的活性成分的时间分辨浓度数据，其中使用扩散池获取该浓度数据； [0016] (ii)获取第二皮肤外植体的真皮下层和/或皮下组织中的活性成分的时间分辨浓度数据，其中使用开放式微灌注获取该浓度数据； [0017] (iii)生成活性成分在真皮上层、真皮下层和/或皮下组织中浓度数据随时间变化的时间分辨曲线。 [0018] 优选地，开放式微灌注使用包含1%人血清白蛋白的灌注液。 [0019] 优选地，扩散池装置是Franz扩散池(FDC)。 [0020] 第一和第二皮肤外植体可以是同一皮肤外植体的不同部分或两个不同的皮肤外植体。本发明方法中用于DC特别是FDC的皮肤外植体包括具有外角质层和真皮上层的表皮层。本发明方法中用于OFM的皮肤外植体包括具有外角质层、真皮上层、真皮下层和皮下层的表皮层。 [0021] 步骤(i)和(ii)可以按任何顺序进行，例如依次(即先进行(i)然后进行(ii)或先进行(ii)然后进行(i))或并行(即同时)进行。 [0022] 优选地，施用该化合物的皮肤外植体的表面是角质层。因此，该方法可以包括将该化合物施用到第一皮肤外植体的角质层和/或将该化合物施用到第二皮肤外植体的角质层。 [0023] 具体而言，皮肤外植体中化合物的浓度是在远离角质层的皮肤外植体内(例如在表皮层、真皮上层、真皮下层和/或皮下层内)的部位测定的。 [0024] 在某些实施方案中，该方法包括使用扩散池(DC)确定第一皮肤外植体的真皮上层中的化合物浓度。在某些实施方案中，该方法包括使用Franz扩散池(FDC)确定第一皮肤外植体的真皮上层中的化合物浓度。术语“真皮上层”在本文中用于表示真皮的上部，例如在距角质层表面0.2mm至0.4mm的范围内。 [0025] 该方法可以包括使用开放式微灌注(OFM)确定第二皮肤外植体的真皮层(优选真皮下层)内的化合物浓度。术语“真皮下层”在本文中用于表示真皮的下部，距离角质层上表面0.5mm至1.5mm之间，优选0.8mm至1.2mm之间，优选约1mm。该方法可以包括使用开放式微灌注(OFM)确定第二皮肤外植体的皮下层内的化合物浓度。皮下层内的测量可以例如在距离角质层上表面2.5mm至3.5mm之间进行。 [0026] 在优选实施方案中，该方法包括使用开放式微灌注(OFM)确定第二皮肤外植体的真皮下层和皮下层内的化合物浓度。 [0027] 具体地，对皮肤外植体中的化合物的浓度进行多次例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、 12、13、14次或更多次测定。 [0028] 具体而言，在多个不同的时间点多于一次测定皮肤外植体中化合物的浓度。例如，可以每小时测定一次浓度，或每2小时测定一次浓度，总时间段至少为12小时，或优选至少为24小时。 [0029] 在一些实施方案中，提供了评估化合物向皮肤扩散的体外方法，该方法包括： [0030] (i)将该化合物施加到第一皮肤外植体的表面上，使用扩散池(DC)确定第一皮肤外植体中的化合物在多个不同时间点的浓度；和 [0031] (ii)将该化合物施加到第二皮肤外植体的表面上，使用开放式微灌注(OFM)确定第二皮肤外植体中的化合物在多个不同时间点的浓度。 [0032] 更具体地说，在从化合物首次施加到皮肤外植体表面的时间开始的一段时间内(例如在24小时内)的不同时间点重复确定皮肤外植体中化合物浓度的步骤。在一些实施方案中，在24小时内每小时重复确定化合物浓度的步骤。优选地，在一系列时间间隔内获得一系列测量值，并用于生成化合物浓度的时间分辨曲线。该时间分辨曲线显示了化合物在皮肤外植体中的多个位置的浓度随时间的变化。具体而言，OFM和FDC生成的数据相组合，提供在皮肤外植体的表皮层、真皮层和皮下层中化合物的浓度随时间变化的时间分辨曲线。 [0033] 如上所述，FDC不是测量真皮下层或皮下组织中化合物浓度的合适方法。同时，OFM探针通常使用套管作为引导，手动插入皮肤外植体中，并且很难插入表皮或真皮上层。因此，这两种方法的组合是独一无二的，因为它可以获得跨多层皮肤的渗透曲线，而这两种方法都无法单独提供。 [0034] 因此，在本发明的第二方面，提供了评估化合物向皮肤扩散的体外方法，该方法包括： [0035] (i)将该化合物施加到第一皮肤外植体的角质层，使用扩散池(DC)确定第一皮肤外植体的真皮上层内的化合物在一段时间内不同时间点的浓度；和 [0036] (ii)将该化合物施加到第二皮肤外植体的角质层，使用开放式微灌注(OFM)确定第二皮肤外植体的真皮下层和皮下层中的化合物在一段时间内不同时间点的浓度。 [0037] (iii)组合(i)和(ii)中确定的浓度，以生成在皮肤外植体的真皮上层、真皮下层和皮下层中化合物的浓度随时间变化的时间分辨曲线。 [0038] 步骤(i)和(ii)可以按任何顺序进行，例如依次或并行进行。 [0039] 在一些实施方案中，该化合物是双氯芬酸或其盐。具体而言，该化合物是双氯芬酸钠或双氯芬酸二乙铵。 [0040] 在本发明的第三方面，提供了用于比较赋形剂对化合物扩散到皮肤的影响的体外方法，包括： [0041] (i)将包含该化合物的第一制剂施加到皮肤外植体的角质层，使用扩散池(DC)确定皮肤外植体的真皮上层内的化合物在一段时间内不同时间点的浓度； [0042] (ii)将包含该化合物的第一制剂施加到皮肤外植体的角质层，使用开放式微灌注(OFM)确定皮肤外植体的真皮下层和皮下组织中的化合物在一段时间内不同时间点的浓度； [0043] (iii)将包含该化合物的第二制剂施加到皮肤外植体的角质层，使用扩散池(DC)确定皮肤外植体的真皮上层内的化合物在一段时间内不同时间点的浓度； [0044] (iv)将包含该化合物的第二制剂施加到皮肤外植体的角质层，使用开放式微灌注(OFM)确定皮肤外植体的真皮下层和皮下组织中的化合物在一段时间内不同时间点的浓度； [0045] (v)组合(i)和(ii)中确定的浓度，以生成在皮肤外植体的真皮上层、真皮下层和皮下组织中化合物的浓度随时间变化的第一时间分辨曲线； [0046] (vi)组合(iii)和(iv)中确定的浓度，以生成在皮肤外植体的真皮上层、真皮下层和皮下组织中化合物的浓度随时间变化的第二时间分辨曲线；和 [0047] (vii)比较第一和第二时间分辨曲线； [0048] 其中步骤(i)、(ii)、(iii)和(iv)以任何顺序(依次或并行)进行，步骤(v)在步骤(i)和(ii)均完成后进行，步骤(vi)在步骤(iii)和(iv)均完成后进行，并且其中步骤(vii)在步骤(v)和(vi)完成后进行。 [0049] 在一些实施方案中，第一和第二制剂包含不同的赋形剂。在一些实施方案中，第一和第二制剂包含不同量或浓度的相同赋形剂。 [0050] 在某些实施方案中，该方法是用于确定生物等效性的体外方法，其中该化合物是API，并且其中第一或第二制剂之一是包含API的局部用制剂，而第一或第二制剂中的另一个是包含API的测试制剂。 [0051] 在本发明的第四方面，提供了确定包含化合物的第一制剂和包含该化合物的第二制剂的生物等效性的方法，该方法包括： [0052] (i)生成用于第一制剂的皮肤外植体的真皮上层、真皮下层和皮下组织中化合物浓度数据随时间变化的时间分辨曲线，其中浓度数据是使用Franz扩散池和开放式微灌注从体外采集的样本中获得的； [0053] (ii)生成用于第二制剂的皮肤外植体的真皮上层、真皮下层和皮下组织中化合物浓度数据随时间变化的时间分辨曲线，其中浓度数据是使用Franz扩散池和开放式微灌注从体外采集的样本中获得的；和 [0054] (iii)比较第一和第二时间分辨曲线来确定生物等效性。 [0055] 具体地，第一制剂包含化合物(例如API)和至少一种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。具体地，第二制剂包含化合物(例如API)和至少一种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。具体地，第一和第二制剂包含相同的化合物，例如相同的API。具体地，使用第一、第二或第三方面的体外方法生成浓度数据。 附图说明 [0056] 图1：用于研究OFM采样对双氯芬酸的皮肤浓度梯度的影响的实验装置示意图。该图不按比例绘制，并且未显示所分析组织堆叠(stack)的确切数量。 [0057] 图2：(A)用于研究皮肤和脂肪组织中双氯芬酸相对回收率的实验装置示意图；(B)收集标准对照OFM样本(稀释的间隙液体(ISF))和OFM再循环样本(未稀释的ISF)的时间表。 [0058] 图3：用于研究真皮和皮下组织中时间分辨的双氯芬酸浓度的实验装置示意图。 [0059] 图4：DDEA和DNa的相对浓度(空心圆)与通过(A)OFM探针和(B)OFM管的再循环时间的关系。在t=0和6小时时测量提供流入溶液的容器(A中的注射器或B中的Eppendorf®小瓶)中的浓度，并以实心圆显示。数据报告为在t=0小时测量的流入双氯芬酸浓度的平均值±SD百分比(对于OFM探针和管为n=6，并且对于注射器和Eppendorf®小瓶为n=2)。 [0060] 图5：在有OFM采样(虚线)和无OFM采样(实线)的情况下，皮肤堆叠中的双氯芬酸浓度与深度的关系。数据表示使用两个皮肤捐赠者测量的浓度的几何平均值(分别以灰色和黑色表示捐赠者1和2)。对于捐赠者1，提交或未提交OFM采样的堆叠数量分别为两个和三个，对于捐赠者2，提交或未提交OFM采样的堆叠数量分别为四个和四个。 [0061] 图6：在标准采样模式下运行并用于对照(灰线)和再循环(黑圈)的OFM探针中的双氯芬酸浓度与真皮(A)和皮下组织(B)中ISF收集时间的关系。数据代表各个测量值的几何平均值(在真皮和皮下组织中，对于对照为n=4，对于再循环为n=8)。REC(显示为菱形)表示在采样期结束时(真皮中24小时，皮下组织中28小时)在用于再循环的探针(在真皮和皮下组织中为n=8)中测得的几何平均浓度。 [0062] 图7：施加制剂D(图7(a))、制剂B(图7(b))和制剂F(图7(c))后，通过FDC测量的双氯芬酸累积渗透的时间分辨曲线(左轴，菱形)和在真皮(圆圈)和皮下组织(三角形)中通过OFM测量的ISF浓度的时间分辨曲线(右轴)。符号代表各个测量值的几何平均值(对于FDC，制剂D和F为n=12，制剂B为n=10；对于OFM，制剂B和D为n=12，制剂F为n=10)，线条仅供参考。 图例中的数字表示样本采集的平均深度(对于FDC，对应于平均皮肤厚度，对于OFM‑对应于探针位置)。 [0063] 图8：说明了所提出的双氯芬酸多室模型的示意图。右侧的草图显示了通过联合应用FDC和OFM探测的皮肤层，左侧的示意图是通过FDC(顶部)和OFM真皮(中间)和皮下(底部)ISF采样观察到的时间进程。请注意，表皮和真皮以不同的填充图案显示。 [0064] 图9：根据等式2使用各个重复的几何平均值计算九种研究制剂的真皮上层和真皮下层(A)之间以及真皮下层和皮下组织(B)之间的驱动梯度nAUC。对于FDC数据，制剂D、F、G、H和I的n=12，制剂A、B、C和E的n=10。对于OFM数据，除F(其中n=10)外，所有制剂的n=12。 [0065] 图10：计算九种研究制剂到达真皮下层(A)和到达皮下组织下方软组织(B)的驱动梯度，作为FDC累积吸收(A)和OFM皮下ISF浓度(B)的各个时间进程的几何平均值的AUC。对于FDC数据，制剂D、F、G、H和I的n=12，制剂A、B、C和E的n=10。对于OFM数据，除F(其中n=10)外，所有制剂的n=12。 发明详述 [0066] 用于皮肤的局部用制剂可用于化妆品应用或用于API的透皮给药。API的透皮给药可能具有多种优势，包括避免首过代谢、避免胃肠道吸收以及将API靶向到身体的特定部位。然而，尽管有这些优势，配制用于API透皮给药的局部用制剂并不总是那么简单。 [0067] 从结构上看，皮肤由多层组成。最外层是表皮。这是相对较薄的层，其最外层表面称为角质层，由充满角蛋白的扁平死细胞组成。角质层具有高度不渗透性，可作为屏障。表皮下面是真皮层，其包括真皮上层和真皮下层。真皮层下面是皮下层，也称为皮下组织或下皮组织。 [0068] 为了将化合物以足够的浓度输送到皮肤或透过皮肤，通常需要使用减少或克服皮肤屏障作用的制剂。 [0069] 发明人发现通过组合使用体外开放式微灌注和扩散池装置(特别是Franz扩散池(FDC))获得的数据，可以生成化合物通过皮肤的被动扩散的时间分辨渗透曲线。该组合的数据首次提供了化合物穿过皮肤屏障以及穿过皮肤的表皮、真皮上层、真皮下层和皮下层的完整的渗透和扩散图。本发明的方法可用于识别改善或增强皮肤渗透和扩散的赋形剂和其他成分，从而能够通过可靠的选择直接比较和优化开发过程中的早期候选配方，仅对那些表现出增强的通过所有皮肤层的被动扩散的制剂候选物进行改进。 [0070] 本发明方法得出的实验数据还大大提高了支持局部用产品生物等效性研究的机械PBPK模型所需的稳健性和应用范围。令人惊讶的是，虽然这些方法可靠、简单且经济实惠，但它们之前从未被组合使用过。 [0071] 因此，提供了评估化合物向皮肤扩散的体外方法，其包括： [0072] (i)将该化合物施加到第一皮肤外植体的表面上，使用扩散池(DC)确定第一皮肤外植体中的化合物的浓度；和 [0073] (ii)将该化合物施加到第二皮肤外植体的表面上，使用开放式微灌注(OFM)确定第二皮肤外植体中的化合物的浓度。 [0074] 化合物可以是任何活性药物成分(API)。具体而言，化合物是包含该化合物和至少一种药学上可接受的载体的组合物的一部分。更具体地说，化合物是配制用于局部应用的组合物的一部分。“局部用制剂”是指可以应用于受试者皮肤外表面的组合物。作为非限制性实例，此类制剂包括乳剂、软膏、乳霜、糊剂、凝胶和洗剂。 [0075] 本文所用的术语“皮肤外植体”是指，例如通过手术切除，从合适的哺乳动物获得的一块离体皮肤组织。对于DC(特别是FDC)，皮肤外植体至少包括表皮和真皮上层。对于OFM，皮肤外植体包括表皮、真皮(上层和下层)和皮下层。合适的哺乳动物可以是小鼠、豚鼠、大鼠、兔子、狗、猫、猪、牛、绵羊、山羊、马或人类。特别地，合适的哺乳动物是人类。更具体地说，皮肤外植体是人类皮肤外植体。为避免疑问，本发明的方法是使用离体皮肤外植体的体外方法。 [0076] 待测试化合物或包含该待测试化合物的制剂可以以任何合适的剂量施加到皮肤外植体的表面。具体地，待测试化合物或包含该待该测试化合物的制剂以合适的剂量施加到皮肤外植体的角质层。在一些实施方案中，该化合物为双氯芬酸或其盐。具体地，该化合物为双氯芬酸钠或双氯芬酸二乙铵。 [0077] 在一些实施方案中，合适的剂量(每平方厘米皮肤外植体的制剂量)可以是1mg/ 2 2 2 2 2 2 2 cm 至100mg/cm，特别是1mg/cm 至50mg/cm，更特别是1mg/cm 至25mg/cm ，例如1mg/cm 、 2 2 2 2 5mg/cm、10mg/cm、15mg/cm或20mg/cm。 [0078] 在一些实施方案中，合适的剂量(每平方厘米皮肤外植体的制剂量)可以是1uL/ 2 2 2 2 2 2 2 cm 至100uL/cm，特别是1uL/cm 至50uL/cm，更特别是1uL/cm 至25uL/cm ，例如1uL/cm 、 2 2 2 2 5uL/cm、10uL/cm、15uL/cm或20uL/cm。 [0079] 在一些实施方案中，合适的剂量(每平方厘米皮肤外植体中化合物的量)可以是 2 2 2 2 2 2 0.1mg/cm至100mg/cm ，特别是0.1mg/cm至50mg/cm ，更特别是0.1mg/cm至25mg/cm ，例如 2 2 2 2 2 2 2 2 0.1mg/cm、0.2mg/cm、0.3mg/cm、0.4mg/cm、0.5mg/cm、0.6mg/cm 、0.7mg/cm 、0.8mg/cm、 2 2 0.9mg/cm或1mg/cm。 [0080] 开放式微灌注 [0081] 开放式微灌注(OFM)是本领域已知的采样方法(例如参见WO/2007/131780)。OFM探针包括由柔性生物相容性不透明材料制成的管，该管具有中央部分，该中央部分具有肉眼可见的开口，在使用中，允许组织和探针内循环的灌注液之间进行物质交换。 [0082] 本发明利用体外OFM从皮肤外植体的间质液(ISF)中连续采样分析物。 [0083] 简而言之，将至少一个OFM探针插入皮肤外植体中，与表皮层平行。OFM探针用溶液(灌注液)例如生理溶液如电解质溶液灌注。优选地，灌注液含有1%HSA。 [0084] 皮肤外植体包括至少一个测试点。本文所用的术语“测试点”是指皮肤外植体上的一个特定位置，在该位置上施加待测试化合物或制剂，并且在该位置内插入至少一个OFM探针以进行采样。第一皮肤外植体可以包括一个以上的测试点，例如两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个测试点。 [0085] 在本发明的方法中，将至少一个OFM探针插入皮肤外植体的真皮下层内和/或皮肤外植体的皮下层内。优选地，将至少一个OFM探针插入真皮下层内，并将至少一个OFM探针插入皮下组织，因此测试位点包括至少两个与角质层表面距离不同的OFM探针。测试位点可以包括两个以上的OFM探针，例如四个OFM探针。在某些实施方案中，每个测试位点包括四个OFM探针，两个位于真皮内特别是真皮下层内，并且两个位于皮下组织内。在某些实施方案中，每个测试位点包括四个OFM探针，交替置于真皮内，特别是真皮下层内和皮下组织中。 [0086] 采样前，可冲洗OFM探针以去除血液。采样从用流速为0.1至10μL/min的灌注液灌注每个OFM探针开始。特别地，流速为1µL/min。 [0087] 可以在施用待测试化合物或包含待测试化合物的制剂之后的固定时间点(时间=0小时或T=0)对来自真皮和皮下组织的间质液(ISF)进行OFM采样。例如，可以每30分钟采集一次样本，例如在T=0、T=0.5、T=1.0、T=1.5、T=2.0、T=2.5等。可以每小时采集一次样本，例如在T=0、T=1.0、T=2.0、T=3.0、T=4.0、T=5.0等。具体而言，每个样本在采样期间连续采集。 例如，第一个采样周期可能从T=0开始，并在T=1.0收集结束，第二个采样周期可能从T=1.0开始，并在T=2.0收集结束，第三个采样周期可能从T=2.0开始，并在T=3.0收集结束，等等。 在每个采样周期之后，移除样本瓶并将新样本瓶连接到每个OFM探针。合适的采样周期包括 30分钟或1小时(60分钟)。30分钟的采样周期提供30分钟的时间分辨率。1小时的采样周期提供1小时的时间分辨率。 [0088] 样本采集的持续时间可称为实验持续时间。实验持续时间可为30分钟至24小时或更长。在一些实施方案中，实验持续时间为12小时。在一些实施方案中，实验持续时间为24小时。在特定实施方案中，实验持续时间为24小时，样本以一小时的时间分辨率连续采集。 [0089] 在实验结束时，可以测量每个OFM探针的深度。 [0090] 收集的样本可以储存在例如‑20°C或‑80°C的温度。 [0091] 扩散池 [0092] 扩散池例如Franz扩散池(FDC)在本领域中是已知的(参见例如US5547351或US5198109)，用于测量皮肤渗透和扩散。简而言之，扩散池包括供体隔间和接收隔间，它们由膜或皮肤外植体彼此隔开。每个隔间的温度都可以控制。皮肤外植体放置在膜上或固定在供体室和接收室之间，角质层朝上。将待测试化合物或待测试制剂施加到角质层上。接收室包含与皮肤外植体的膜和基底接触的溶液。溶液的温度受控，并且例如使用磁力搅拌器进行搅拌。待测试化合物可以通过皮肤外植体扩散到接收室中的溶液中。可以使用微量移液器或注射器通过采样口从接收室中取出溶液样本。该方法的此步骤可按照经济合作与发展组织(OECD)测试指南第428号(2004年)中针对皮肤渗透研究和随附的OECD指导文件第28号中提供的方法进行。 [0093] 本发明使用体外扩散室连续从皮肤外植体中采样分析物。扩散室优选为Franz扩散室。更优选地，扩散室为静态Franz扩散室。在一些实施方案中，Franz扩散室为静态Franz扩散室，其具有5mL体积的受体室。在一些实施方案中，Franz扩散室为静态Franz扩散室，其具有10mL体积的受体室。 [0094] 用于DC(特别是FDC)的皮肤外植体仅包括表皮层和真皮上层。皮肤外植体可以是分厚皮肤外植体，例如用电动切皮机将皮肤切开至200μm至400μm的深度来制备。特别是用于DC(特别是FDC)的皮肤外植体包括表皮层和真皮上层，但不包括真皮下层或皮下组织。 [0095] 优选地，皮肤外植体具有至少4kΩ(例如4kΩ或更大，例如5kΩ或更大、6kΩ或更大、7kΩ或更大、8kΩ或更大、9kΩ或更大、10kΩ或更大)的电阻，如通过电阻屏障完整性评估所测量的。 [0096] 皮肤外植体可具有0.5cm2至约3.5cm2(例如约0.64cm2或约3.14cm2)的皮肤表面积。 [0097] 具体地，所述受体室内装有受体溶液。具体地，所述受体溶液为磷酸盐缓冲盐溶液，更具体地为含有牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲盐溶液，更具体地为含有5％w/v牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲盐溶液。 [0098] 采样是通过从受体室中取出一定体积的受体溶液并用新鲜的受体溶液补充受体室来进行的。样本体积可以是任何合适的体积。合适的体积包括从50µL至500µL的体积，例如50µL、100µL、150µL、200µL、250µL、300µL或350µL。在某些实施方案中，样本体积为300µL。 [0099] 可以在施加待测试化合物或包含待测试化合物的制剂之后的固定时间点对受体溶液进行采样(时间=0小时或T=0)。 [0100] 例如，可以每30分钟例如在T=0、T=0.5、T=1.0、T=1.5、T=2.0、T=2.5等时收集一次样本。可以每小时例如在T=0、T=1.0、T=2.0、T=3.0、T=4.0、T=5.0等时收集一次样本。在一些实施方案中，在T=0、T=2、T=4、T=8、T=16和T=24时收集样本。 [0101] 实验持续时间可为30分钟至24小时，或更长。在一些实施方案中，实验持续时间为 12小时。在一些实施方案中，实验持续时间为24小时。在具体实施方案中，实验持续时间为 24小时，并在T=0、T=2、T=4、T=8、T=16和T=24时收集样本。 [0102] 收集的样本可以储存在例如‑20°C或‑80°C的温度。 [0103] 样本分析 [0104] 该方法的步骤包括确定各个皮肤外植体中化合物的浓度。分析使用OFM和DC(特别是FDC)生成的样本，以提供待测试化合物的定量数据，特别是确定待测试化合物的浓度数据。 [0105] 可以使用适合分析待测试化合物的方法来分析样本。作为非限制性实例，合适的方法包括质谱法(MS)、液相色谱法(LC)例如高效液相色谱法(HPLC)。本领域技术人员将能够针对感兴趣的化合物选择适当的分析方法。 [0106] 在本发明的一些实施方案中，OFM样本可使用质谱法(例如与HPLC系统联用的质谱仪)进行分析。在更具体的实施方案中，OFM样本可使用配备有加热电喷雾电离源的与Thermo U3000 HPLC系统联用的Thermo LTQ Orbitrap XL质谱仪进行分析。 [0107] 在本发明的一些实施方案中，可以使用液相色谱法和/或质谱法例如使用液相色谱‑串联质谱法(LC MS/MS)来分析受体溶液样本。 [0108] 优选地，定量数据用于生成待测试化合物的浓度的时间分辨曲线。该时间分辨曲线显示在皮肤外植体中的多个位置待测试化合物的浓度随时间的变化。具体而言，OFM和FDC生成的定量数据相组合，以提供在皮肤外植体的真皮上层、真皮下层和皮下层中的待测试化合物的浓度随时间变化的时间分辨曲线。 [0109] 因此，评估化合物扩散到皮肤的体外方法可以包括： [0110] (i)将该化合物施加到第一皮肤外植体的角质层，使用扩散池(DC)确定第一皮肤外植体中的化合物在一段时间内不同时间点的浓度；和 [0111] (ii)将该化合物施加到第二皮肤外植体的角质层，使用开放式微灌注(OFM)确定第二皮肤外植体中的化合物在一段时间内不同时间点的浓度。 [0112] (iii)组合(i)和(ii)中确定的浓度，以生成皮肤外植体中化合物浓度随时间变化的时间分辨曲线。 [0113] 步骤(i)和(ii)可以按任何顺序进行，例如依次或并行进行。 [0114] 在一些实施方案中，评估化合物扩散到皮肤中的体外方法包括： [0115] (i)将该化合物施加到第一皮肤外植体的角质层，使用扩散池(DC)确定第一皮肤外植体的真皮上层内的化合物在一段时间内不同时间点的浓度；和 [0116] (ii)将该化合物施加到第二皮肤外植体的角质层，使用开放式微灌注(OFM)确定第二皮肤外植体的真皮下层和皮下组织中的化合物在一段时间内不同时间点的浓度。 [0117] (iii)组合(i)和(ii)中确定的浓度，以生成皮肤外植体的真皮上层、真皮下层和皮下组织中化合物浓度随时间变化的时间分辨曲线。 [0118] 同样，步骤(i)和(ii)可以按任何顺序进行，例如依次或并行进行。 [0119] 在一些实施方案中，该方法是用于比较赋形剂对化合物扩散到皮肤的影响的体外方法，包括： [0120] (i)将包含该化合物的第一制剂施加到皮肤外植体的角质层，使用扩散池(DC)确定皮肤外植体的真皮上层内的化合物在一段时间内不同时间点的浓度； [0121] (ii)将包含该化合物的第一制剂施加到皮肤外植体的角质层，使用开放式微灌注(OFM)确定皮肤外植体的真皮下层和皮下组织中的化合物在一段时间内不同时间点的浓度； [0122] (iii)将包含该化合物的第二制剂施加到皮肤外植体的角质层，使用扩散池(DC)确定皮肤外植体的真皮上层内的化合物在一段时间内不同时间点的浓度； [0123] (iv)将包含该化合物的第二制剂施加到皮肤外植体的角质层，使用开放式微灌注(OFM)确定皮肤外植体的真皮下层和皮下组织中的化合物在一段时间内不同时间点的浓度； [0124] (v)组合(i)和(ii)中确定的浓度，以生成皮肤外植体的真皮上层、真皮下层和皮下组织中化合物浓度随时间变化的第一时间分辨曲线； [0125] (vi)组合(ii)和(iii)中确定的浓度，以生成皮肤外植体的真皮上层、真皮下层和皮下组织中化合物浓度随时间变化的第二时间分辨曲线；以及 [0126] (vii)比较第一和第二时间分辨曲线。 [0127] 本领域技术人员将理解，步骤(i)、(ii)、(iii)和(iv)可以按任意顺序(例如依次或并行)进行。步骤(v)和(vi)可以按任意顺序进行，可以依次进行，也可以并行进行，条件是步骤(v)在步骤(i)和(ii)均完成后进行，步骤(vi)在步骤(iii)和(iv)均完成后进行。步骤(vii)在步骤(v)和(vi)完成后进行。 [0128] 在一些实施方案中，该方法是比较生物等效性的体外方法，包括： [0129] (i)将包含API的局部用制剂施加到皮肤外植体的角质层，使用扩散池(DC)确定皮肤外植体的真皮上层内的API在一段时间内不同时间点的浓度； [0130] (ii)将包含API的局部用制剂施加到皮肤外植体的角质层，使用开放式微灌注(OFM)确定皮肤外植体的真皮下层和皮下组织内的API在一段时间内不同时间点的浓度； [0131] (iii)将包含API的测试制剂施加到皮肤外植体的角质层，使用扩散池(DC)确定皮肤外植体的真皮上层内的API在一段时间内不同时间点的浓度； [0132] (iv)将包含API的测试制剂施加到皮肤外植体的角质层，使用开放式微灌注(OFM)确定皮肤外植体的真皮下层和皮下组织内的API在一段时间内不同时间点的浓度； [0133] (v)组合(i)和(ii)中确定的浓度，以生成皮肤外植体的真皮上层、真皮下层和皮下组织中的API浓度随时间变化的第一时间分辨曲线； [0134] (vi)组合(ii)和(iii)中确定的浓度，以生成皮肤外植体的真皮上层、真皮下层和皮下组织中的API浓度随时间变化的第二时间分辨曲线；和 [0135] (vii)比较第一和第二时间分辨曲线来确定生物等效性。 [0136] 本领域技术人员将理解，步骤(i)、(ii)、(iii)和(iv)可以以任何顺序(例如依次或并行)进行。步骤(v)和(vi)可以以任何顺序进行，可以依次进行，也可以并行进行，条件是步骤(v)在步骤(i)和(ii)均完成后进行，步骤(vi)在步骤(iii)和(iv)均完成后进行。步骤(vii)在步骤(v)和(vi)完成后进行。 [0137] 在一些实施方案中，该方法是比较生物等效性的体外方法，包括： [0138] (i)将多个皮肤外植体的真皮上层、真皮下层和皮下组织中API浓度随时间变化的数据进行组合，以生成API浓度的第一时间分辨曲线，其中该数据是使用包含API的局部用制剂由OFM和FDC采样生成的； [0139] (ii)将多个皮肤外植体的真皮上层、真皮下层和皮下组织中API浓度随时间变化的数据进行组合，以生成API浓度的第二时间分辨曲线，其中该数据是使用包含API的测试制剂由OFM和FDC采样生成的；和 [0140] (iii)比较第一和第二时间分辨曲线来确定生物等效性。 [0141] 本发明还提供了用于评估化合物向皮肤中扩散的系统，该系统包括：Franz扩散池(其包括供体隔间和接收隔间)和具有表皮层和真皮上层的第一皮肤外植体(其中皮肤外植体位于供体隔间和接收隔间之间)，以及开放式微灌注(OFM)系统和具有表皮层、真皮上层、真皮下层和皮下层的第二皮肤外植体，其中OFM系统包括第一OFM探针和第二OFM探针，所述第二OFM探针植入到与表皮层基本平行的第二皮肤外植体内。 [0142] 具体地，第一OFM探针位于第二皮肤外植体的真皮下层内，并且第二OFM探针位于第二皮肤外植体的皮下层内。 [0143] 通用 [0144] 术语“包含”涵盖“包括”，例如“包含”X的组合物可以包括一些额外的物质，例如X + Y。在一些实施方案中，术语“包含”指包括指示的活性剂，例如所述化合物，以及包括消费者健康行业已知且普遍认为安全(GRAS)的其它活性剂、载体、赋形剂、润肤剂、稳定剂等。使用过渡短语“基本上由……组成”意味着权利要求的范围应解释为涵盖权利要求中所述的特定材料或步骤，以及那些不会对所要求保护的发明的基本特征和新颖特征产生实质性影响的材料或步骤。参见In re Herz , 537 F.2d 549, 551‑52, 190 USPQ 461, 463 (CCPA 1976) (原文强调)；还参见MPEP § 2111.03。因此，当在本发明的权利要求中使用术语“基本上由……组成”时，不应将其解释为等同于“包含”。术语“由……组成”及其变体表示包括并限于(例如具体列举的成分或步骤)。在某些领域，可以使用术语“包含由……组成的活性成分”来代替“基本上由……组成”。与数值x相关的术语“约”是可选的，例如表示该数值可能包含所述数字的一些方差(variance)，以允许常规实验波动、测量方差或包含可能实现与所述数字基本相同结果的微小偏差，例如x±10%、x±5%、x±4%、x±3%、x±2%或x±1%。单词“基本上”不排除“完全”，例如“基本上不含”Y的组合物可能完全不含Y。必要时，可以从本发明的定义中省略单词“基本上”。除非另有说明，本文中使用的所有百分比和比例均按总组合物的重量计算。 [0145] 本专利说明书中引用的所有参考文献或专利申请均以引用的方式并入本文中。 [0146] 为了更好地理解本发明，下面列举实施例。这些实施例仅用于说明目的，不应理解为以任何方式限制本发明的范围。 实施例 [0147] 实施例1 [0148] 共制备了九种测试制剂，给药率和方案如表1所示。 [0149] [0150] 表1. 测试制剂及其相关给药率和方案。 [0151] 为了进行测试，使用正排量移液器将制剂均匀施加在离体皮肤外植体的角质层(SC)表面。 [0152] OFM研究中使用的人体皮肤外植体 [0153] 新鲜的人体皮肤外植体由奥地利格拉茨医科大学生物库提供。皮肤由格拉茨医科大学整形、美容和重建外科部接受腹部整形手术的28至63岁男性和女性患者捐赠。捐赠者提供了书面知情同意书，该研究已获得格拉茨医科大学伦理委员会批准，批准号为EC编号 28‑151 ex 15/16。用纱布拭子和纯净水清洁人体皮肤外植体，然后在‑20°C冷冻保存。 [0154] 在气候室中，在皮肤外植体适应之前和之后，通过使用Aquaflux仪器(AF200, Biox Ltd., 英国)对所有施加部位进行跨表皮失水屏障完整性评估。所有样本均达到了预 2 先定义的12 gm h的截止值。 [0155] 在研究开始前，将皮肤外植体在室温解冻12小时。将它们固定在用医用衬垫(MoliNea N, Paul Hartmann AG, 奥地利)包裹的挤塑聚苯乙烯板上，并在使用前置于气候室(32 °C / 40–60%相对湿度)中1小时。在整个实验过程中，气候室内的环境温度和环境相对湿度用集成温度传感器和相对湿度传感器的数据记录器(175 H1温度和湿度数据记录器, Testo, 德国)控制。 [0156] FDC研究中使用的分厚人体皮肤 [0157] 从NHS GG&C Bio‑Repository, Glasgow (四个样本)、St John's Hospital, Livingston, NHS Lothian (一个样本)和Tissue Solutions Ltd. , Glasgow, UK (两个样本)的31至64岁女性捐献者那里获取了七个全厚人体腹部皮肤样本。将皮肤储存在冰箱中，温度设置为维持在‑20°C。患者完全同意使用他们的组织，所有供应商都遵循当地伦理批准收集组织。使用电动切皮机将皮肤切割至200‑400µm的深度，以制备分厚皮肤。 [0158] 实施例2：开放式微灌注(OFM) [0159] 双氯芬酸在OFM探针和管道上的非特异性吸附 [0160] 测试了双氯芬酸二乙胺盐(DDEA)和双氯芬酸钠盐(DNa)的两种测试溶液。它们包括1%人血清白蛋白(HSA; Albunorm ® , Octapharma ,奥地利)的电解质溶液(ELO‑MEL ‑1 isotone, Fresenius Kabi , 奥地利)和1 µg mL DDEA或DNa。 [0161] 对于每种测试溶液，对六个OFM出口部分(OFM‑P0X‑15的一半，JR‑HEALTH，奥地利)和六个OFM管道部分(OFM‑PS3‑75，JR‑HEALTH，奥地利)进行为期6小时的测试。每隔1小时收® 集一次样本。注射器和Eppendorf 小瓶分别用于将测试溶液输送到OFM出口部分和管道。在® 实验开始(t=0小时)和结束(t=6小时)时从注射器和Eppendorf 小瓶中采样，以确定进入® OFM探针和管道的浓度。使用前，用每种测试溶液涂覆注射器、加药针、Eppendorf 小瓶和移液器吸头。为了涂覆，将样本倒入测试溶液并在室温保存30分钟。之后，丢弃涂覆测试溶液。 移液器吸头经过三次填充和排空测试溶液的循环。将移液器吸头的第四次填充用作样本。 通过比较流入和流出的浓度来评估吸附效果。 [0162] OFM采样 [0163] 将套管(Sterican 20G, B.Braun, 德国)插入皮肤外植体的真皮和皮下组织。将OFM探针(OFM‑P0X‑15, JR‑HEALTH, 奥地利)推入套管。然后，移除套管，用氰基丙烯酸酯(Cyanolit 241 F, Panacol‑Elosol GmbH, 德国)将探针固定在皮肤上。 [0164] 将推拉管(OFM‑PS3‑75, JR‑HEALTH, 奥地利)安装到OFM泵(MPP102, JR‑HEALTH, 奥地利)中，并连接到OFM探针和灌注液袋(OFM – BAG 10 mL, JR‑HEALTH, 奥地利)。灌注液袋中充满了含有1%HSA(Albunorm®)的电解质溶液(ELO‑MEL isotone, Fresenius Kabi, 奥地利)。冲洗OFM探针以去除血液，并通过连接采样瓶(0.2 mL PCR管, MAXYMUM ‑1 Recovery)以1 µL min 的流速开始采样。每一次1小时采样时间段后，将满样本瓶储存在‑ 20°C下，并将新瓶连接到OFM探针。以1小时的时间分辨率连续采集24小时的样本。实验结束时，所有样本均储存在‑80°C。 [0165] OFM采样对皮肤内双氯芬酸浓度梯度的影响 [0166] 该研究是在两名捐赠者的解冻人体皮肤外植体上进行的。捐赠者1的外植体包含5个施加部位：3个用于OFM采样，2个未使用。捐赠者2的外植体包含8个施加部位：4个用于OFM‑2 采样，4个未使用。将制剂A以10 mg cm 的剂量施加于所有施加部位。每个施加部位使用3个OFM探针进行24小时的皮肤OFM采样。24小时后，测量OFM探针的深度并从所有施加部位收集活检样本进行皮肤冷冻切片。在OFM采样结束时，使用配备22 MHz传感器的高频US LOGIQ e R6 (GE Healthcare, 英国)和US透射凝胶(Aquasonic 100，Parker Laboratories Inc.，美国)测量OFM探针的深度。探针的平均深度是通过将皮肤表面和OFM探针上侧之间的面积除以超声(US)图像长度来计算的。 [0167] 对于皮肤冷冻切片，使用胶带剥离法去除残留的局部测试产品。每个施加部位使用十条胶带(Leukoplast Waterproof，BSN medical，德国)进行胶带剥离。随后，用氰基丙烯酸酯(Cyanolit 732F, Panacol, 德国)将铝盘(直径30 mm，JR‑HEALTH)粘在皮肤上。用一次性手术刀切除皮肤。将附有皮肤的圆盘在 ‑20°C冷冻，然后转移到‑80°C储存。 [0168] 使用冷冻切片机(Cryostat‑Microtome HM560M, Microm)将皮肤从内层皮肤层向表层皮肤层切成与皮肤表面平行的薄片(图1)。切片从皮肤表面以下1.5 mm深度开始，切片厚度为25 µm。每对连续切片都存放在同一个冷冻管(CryoPure 1.8 mL, Sarstedt, 德国)中，从而得到一个覆盖深度为50 µm的样本。将样本在‑80°C储存直至进行生物分析。每隔一个样本测量一次双氯芬酸浓度，最终的空间分辨率为100 µm。 [0169] 回收率的测定(OFM稀释倍数) [0170] 使用来自两名捐赠者的皮肤外植体，在8个施加部位以10 mg cm ‑2的剂量施加制剂A(图2)。每个外植体的两个部位用于采集真皮样本，两个部位用于采集皮下组织样本。在每个施加部位放置三个OFM探针，深度分别位于皮肤表面以下约0.8毫米和约3毫米处，以采集真皮和皮下组织中的ISF样本。 [0171] 每个施加部位的两个OFM探针(图2中用R表示)首先在标准OFM采样模式下运行，然后切换到再循环OFM模式。在再循环期间，灌注液在闭环中循环，直到分析物在灌注液和皮肤外植体的ISF之间达到平衡 。为了切换到再循环模式，停止OFM泵并连 ‑1 接OFM管以形成闭环。重新启动泵，并以1 µL min 的速度将灌注液泵入封闭的OFM系统内，持续10小时。该封闭系统包含30µL灌注液，10小时内进行了20次再循环。10小时后，打开封闭的管道系统，收集再循环样本。 [0172] 确定相对回收率的最佳时间段是在组织中分析物浓度稳定时。对于皮肤采样，在产品施加后14至24小时之间进行再循环OFM；皮下组织采样扩大到覆盖产品施加后18至28小时之间的时间段，以便在该皮肤深度实现适当的平衡。 [0173] 每个施加部位的第三个OFM探针(图2中用C表示)用于标准OFM采样，并提供稀释的ISF样本以用于浓度‑时间曲线。因此，它可作为对照，验证在再循环阶段是否达到了稳定的双氯芬酸浓度。 [0174] 通过OFM收集双氯芬酸浓度的时间分辨曲线 [0175] 该研究对六个外植体进行，每个外植体来自不同的捐赠者。每个皮肤外植体包含九个用于OFM采样的测试部位(图3)。每个测试部位包含四个OFM探针，交替放置在真皮和皮下组织中。OFM采样每小时进行一次，持续24小时，然后如上所述测量OFM探针的深度。仅在奇数样本(1小时、3小时、……、23小时)中分析双氯芬酸浓度。 [0176] OFM样本的生物分析 [0177] 使用配备加热电喷雾电离源的Thermo LTQ Orbitrap XL质谱仪与Thermo U3000 HPLC系统联用，对DDEA和DNa进行分析。质谱检测采用阴离子模式，在250‑400m/z范围内进‑1 行全扫描。使用双氯芬酸钠d6作为样本中双氯芬酸定量的内标。LLOQ为10 ng mL 。 [0178] OFM样本中加入内标物(双氯芬酸钠d6)和5%甲酸。然后将样本施加到HLB SPE (亲水亲脂平衡固相萃取)柱(Waters Ges.mbH，维也纳，奥地利)。洗涤后，用乙腈洗脱样本，并将其溶于30％乙腈中。 [0179] 实施例3：Franz扩散池 [0180] 该实验依据OECD皮肤渗透研究测试指南第428号(2004)及其随附的OECD指导文件第28号进行。 [0181] 将分厚皮肤安装在静态扩散池中。使用含有牛血清白蛋白(5%，w/v)的磷酸盐缓冲盐水作为受体流体。该受体流体通过超声脱气并在使用前储存在约4°C的温度。该受体室体 2 积通常为5mL，皮肤表面积为0.64cm(制剂D除外，其中对于制剂D，受体室体积为10mL，皮肤 2 表面积为3.14cm)。将扩散池放置在加热以维持皮肤表面温度为32±1°C的歧管中，受体流体体积达到预先校准的线。使用放置在受体室中的磁力搅拌器混合受体流体。在施加产品 2 之前进行了电阻屏障完整性评估；任何电阻低于10.9kΩ(对于0.64cm 池)或4kΩ(对于 2 3.14cm池)的皮肤样本将被排除在后续吸收测量之外。 [0182] 使用前，将含有双氯芬酸的研究制剂(见表1)储存在环境温度下。使用正排量移液器将它们均匀施加在皮肤的SC表面上，施加率和给药时间如表中所述。 [0183] 通过在0小时(给药前)、给药后2、4、8、16和24小时收集受体液体样本(300µL)来评估吸收情况。除了24小时收集外，每次取出受体液体后，用新鲜的受体液体溶液补充取出的受体液体体积(300µL)。在受体液体收集后24小时，拆除该池，并通过焚烧销毁皮肤样本。 [0184] 使用液相色谱‑串联质谱法(LC ‑MS/MS)，通过经验证的分析方法对受体流体样本‑1 进行分析。LLOQ为1 ng mL 。 [0185] 实施例3：数据分析和结果 [0186] 为了能够使用对数转换统计数据，在FDC和OFM数据集中，我们将BLOQ值估算为0.5 ‑1 ‑1 x LLOQ，即OFM为5 ng mL ，FDC为0.5 ng mL 。 [0187] OFM探针深度计算为针对每种制剂确定的12个探针深度的平均值，但制剂F的皮下探针除外；对于那些探针，平均探针深度是通过十个探针计算的，因为两个探针的位置与所有制剂中的位置有很大不同。 [0188] 在进一步分析之前，使用先前确定的稀释因子对OFM测量的ISF浓度进行回收率校正，并将其表示为每种制剂12个样本的几何平均值。只有制剂F的皮下ISF含量的数据集为n=10(见上文)。 [0189] 对于FDC数据集，收集自皮肤样本的数据，如果其对数转换的几何平均跨膜电阻(TEER)与平均值偏差± 2 x SD，则将被排除在进一步分析之外。对于制剂B，来自两个单独的FDC重复的数据不完整，也被排除在外。因此，制剂D、F、G、H和I的数据集为n=12，制剂A、B、C、E的数据集为n=10。 [0190] 双氯芬酸在OFM探针和管道上的非特异性吸附 [0191] 图4显示了含有1%BSA的DDEA和DNa浓缩溶液通过OFM探针(图4A)和管道(图4B)灌注6小时后回收的双氯芬酸浓度。它在整个期间保持稳定，说明DDEA和DNa没有吸附到OFM探针(单尾配对t‑检验“对照开始”到“1小时”：DEA p = 0.111, Na p = 0.061)或管道材料(单尾配对t‑检验“对照开始”到“1小时”：DEA p = 0.212, Na p = 0.422)上。此外，DDEA和DNa在实验期间在原液中保持稳定(数据未显示)。盐均未吸附到注射器上(单尾配对t‑检验® “原液”至“注射器起始”p=0.365)，也未吸附到用于流出物收集的Eppendorf 小瓶上，这可以从整个实验过程中保持的稳定浓度看出(图4中的实心圆圈)。 [0192] 这些数据证实，向灌注液中添加1%HSA的预防措施足以防止药物因OFM装置吸附而可能造成的回收损失。双氯芬酸表现出极高的蛋白质结合率(>99.8%)。选择蛋白质浓度来模拟皮肤和脂肪组织的ISF中的白蛋白浓度。还要记住的是，本测试中白蛋白与双氯芬酸的摩尔比相当低(DDEA和DNa分别为56：1和48：1)，旨在匹配OFM工作中预期的最坏情况，以及蛋白质提供多达9个结合位点的事实，体外人体皮肤研究期间吸附损失的风险可以被认为是极低的。 [0193] OFM采样对皮肤内双氯芬酸浓度梯度的影响 [0194] 本研究的这一部分旨在测试OFM探针引起的持续下沉情况是否会耗尽组织，从而影响局部施加后体外皮肤中双氯芬酸的药代动力学（PK）。我们分析了来自两个皮肤捐赠者的总共13个皮肤堆叠(stack)，覆盖深度为0.5‑1.5毫米。如果OFM采样影响了组织双氯芬酸浓度，则预计会观察到使用和不使用OFM采样测量的浓度之间的差异，在皮肤表面的浓度最小(其中浓度由制剂中的API释放及其通过SC的吸附决定)，在OFM探针放置的深度处或以下的浓度最大(平均深度为在皮肤表面以下0.97±0.25毫米)。 [0195] 图5显示了每个捐赠者的双氯芬酸浓度几何平均值随深度的变化。在有和没有OFM采样的情况下测得的浓度之间的最大差异出现在皮肤表面附近约0.5毫米处；在较深的组织中，差异减小。此外，OFM探针的存在不会导致浓度梯度斜率的变化。这些结果表明，观察到的双氯芬酸浓度差异是由于捐赠者皮肤的位点间差异造成的，而不是由于OFM采样造成的。显然，OFM采样不会扰乱皮肤内的药物浓度梯度。 [0196] 回收率的测定(OFM稀释倍数) [0197] 图6显示了用于对照和再循环的OFM探针中的双氯芬酸浓度与真皮(图6A)和皮下组织(图6B)中的ISF收集时间的关系。 [0198] 在真皮层中(图6A)，对照探针中的DNa浓度在产品施加后约12小时达到稳定水平。 专用于再循环的OFM探针中的DNa浓度显示出相同的时间进程，直到14小时，它们被切换到再循环模式以进行实验的剩余10小时。在实验结束时(24小时)，再循环探针中测得的浓度(显示为菱形)明显高于对照探针中的浓度。 [0199] 为了计算真皮中的稀释倍数，将再循环结束时(即在24小时时)再循环探针中的双氯芬酸浓度与再循环开始前(即产品施加后12至14小时的时间间隔内)同一探针中观察到的双氯芬酸浓度进行比较。当再循环开始前的药物浓度已达到稳定的平台期(满足此条件)时，可以使用此方法(图6A)。在这些条件下，再循环开始前测得的药物浓度对应于稀释的ISF浓度，而再循环样本中测得的药物浓度对应于未稀释的ISF浓度。两个值之间的比率得出平均相对回收率为7.2±1.6%(对应稀释倍数为13.9倍)。 [0200] 在皮下组织中(图6B)，所有探针(即在标准OFM模式下使用的探针，以及在产品施加后14至28小时之间切换到再循环模式的探针)测得的DNa浓度在产品施加后14小时内均低于定量下限(LLOQ)。在对照探针中，它在整个28小时的测量期内都没有达到稳定的平台‑1 期。在实验结束(28小时)时，再循环探针中测得的DNa浓度仅比对照探针高9 ng mL (与真皮中观察到的数量级差异相比)。 [0201] 皮下组织中观察到的浓度随时间变化过程无法计算回收率。用于再循环的探针和对照探针中的浓度均未达到稳定的平台期，而对照探针中的浓度在22至28小时之间显著增加。显然，即使将实验的总持续时间延长至28小时(真皮实验为24小时)，也不足以使皮下组织中采集的药物浓度在对照或再循环样本中达到平衡。因此，在后续数据处理中使用了针对真皮计算的稀释倍数；这种保守估计可以避免在后续研究中高估皮下组织中测得的双氯芬酸浓度。 [0202] 通过FDC和OFM测量的双氯芬酸浓度的时间分辨曲线 [0203] 图7显示了在施加三种不同定性和定量组成的局部用制剂(对应于表1中的制剂D、B和F)后，通过FDC和OFM分别测量的双氯芬酸累积渗透率和ISF浓度的24小时时间分辨曲线的代表性实例。如表中所示，它们的双氯芬酸盐及其浓度(在D中为4.64�EA，在B和F中为 2%DNa)和给药方案(对于D、B和F分别每天施加四次、两次和一次)也不同。然而，在FDC和OFM实验中，调整每次施加事件给药的制剂量以确保所有产品在24小时内输送的双氯芬酸总量相同，即每平方厘米0.4 mg双氯芬酸。 [0204] 正如上面强调的差异所预期的那样，这三种制剂在FDC中递送的时间进程非常不同，这与众所周知的整体制剂成分、特性和给药方案对双氯芬酸跨SC屏障递送的影响是一致的。通过OFM收集的时间进程也有很大差异，无论是在真皮层还是皮下组织中。这些数据清楚地表明，制剂的影响并不止于穿过皮肤屏障；它继续对药物在整个下层软组织的被动扩散和分布产生重大影响。 [0205] 还探讨了双氯芬酸递送到真皮和皮下组织的程度(由OFM测量)是否与跨SC递送到真皮上层(由FDC测量)相关。为了进行这种比较，双氯芬酸在真皮上层达到的深度近似于FDC中使用的皮肤样本厚度，并且在真皮下层和皮下组织达到的深度近似于OFM探针在这些层中的位置。使用两种体外方法测得的API量对应于在24小时时间点可用于被动扩散的那些API量和可用于全身吸收的那些API量之和。在实际使用条件下，API下游分布变得更加复杂，因为任何与组织结合或保留在组织内的API量最终都会释放，这些API量可能随着时间的推移而进一步重新分布，例如在重复使用产品或清洗后。 [0206] 对真皮下层和皮下组织中收集的时间进程特征(例如，滞后时间、达到的最大双氯芬酸浓度、斜率、平台期的存在)进行顶线目视检查表明，它们与使用FDC从相同产品测得的时间进程特征不匹配；三种制剂之间也有很大差异。这些数据表明，双氯芬酸通过真皮和皮下组织的被动扩散与其通过皮肤屏障(和真皮上层)的扩散无关，并且不能仅使用FDC数据进行预测。结果表明，体外OFM提供了有关可通过真皮下层和皮下组织被动扩散和全身吸收的API浓度的宝贵信息，补充了通过传统FDC获得的数据。 [0207] 开发了一种初步的多室方法，用于分析和比较双氯芬酸通过皮肤层的赋形剂依赖性被动扩散(图8)。其结构还包括深层真皮和皮下组织。 [0208] 双氯芬酸一旦穿过SC，就会依次进入真皮上层(和/或进入体循环)、真皮下层和皮下层。任何给定时间点的FDC受体液体浓度(对于给定的暴露区域)代表已达到真皮上层0.3毫米深度的药物量(由用于FDC的皮肤样本厚度确定)，FDC滞后时间对应于双氯芬酸首次到达此深度的时间点。 [0209] 类似地，施加后双氯芬酸首次出现在真皮下层所需的时间(图8中的D tF到D)是通过在OFM真皮探针中首次检测到双氯芬酸来估算的；到达真皮下层的扩散途径(图8中的D l F到D)是通过每个单独样本中FDC皮肤厚度和OFM真皮探针的位置之间的差异来估算的。同样，施加后双氯芬酸首次出现在皮下组织所需的时间(图8中的D t D到S)是通过在OFM皮下探针中首次检测到双氯芬酸来估算的；到达皮下组织的扩散途径(图8中的D l D到S)是通过每个单独样本中OFM真皮和皮下探针的位置之间的差异来估算的。双氯芬酸到达三个检测位置的被动扩散通量(分别为真皮上层、真皮下层和皮下组织的Q0、QD和QS)计算如下： [0210] 等式(1)： ， [0211] 其中D是扩散系数，K是分配系数， 是两个皮肤层之间的药物浓度变化， 是扩散途径长度。因此，对于给定的制剂， 是通过给定皮肤层(即在真皮上层和下层之间，以及在真皮下层和皮下组织之间)的驱动力。它可以计算为上层启动流入下层所需的AUC(由图8中时间进程中的虚线部分显示)，由 和 归一化(进一步表示为nAUC)，或： [0212] 等式(2)： 。 [0213] 众所周知，制剂组成主要通过影响SC来影响扩散通量Q0，并且相同API的D和K在不同制剂之间有所不同。然而，尽管关于这种影响的证据量相当大且在不断增加，但制剂组成对真皮和皮下组织中D和K(以及由此对Q D和Q S)的影响尚不十分清楚。目前尚不清楚给定的赋形剂组合是否会以类似或不同的方式影响API通过皮肤屏障、真皮和皮下组织的运输，或者对通过一层的运输的影响是否可以预测通过另一层的运输。 [0214] 通过比较所研究的九种制剂中上层启动流入相邻下层(即上层至真皮下层，以及下层至皮下组织)所需的归一化曲线下面积(nAUC)，我们可以探究这些问题。同一皮肤层中不同制剂之间的nAUC差异表明，该组成不仅影响跨SC的药物递送，还影响下游的药物递送； 同样地，不同皮肤层中制剂的不同排名表明，其组成对真皮和皮下组织的K和D的影响不同。 当然，这种方法只能用于比较制剂在最大程度地将API递送到不同皮肤层方面的排名，而不‑1 能用于比较使用这两种技术获得的数值：这种固有的限制是由以FDC(质量.体积 )和OFM‑1 ‑1 (质量.体积 长度 )为单位进行测量的nAUC单位不同造成的。 [0215] 对于OFM和FDC数据，通过绘制时间对应的各个测量数据点拟合S形函数，并使用梯形积分(Igor Pro 8.02, Wavemetrics)计算上述时间点之间的AUC。通过S形拟合以图形方式估算首次出现的非零双氯芬酸浓度(即大于LLOQ)。 [0216] 图9比较了不同制剂中真皮上层和真皮下层之间(A)以及真皮下层和皮下组织之间(B)的nAUC。 [0217] 在每一层皮肤中，不同制剂的nAUC差异很大，表明其组成对双氯芬酸通过整个真皮和皮下组织的被动扩散有显著影响。在真皮和皮下组织中观察到制剂的相对排名大致相似，这表明组成对双氯芬酸在两层皮肤中的扩散和分配系数的影响相似。 [0218] 还探讨了双氯芬酸通过皮肤屏障的扩散是否代表了扩散驱动的皮下药物水平，这些药物水平可进一步分布到下面的软组织(例如肌肉)中。为此，比较了到达真皮下层的驱动梯度AUCFDC (以FDC中的24小时累积吸收量计算)和到达皮下组织下软组织的驱动梯度AUCOFM皮下(以OFM中的皮下组织ISF的21小时累积双氯芬酸浓度计算)。图10显示了这种比较。 [0219] 制剂穿过皮肤屏障(A)和在皮下组织下(B)递送双氯芬酸的能力的相对排名差异很大，证明API穿过皮肤屏障的扩散不能预测其扩散驱动的皮下ISF水平。因此，例如制剂D实现了最高的24小时跨SC累积吸收量，比制剂G高2倍(图10A)。然而，制剂G实现了最高的24小时累积皮下ISF水平，比制剂D高1.8倍(图10B)。显然，对于双氯芬酸跨SC和在皮下层中的扩散，两种制剂中赋形剂的不同组合以不同的方式调节扩散系数D和分配系数K。 [0220] 该实施例说明了应用方法组合选择先导候选药物的有效性：根据具有某些物理化学性质的API的靶向作用位点，在产品开发过程中，这两种组合物中的一种或另一种可能是更好的选择。 [0221] 结论 [0222] 这些实施例证明了体外OFM与FDC结合应用的实用性。在产品开发的早期阶段，使用这种方法组合可以帮助选择优化API被动扩散的候选制剂，这些API被动扩散不仅能穿过皮肤屏障(如使用FDC的传统做法)，还能穿过下面的全层真皮和皮下组织。 [0223] 这种临床前工具箱的扩展提供了在局部产品开发过程中“早期失败、低成本失败”的好处，符合需要有效和安全的局部产品的消费者和患者的利益。使用适当设计的模型制剂，这种方法还可以推动人们了解特定赋形剂和赋形剂组合对给定API的扩散和分配系数的影响。 [0224] 鉴于此指导，本领域的普通技术人员将能够调整实施例中提供的参数以在权利要求的范围内实现类似的结果。