[0001] 本发明属于医药技术领域，尤其涉及抑制肿瘤细胞生长、发挥抗肿瘤效果的新型EZH2抑制剂化合物和其药学上可接受的盐及制备方法和医药用途。是一种对EZH2、PRC2、EZH2/PRC2介导的疾病具有治疗作用的化合物。

[0002] 癌症依旧是全球范围内亟待解决的重要公共卫生挑战，我国癌症发病、死亡数持续上升。表观遗传学(Epigenetics)是与遗传学相互对应的一个概念，它主要研究在不改变DNA序列的前提下，通过调控机制来影响基因的表达方式。这些调控机制包括DNA甲基化、组蛋白翻译后的修饰以及染色质的重塑过程等。越来越多的研究已经表明，癌症的发生与表观遗传的异常表达密切相关。多梳(Polycomb group,PcG)蛋白是一类重要的表观遗传学调控分子，PRC 2是一种甲基转移酶，其组成包括胚胎外胚层发育蛋白(EED)、Zeste 12同源蛋白抑制因子(SUZ 12)以及Zeste同源物1/2增强子(EZH1/2)。这些组分共同构成了PRC 2，在生物体内发挥着重要的作用。Zeste同源物2(EZH2)是蛋白抑制复合体PRC2重要的催化亚基，可以将组蛋白H3的27位赖氨酸三甲基化(H3K27me3)以促进转录沉默，抑制靶基因的表达。这些靶基因大部分具有抑制细胞增殖和促进细胞分化的作用，EZH2的过表达或功能的过度增强将使上述基因表达的过度沉默，最终导致肿瘤的发生。

[0003] EPZ‑6438是第一个被FDA批准上市的EZH2抑制剂，主要用于治疗上皮样肉瘤和复发性或难治性滤泡性淋巴瘤。迄今为止，许多小分子EZH2特异性抑制剂已经进入临床试验，但其中许多抑制剂的临床疗效有限，如临床前耐药和治疗效果差。提高EZH2的抗癌活性需要新的技术和方法。本发明将以Tazemetostat为对照药物，设计合成新型EZH2抑制剂。

[0004] 前期合成了一种新型取代噻吩并嘧啶类化合物，并对化合物进行了体外抗肿瘤活性研究，本发明在此基础上进行深入研究。

[0028] 下文中提供的实施例和制备例进一步阐明和举例说明本发明化合物及其制备方法。应当理解，下述实例和制备例的范围并不以任何方式限制本发明的范围。

[0029] 下面的合成路线描述了本发明通式(Ⅰ)或(Ⅱ)或(Ⅲ)的新型EZH2抑制剂化合物的制备方法。

[0030] 所有的原料都是通过如下合成路线描述的方式、通过有机化学领域普通技术人员熟知的方法制备的或者可商购。本发明的全部最终化合物都是通过下述合成路线描述的方法或通过与其类似的方法制备的，这些方法是有机化学领域普通技术人员熟知的。下述合成路线中应用的全部可变因数如下文的定义或如权利要求中的定义。

[0031] 实施例旨在阐述而不是限制本发明的范围。化合物的核磁共振氢谱用Bruker ARX‑400或者ARX‑600测定，质谱用Agilent 1100LC/MSD测定；所用试剂均为分析纯或化学纯。

[0032] 按照本发明的通式(Ⅰ)或(Ⅱ)或(Ⅲ)化合物1‑25的合成路线如下：

[0033] 1)如目标化合物的的合成路线1所示，以5‑溴‑1‑茚酮为原料，在甲醇溶液中被NaBH4还原得到中间体2；中间体2在二氯甲烷溶液中与二氯亚砜反应得到中间体3；中间体3与R反应得到中间体4；中间体4与4,4,4',4',5,5,5',5'‑八甲基‑2,2'‑联(1,3,2‑二氧杂环戊硼烷)偶联反应得到中间体5。

[0034]

[0035] 其中，(a)MeOH,NaBH4,RT；(b)SOCl2,DCM,RT；(c)K2CO3,KI,MeCN,60℃；(d)Diox,Pd(pph3)2Cl2,CH3COOK,100℃。

[0036] 2)如目标化合物的的合成路线2所示，以2‑甲基‑3‑硝基苯甲酸为原料，与二溴海因在25℃的条件下反应得到中间体7；中间体物7成酯反应得到中间体物8；中间体8被铁粉还原得到中间体9；中间体9在乙腈溶液中与环丙酰氯反应得到中间体10；中间体10在DMF溶液中与碘乙烷反应得到中间体11；中间体11在甲醇水溶液中水解得到中间体12；中间体12与3‑(氨甲基)‑4,6‑二甲基吡啶‑2(1H)‑酮得到中间体13；中间体13通过硼酸偶联反应得到目标化合物(化合物1、化合物3、化合物6、化合物9、化合物12、化合物14、化合物17、化合物20、化合物23、化合物24)。

[0037]

[0038] 其中，(a)H2SO4,25℃；(b)MeOH,H2SO4,60℃；(c)NH4Cl,MeOH,H2O,80℃；(d)MeCN,K2CO3,RT；(e)Cs2CO3,DMF,Diox,RT；(f)NaOH,MeOH,H2O,70℃；(g)HATU,DMF,Et3N,50℃；(h)Diox,Pd(pph3)2Cl2,H2O,CH3COOK,100℃。

[0039] 3)如目标化合物的的合成路线3所示，以6‑溴‑4‑吲唑甲酸甲酯为原料，与2‑碘丙烷在乙腈溶液中反应得到中间体16；中间体16水解反应得到中间体17；中间体17与3‑(氨甲基)‑4,6‑二甲基吡啶‑2(1H)‑酮得到中间体18；中间体18通过硼酸偶联反应得到目标化合物(化合物2、化合物4、化合物7、化合物10、化合物13、化合物15、化合物18、化合物21、化合物25)。

[0040]

[0041]

[0042] 其中，(a)Cs2CO3,MeCN,90℃；(b)NaOH,MeOH,H2O,70℃；(c)HATU,DMF,Et3N,25℃；(d)Diox,Pd(pph3)2Cl2,H2O,CH3COOK,100℃。

[0043] 4)如目标化合物的的合成路线4所示，以6‑溴‑4‑吲哚甲酸甲酯为原料，与2‑碘丙烷在DMF溶液中反应得到中间体21；中间体21水解反应得到中间体22；中间体22与3‑(氨甲基)‑4,6‑二甲基吡啶‑2(1H)‑酮得到中间体23；中间体23通过硼酸偶联反应得到目标化合物(化合物5、化合物8、化合物11、化合物16、化合物19、化合物22)。

[0044]

[0045] 其中，(a)NaH,DMF；(b)NaOH,MeOH,H2O,70℃；(c)HATU,DMF,Et3N,25℃；(d)Diox,Pd(pph3)2Cl2,H2O,CH3COOK,100℃。

[0046] 实施例1

[0047]

[0048] N‑((4,6‑二甲基‑2‑氧代‑1,2‑二氢吡啶‑3‑基)甲基)‑2‑(呋喃‑2‑基)噻吩并[3,2‑d]嘧啶‑4‑甲酰胺(化

[0049] 合物1)

[0050] (1)5‑bromo‑2,3‑dihydro‑1H‑inden‑1‑ol(中间体2)的合成

[0051]

[0052] 100mL茄形烧瓶中加入中间体1(10g,0.05mmol)，50mL甲醇溶液溶解，冷阱中加入NaBH4(1.93g,0.05mmol)，室温反应，4h后反应完全。冷水中析出9.93g白色固体，产率98.82％。

[0053] (2)5‑bromo‑1‑chloro‑2,3‑dihydro‑1H‑indene(中间体3)的合成

[0054]

[0055] 250mL烧瓶中加入中间体2(10g,0.05mol)，用80mL二氯甲烷溶解，冷阱中滴加二氯亚砜(11.27g,0.1mol)，室温反应，24h后反应完全。旋蒸除掉二氯亚砜，然后，向所得的滤液中加入100mL的二氯甲烷。随后，使用50mL的水对混合物进行两次洗涤，确保杂质的去除。之后，再用饱和NaCl溶液进行两次洗涤，每次使用30mL，以进一步净化有机相。完成洗涤后，使用无水硫酸钠对有机相进行干燥处理。接着，通过过滤操作去除硫酸钠。最后，对滤液进行减压蒸发，直至完全干燥，从而得到所需的粗品。干法上样柱层析分离得8.54g产物，产率78.71％。

[0056] (3)4‑(5‑bromo‑2,3‑dihydro‑1H‑inden‑1‑yl)morpholine(中间体4a)的合成[0057]

[0058] 50mL三颈瓶中加入中间体3(1g,0.04mol)、K2CO3(3.01g,0.20mol)、KI(0.72g,0.04mol)，15mL乙腈溶液溶解，开启搅拌，加入吗啉(0.76g,0.08mol)。60℃氮气保护反应。
24h后反应完全。抽滤除掉不溶物。取滤液调pH值为2左右，反向萃取保留水相，取水相，再调pH值为11左右，保留有机相。向有机相中加入20mL的二氯甲烷。混合物用10mL水洗涤两次，再用饱和NaCl溶液洗涤两次，每次10mL，有机相无水硫酸钠干燥，过滤除去硫酸钠，滤液减压蒸发至干，得粗品。干法上样柱层析分离化得到0.85g棕色固体，产率69.53％。

[0059] (4)5‑bromo‑N,N‑dimethyl‑2,3‑dihydro‑1H‑inden‑1‑amine(中间体4b)的合成[0060]

[0061] 50mL三颈瓶中加入中间体3(1g,0.04mol)、K2CO3(3.01g,0.20mol)、KI(0.72g,0.04mol)，15mL乙腈溶液溶解，开启搅拌，加入二甲胺(0.39g,0.08mol)。采用中间体4a的反应条件和后处理方法，得到0.67g固体产物，产率64.89％。

[0062] (5)1‑(5‑bromo‑2,3‑dihydro‑1H‑inden‑1‑yl)‑4‑methylpiperazine(中间体4c)的合成

[0063]

[0064] 50mL三颈瓶中加入中间体3(1g,0.04mol)、K2CO3(3.01g,0.20mol)、KI(0.72g,0.04mol)，15mL乙腈溶液溶解，开启搅拌，加入氮甲基哌嗪(2.56g,0.08mol)。采用中间体4a的反应条件和后处理方法，得到0.83g固体，产率64.84％。

[0065] (6)(2S,6R)‑4‑(5‑bromo‑2,3‑dihydro‑1H‑inden‑1‑yl)‑2,6‑dimethylmorpholine(中间体4d)的合

[0066] 成

[0067]

[0068] 50mL三颈瓶中加入中间体3(1g,0.04mol)、K2CO3(3.01g,0.20mol)、KI(0.72g,0.04mol)，15mL乙腈溶液溶解，开启搅拌，加入顺二甲基吗啉(2.7g,0.08mol)。采用中间体
4a的反应条件和后处理方法，得到0.77g固体产物，产率57.21％。

[0069] (7)1‑(5‑bromo‑2,3‑dihydro‑1H‑inden‑1‑yl)‑4‑methoxypiperidine(中间体4e)的合成

[0070]

[0071] 50mL三颈瓶中加入中间体3(1g,0.04mol)、K2CO3(3.01g,0.20mol)、KI(0.72g,0.04mol)，15mL乙腈溶液溶解，开启搅拌，加入甲氧基吡啶(1.01g,0.08mol)。采用中间体4a的反应条件和后处理方法，得到0.73g固体，产率54.23％。

[0072] (8)1‑(5‑bromo‑2,3‑dihydro‑1H‑inden‑1‑yl)‑4‑(2‑methoxyethyl)piperazine(中间体4f)的合成。

[0073]

[0074] 50mL三颈瓶中加入中间体3(1g,0.04mol)、K2CO3(3.01g,0.20mol)、KI(0.72g,0.04mol)，15mL乙腈溶液溶解，开启搅拌，加入1‑(2‑甲氧基乙基)哌嗪(1.26g,0.08mol)。采用中间体4a的反应条件和后处理方法，分离纯化得到0.70g棕色固体，产率47.21％。

[0075] (9)1‑(1‑(5‑bromo‑2,3‑dihydro‑1H‑inden‑1‑yl)piperidin‑4‑yl)ethan‑1‑one(中间体4g)的合成

[0076]

[0077] 50mL三颈瓶中加入中间体3(1g,0.04mol)、K2CO3(3.01g,0.2mol)、KI(0.72g,0.04mol)，15mL乙腈溶液溶解，开启搅拌，加入乙酰哌嗪(1.10g,0.08mol)。采用中间体4a的反应条件和后处理方法，分离纯化得到1.06g黄色固体，产率75.68％。

[0078] (10)1‑(5‑bromo‑2,3‑dihydro‑1H‑inden‑1‑yl)‑N,N‑dimethylpiperidin‑4‑amine(中间体4h)的合

[0079] 成

[0080]

[0081] 50mL三颈瓶中加入中间体3(1g,0.04mol)、K2CO3(3.01g,0.2mol)、KI(0.72g,0.04mol)，15mL乙腈溶液溶解，开启搅拌，加入4‑二甲氨基哌啶(1.21g,0.08mol)。采用中间体4a的反应条件和后处理方法，得到0.87g棕色固体，产率61.71％。

[0082] (11)1‑(5‑bromo‑2,3‑dihydro‑1H‑inden‑1‑yl)‑4‑methylpiperidine(中间体4i)的合成

[0083]

[0084] 50mL三颈瓶中加入中间体3(1g,0.04mol)、K2CO3(3.01g,0.2mol)、KI(0.72g,0.04mol)，15mL乙腈溶液溶解，开启搅拌，加入4‑甲基哌啶(0.86g,0.08mol)。采用中间体4a的反应条件和后处理方法，得到0.73g固体，产率54.76％。

[0085] (12)N1‑(5‑bromo‑2,3‑dihydro‑1H‑inden‑1‑yl)‑N1,N2,N2‑trimethylethane‑1,2‑diamine(中间体4j)的合成

[0086]

[0087] 50mL三颈瓶中加入中间体3(1g,0.04mol)、K2CO3(3.01g,0.2mol)、KI(0.72g,1 1 2
0.04mol)，15mL乙腈溶液溶解，开启搅拌，加入N ,N ,N ‑三乙基乙烷‑1,2‑二胺(0.89g,
0.08mol)。采用中间体4a的反应条件和后处理方法，得到0.76g固体，产率53.21％。

[0088] (13)4‑(5‑(4,4,5,5‑tetramethyl‑1,3,2‑dioxaborolan‑2‑yl)‑2,3‑dihydro‑1H‑inden‑1‑

[0089] yl)morpholine(中间体5a)的合成

[0090]

[0091] 50mL三颈瓶中加入中间体4a(500mg,1.8mmol)、4,4,4',4',5,5,5',5'‑八甲基‑2,2'‑联(1,3,2‑二氧杂环戊硼烷)(678mg,2.7mmol)、乙酸钾(261.18mg,2.7mmol)，15mL二氧六环溶液溶解，氮气鼓泡30min，加入Pd(pph3)2Cl2(62.41mg,0.09mmol)，抽真空三次，氮气保护100℃反应，反应12h后反应完全。抽滤除去不溶物，向有机相中加入20mL的二氯甲烷。
混合物用10mL水洗涤两次，再用饱和NaCl溶液洗涤两次，每次10mL，有机相无水硫酸钠干燥，过滤除去硫酸钠，滤液减压蒸发至干，得粗品。干法上样柱层析分离纯化得到423mg固体，产率66.60％。

[0092] (14)N,N‑dimethyl‑5‑(4,4,5,5‑tetramethyl‑1,3,2‑dioxaborolan‑2‑yl)‑2,3‑dihydro‑1H‑inden‑1‑

[0093] amine(中间体5b)的合成

[0094]

[0095] 50mL三颈瓶中加入中间体4b(500mg,2.01mmol)、4,4,4',4',5,5,5',5'‑八甲基‑2,2'‑联(1,3,2‑二氧杂环戊硼烷)(797mg,3.13mmol)、乙酸钾(307.18mg,3.13mmol)，15mL二氧六环溶液溶解，氮气鼓泡30min，加入Pd(pph3)2Cl2(73.44mg,0.10mmol)，抽真空三次，氮气保护100℃反应。采用中间体5a的反应条件和后处理方法，得到387mg黄色固体，产率
76.14％。

[0096] (15)1‑methyl‑4‑(5‑(4,4,5,5‑tetramethyl‑1,3,2‑dioxaborolan‑2‑yl)‑2,3‑dihydro‑1H‑inden‑1‑

[0097] yl)piperazine(中间体5c)的合成

[0098]

[0099] 50mL三颈瓶中加入中间体4c(500mg,1.70mmol)、4,4,4',4',5,5,5',5'‑八甲基‑2,2'‑联(1,3,2‑二氧杂环戊硼烷)(647mg,2.55mmol)、乙酸钾(250.28mg,2.55mmol)，15mL二氧六环溶液溶解，氮气鼓泡30min，加入Pd(pph3)2Cl2(62.4mg,0.08mmol)，抽真空三次，氮气保护100℃反应。采用中间体5a的反应条件和后处理方法，得到521mg淡黄色固体，产率
84.75％。

[0100] (16)(2S,6R)‑2,6‑dimethyl‑4‑(5‑(4,4,5,5‑tetramethyl‑1,3,2‑dioxaborolan‑2‑yl)‑2,3‑dihydro‑1H‑

[0101] inden‑1‑yl)morpholine(中间体5d)的合成

[0102]

[0103] 50mL三颈瓶中加入中间体4d(500mg,1.62mmol)、4,4,4',4',5,5,5',5'‑八甲基‑2,2'‑联(1,3,2‑二氧杂环戊硼烷)(616mg,2.43mmol)、乙酸钾(237.76mg,2.43mmol)，15mL二氧六环溶液溶解，氮气鼓泡30min，加入Pd(pph3)2Cl2(56.78mg,0.08mmol)，抽真空三次，氮气保护100℃反应。采用中间体5a的反应条件和后处理方法，得到421mg浅黄色固体，产率
66.54％。

[0104] (17)4‑methoxy‑1‑(5‑(4,4,5,5‑tetramethyl‑1,3,2‑dioxaborolan‑2‑yl)‑2,3‑dihydro‑1H‑inden‑1‑

[0105] yl)piperidine(中间体5e)的合成

[0106]

[0107] 50mL三颈瓶中加入中间体4e(500mg,1.62mmol)、4,4,4',4',5,5,5',5'‑八甲基‑2,2'‑联(1,3,2‑二氧杂环戊硼烷)(624mg,2.43mmol)、乙酸钾(237.46mg,2.43mmol)，15mL二氧六环溶液溶解，氮气鼓泡30min，加入Pd(pph3)2Cl2(56.79mg,0.08mmol)，抽真空三次，氮气保护100℃反应。采用中间体5a的反应条件和后处理方法，得到497mg固体产物，产率
78.62％。

[0108] (18)1‑(2‑methoxyethyl)‑4‑(5‑(4,4,5,5‑tetramethyl‑1,3,2‑dioxaborolan‑2‑yl)‑2,3‑dihydro‑1H‑

[0109] inden‑1‑yl)piperazine(中间体5f)的合成

[0110]

[0111] 50mL三颈瓶中加入中间体4f(500mg,1.48mmol)、4,4,4',4',5,5,5',5'‑八甲基‑2,2'‑联(1,3,2‑二氧杂环戊硼烷)(563mg,2.22mmol)、乙酸钾(217.36mg,2.22mmol)，15mL二氧六环溶液溶解，氮气鼓泡30min，加入Pd(pph3)2Cl2(51.9mg,0.07mmol)，抽真空三次，氮气保护100℃反应。采用中间体5a的反应条件和后处理方法，得到468mg固体，产率68.42％。

[0112] (19)1‑(1‑(5‑(4,4,5,5‑tetramethyl‑1,3,2‑dioxaborolan‑2‑yl)‑2,3‑dihydro‑1H‑inden‑1‑yl)piperidin‑4‑yl)ethan‑1‑one(中间体5g)的合成[0113]

[0114] 50mL三颈瓶中加入中间体4g(500mg,1.55mmol)、4,4,4',4',5,5,5',5'‑八甲基‑2,2'‑联(1,3,2‑二氧杂环戊硼烷)(593mg,2.32mmol)、乙酸钾(228mg,2.32mmol)，15mL二氧六环溶液溶解，氮气鼓泡30min，加入Pd(pph3)2Cl2(55mg,0.08mmol)，抽真空三次，氮气保护
100℃反应。采用中间体5a的反应条件和后处理方法，得到466mg淡黄色固体，产率71.25％。

[0115] (20)N,N‑dimethyl‑1‑(5‑(4,4,5,5‑tetramethyl‑1,3,2‑dioxaborolan‑2‑yl)‑2,3‑dihydro‑1H‑inden‑1‑

[0116] yl)piperidin‑4‑amine(中间体5h)的合成

[0117]

[0118] 50mL三颈瓶中加入中间体4h(500mg,1.55mmol)、4,4,4',4',5,5,5',5'‑八甲基‑2,2'‑联(1,3,2‑二氧杂环戊硼烷)(591mg,2.32mmol)、乙酸钾(228mg,2.32mmol)，15mL二氧六环溶液溶解，氮气鼓泡30min，加入Pd(pph3)2Cl2(54mg,0.08mmol)，抽真空三次，氮气保护
100℃反应。采用中间体5a的反应条件和后处理方法，得到534mg固体，产率81.47％。

[0119] (21)4‑methyl‑1‑(5‑(4,4,5,5‑tetramethyl‑1,3,2‑dioxaborolan‑2‑yl)‑2,3‑dihydro‑1H‑inden‑1‑

[0120] yl)piperidine(中间体5i)的合成

[0121] 50mL三颈瓶中加入中间体4i(500mg,1.55mmol)、4,4,4',4',5,5,5',5'‑八甲基‑2,2'‑联(1,3,2‑二氧杂环戊硼烷)(647mg,2.32mmol)、乙酸钾(250mg,2.32mmol)，15mL二氧六环溶液溶解，氮气鼓泡30min，加入Pd(pph3)2Cl2(59.28mg,0.08mmol)，抽真空三次，氮气保护100℃反应。采用中间体5a的反应条件和后处理方法，得到489mg固体，产率69.53％。

[0122] (22)N1,N1,N2‑trimethyl‑N2‑(5‑(4,4,5,5‑tetramethyl‑1,3,2‑dioxaborolan‑2‑yl)‑2,3‑dihydro‑1H‑

[0123] inden‑1‑yl)ethane‑1,2‑diamine(中间体5j)的合成

[0124]

[0125] 50mL三颈瓶中加入中间体4j(500mg,1.55mmol)、4,4,4',4',5,5,5',5'‑八甲基‑2,2'‑联(1,3,2‑二氧杂环戊硼烷)(643mg,2.32mmol)、乙酸钾(248mg,2.32mmol)，15mL二氧六环溶液溶解，氮气鼓泡30min，加入Pd(pph3)2Cl2(59.28mg,0.08mmol)，抽真空三次，氮气保护100℃反应。采用中间体5a的反应条件和后处理方法，得到463mg淡黄色固体，产率
73.46％。

[0126] (23)5‑bromo‑2‑methyl‑3‑nitrobenzoic acid(中间体7)的合成

[0127]

[0128] 在1L茄形瓶中加入2‑甲基‑3‑硝基苯甲酸(30g,0.17mol)用70mL浓硫酸溶解，开动搅拌，加入二溴海因(8.71g,8.3mmol)，25℃反应，5h后反应完全，将反应液加入冷水中，析出大量白色固体。烘干得41.10g产物，产率95.80％。

[0129] (24)methyl 5‑bromo‑2‑methyl‑3‑nitrobenzoate(中间体8)的合成

[0130]

[0131] 取中间体7(30g,0.12mol)于1L茄形瓶中，加入200mL的甲醇溶液溶解，冷阱中缓慢滴加100mL浓硫酸，60℃回流反应，6h后反应完毕，取反应液用NaOH溶液调pH为9左右，析出大量淡黄色固体，烘干得30.04g固体，产率94.67％。

[0132] (25)methyl 5‑bromo‑2‑methyl‑3‑nitrobenzoate(中间体9)的合成

[0133]

[0134] 在1L茄形瓶中加入中间体8(30g,0.11mol)，用280mL甲醇水溶液(3:1)溶解，加入14.7g氯化铵(29.24g,0.55mol)，接着将铁粉(61.31g,1.1mol)加入反应体系中，80℃反应，大约经过9h后，反应完全结束。使用硅藻土进行抽滤，取滤液。然后，向滤液中加入100mL的二氯甲烷。混合物用50mL水洗涤两次，再用饱和NaCl溶液洗涤两次，每次30mL，有机相无水硫酸钠干燥，过滤除去硫酸钠，滤液减压蒸发至干，得粗品。干法上样柱层析分离22.31g白色固体，产率83.55％。

[0135] (26)methyl 5‑bromo‑3‑(cyclopropanecarboxamido)‑2‑methylbenzoate(中间体10)的合成

[0136]

[0137] 在500mL茄形瓶中加入中间体9(20g,0.08mol)、K2CO3(22.63g,0.16mol)，用100mL乙腈溶液溶解，开动搅拌，滴加环丙酰氯(8.52g,0.08mol)，室温反应，6h后反应完全，抽滤，取滤液。接下来，向所得的滤液中加入100mL的二氯甲烷。随后，使用50mL的水对混合物进行两次洗涤，确保杂质的去除。之后，再用饱和NaCl溶液进行两次洗涤，每次使用30mL，以进一步净化有机相。完成洗涤后，使用无水硫酸钠对有机相进行干燥处理。接着，通过过滤操作去除硫酸钠。最后，对滤液进行减压蒸发，直至完全干燥，从而得到所需的粗品。干法上样柱层析分离化得到22.13g白色固体，产率87.79％。

[0138] (27)methyl5‑bromo‑3‑(N‑ethylcyclopropanecarboxamido)‑2‑methylbenzoate(中间体11)的合

[0139] 成

[0140]

[0141] 250mL三颈瓶中加入中间体10(20g,0.06mol)、Cs2CO3(41.92g,0.12mol)，加入80mL DMF溶解，开动搅拌，滴加碘乙烷(20.06g,0.12mol)，室温反应，3h后反应完全。取反应液，滤纸抽滤。接下来，向所得的滤液中加入100mL的二氯甲烷。随后，使用50mL的水对混合物进行两次洗涤，确保杂质的去除。之后，再用饱和NaCl溶液进行两次洗涤，每次使用30mL，以进一步净化有机相。完成洗涤后，使用无水硫酸钠对有机相进行干燥处理。接着，通过过滤操作去除硫酸钠。最后，对滤液进行减压蒸发，直至完全干燥，从而得到所需的粗品。干法上样柱层析分离纯化得到15.7g固体，产率74.40％。

[0142] (28)5‑bromo‑3‑(N‑ethylcyclopropanecarboxamido)‑2‑methylbenzoic acid(中间体12)的合成

[0143]

[0144] 250mL圆底烧瓶中加入中间体11(10g,0.03mol)，140mL甲醇水溶液(6:1)溶解，向其中加入NaOH(2.94g,0.06mol)，70℃回流反应，2h后反应完全。旋蒸除去甲醇，加入20mL水，用稀盐酸将pH值调整到5左右，向所得的滤液中加入100mL的二氯甲烷。随后，使用50mL的水对混合物进行两次洗涤，确保杂质的去除。之后，再用饱和NaCl溶液进行两次洗涤，每次使用30mL，以进一步净化有机相。完成洗涤后，使用无水硫酸钠对有机相进行干燥处理。接着，通过过滤操作去除硫酸钠。最后，对滤液进行减压蒸发，直至完全干燥，从而得到所需的粗品。得8.75g黄色固体，产率91.44％。

[0145] (29)5‑bromo‑N‑((4,6‑dimethyl‑2‑oxo‑1,2‑dihydropyridin‑3‑yl)methyl)‑3‑(N‑

[0146] ethylcyclopropanecarboxamido)‑2‑methylbenzamide(中间体13)的合成[0147]

[0148] 用DMF溶解中间体12(5g,0.02mol)，加入三乙胺(2.31g,0.02mol)、3‑氨甲基‑4，6‑二甲基吡啶‑2(1H)酮(4.67g,0.02mol)、HATU(11.69g,0.02mol)，25℃反应，10h后反应未完全，加热50℃反应，6h后反应完全。取反应液向所得的滤液中加入50mL的二氯甲烷。随后，使用30mL的水对混合物进行两次洗涤，确保杂质的去除。之后，再用饱和NaCl溶液进行两次洗涤，每次使用20mL，以进一步净化有机相。完成洗涤后，使用无水硫酸钠对有机相进行干燥处理。接着，通过过滤操作去除硫酸钠。最后，对滤液进行减压蒸发，直至完全干燥，从而得到所需的粗品。打浆分离得4.92g白色固体，产率70.26％。

[0149] (30)methyl 6‑bromo‑1‑isopropyl‑1H‑indazole‑4‑carboxylate(中间体16)的合成

[0150]

[0151] 250mL圆底烧瓶中加入6‑溴‑4‑吲唑甲酸甲酯(中间体15)(10g,0.04mol)，100mL乙腈溶解，加入Cs2CO3(41.92g,0.08mol)、2‑碘丙烷(5g,0.06mol)。升温至90℃回流反应约2h。旋蒸除掉甲醇，加入100mL的二氯甲烷。随后，使用50mL的水对混合物进行两次洗涤，确保杂质的去除。之后，再用饱和NaCl溶液进行两次洗涤，每次使用30mL，以进一步净化有机相。完成洗涤后，使用无水硫酸钠对有机相进行干燥处理。接着，通过过滤操作去除硫酸钠。最后，对滤液进行减压蒸发，直至完全干燥，得10.71g黄色固体，产率92.26％。

[0152] (31)6‑bromo‑1‑isopropyl‑1H‑indazole‑4‑carboxylic acid(中间体17)的合成[0153]

[0154] 250mL圆底烧瓶中加入中间体16(10g,0.03mol)，140mL甲醇水溶液(6:1)溶解，向其中加入NaOH(2.74g,0.06mol)，70℃回流反应，2h后反应完全。旋蒸除去甲醇，向所得的滤液中加入100mL的二氯甲烷。随后，使用50mL的水对混合物进行两次洗涤，确保杂质的去除。之后，再用饱和NaCl溶液进行两次洗涤，每次使用30mL，以进一步净化有机相。完成洗涤后，使用无水硫酸钠对有机相进行干燥处理。接着，通过过滤操作去除硫酸钠。最后，对滤液进行减压蒸发，直至完全干燥，得8.58g黄色固体，产率90.01％。

[0155] (32)6‑bromo‑N‑((4,6‑dimethyl‑2‑oxo‑1,2‑dihydropyridin‑3‑yl)methyl)‑1‑isopropyl‑1H‑

[0156] indazole‑4‑carboxamide(中间体18)的合成

[0157]

[0158] 用40mLDMF溶解中间体17(5g,0.02mol)，加入三乙胺(2.68g,0.03mol)、3‑氨甲基‑4，6‑二甲基吡啶‑2(1H)酮(5.39g,0.04mol)、HATU(13.48g,0.04mol)，25℃反应，12h后检测反应未完全，将反应加热到50℃反应，8h后反应完全。加入100mL的二氯甲烷。随后，使用
50mL的水对混合物进行两次洗涤，确保杂质的去除。之后，再用饱和NaCl溶液进行两次洗涤，每次使用30mL，以进一步净化有机相。完成洗涤后，使用无水硫酸钠对有机相进行干燥处理。接着，通过过滤操作去除硫酸钠。最后，对滤液进行减压蒸发，直至完全干燥，从而得到所需的粗品。打浆分离得4.92g白色固体，产率70.76％。

[0159] (33)methyl 6‑bromo‑1‑isopropyl‑1H‑indole‑4‑carboxylate(中间体21)的合成

[0160]

[0161] 250mL圆底烧瓶中加入6‑溴‑4‑吲哚甲酸甲酯(中间体20)(10g,0.04mmol)，100mL无水DMF溶解，0℃搅拌状态下加入NaH(1.42g,0.08mmol)，搅拌30min，加入碘丙烷(14.23g,2mmol)。室温反应约5h，反应完全。向所得的滤液中加入100mL的二氯甲烷。随后，使用50mL的水对混合物进行两次洗涤，确保杂质的去除。之后，再用饱和NaCl溶液进行两次洗涤，每次使用30mL，以进一步净化有机相。完成洗涤后，使用无水硫酸钠对有机相进行干燥处理。
接着，通过过滤操作去除硫酸钠。最后，对滤液进行减压蒸发，直至完全干燥，得10.41g黄色固体，产率89.23％。

[0162] (34)6‑bromo‑1‑isopropyl‑1H‑indole‑4‑carboxylic acid(中间体22)的合成[0163]

[0164] 250mL圆底烧瓶中加入中间体21(10g,0.03mol)，140mL甲醇水溶液(6:1)溶解，向其中加入NaOH(2.71g,0.06mol)，70℃回流反应，2h后反应完全。旋蒸除去甲醇，加入20mL水，用稀盐酸调节pH为5左右向所得的滤液中加入100mL的二氯甲烷。随后，使用50mL的水对混合物进行两次洗涤，确保杂质的去除。之后，再用饱和NaCl溶液进行两次洗涤，每次使用30mL，以进一步净化有机相。完成洗涤后，使用无水硫酸钠对有机相进行干燥处理。接着，通过过滤操作去除硫酸钠。最后，对滤液进行减压蒸发，直至完全干燥，得8.87g黄色固体，产率93.41％。

[0165] (35)6‑bromo‑N‑((4,6‑dimethyl‑2‑oxo‑1,2‑dihydropyridin‑3‑yl)methyl)‑1‑isopropyl‑1H‑indole‑4‑carboxamide(中间体23)的合成

[0166]

[0167] 用DMF溶解中间体22(5g,0.02mol)，加入三乙胺(5.39g,0.03mol)、3‑氨甲基‑4，6‑二甲基吡啶‑2(1H)酮(8.11g,0.04mol)、HATU(27.05g,0.04mol)，25℃反应，13h后反应完全。加入50mL的二氯甲烷。随后，使用30mL的水对混合物进行两次洗涤，确保杂质的去除。之后，再用饱和NaCl溶液进行两次洗涤，每次使用20mL，以进一步净化有机相。完成洗涤后，使用无水硫酸钠对有机相进行干燥处理。接着，通过过滤操作去除硫酸钠。最后，对滤液进行减压蒸发，直至完全干燥，从而得到所需的粗品。打浆得4.92g白色固体，产率70.06％。

[0168] (36)N‑((4,6‑dimethyl‑2‑oxo‑1,2‑dihydropyridin‑3‑yl)methyl)‑3‑(N‑[0169] ethylcyclopropanecarboxamido)‑2‑methyl‑5‑(1‑morpholino‑2,3‑dihydro‑1H‑inden‑5‑

[0170] yl)benzamide(化合物1)的合成

[0171] 50mL三颈瓶中加入中间体13(100mg,0.22mmol)、中间体5a(143mg,0.44mmol)、乙酸钾(32mg,0.33mmol)，12mL二氧六环水溶液(3:1)充分溶解，氮气鼓泡30min，加入Pd(pph3)2Cl2(7mg,0.01mmol)，抽真空三次，氮气保护100℃反应。反应36h后反应完全。抽滤除去不溶物，抽滤除去不溶物，向有机相中加入20mL的二氯甲烷。混合物用10mL水洗涤两次，再用饱和NaCl溶液洗涤两次，每次10mL，有机相无水硫酸钠干燥，过滤除去硫酸钠，滤液减压蒸发至干，得粗品。干法上样柱层析分离纯化得到15mg白色固体，产率11.82％。

[0172] MS(ESI)m/z(％):583.30[M+H]+,605.30[M+Na]+。1H NMR(600MHz,Chloroform‑d)δ11.96(s,1H),7.91(s,1H),7.80‑7.66(m,4H),7.61(s,2H),6.27(s,1H),4.91(s,2H),4.66(s,1H),4.42(dt,J＝14.0,7.0Hz,1H),4.16‑3.99(m,4H),3.67(dt,J＝11.5,5.8Hz,1H),
3.37‑3.08(m,2H),2.88(d,J＝26.2Hz,4H),2.70(d,J＝58.2Hz,6H),2.50(s,5H),2.07(s,
2H),1.77(s,4H),1.57(d,J＝37.8Hz,3H)。

[0173] (37)N‑((4,6‑dimethyl‑2‑oxo‑1,2‑dihydropyridin‑3‑yl)methyl)‑1‑isopropyl‑6‑(1‑morpholino‑2,3‑

[0174] dihydro‑1H‑inden‑5‑yl)‑1H‑indazole‑4‑carboxamide(化合物2)的合成[0175]

[0176] 50mL三颈瓶中加入中间体18(100mg,0.24mmol)、中间体5a(158mg,0.48mmol)、乙酸钾(35mg,0.36mmol)，12mL二氧六环水溶液(3:1)充分溶解，氮气鼓泡30min，加入Pd(pph3)2Cl2(8mg,0.01mmol)，抽真空三次，氮气保护100℃反应。采用终产物化合物1的反应条件和后处理方法，得到34mg白色固体，产率26.53％。

[0177] MS(ESI)m/z(％):539.30[M]+。1H NMR(600MHz,Chloroform‑d)δ12.03(s,1H),8.53(s,1H),7.95(d,J＝38.5Hz,2H),7.65(s,1H),7.38(d,J＝6.9Hz,3H),7.26(s,1H),5.90(s,1H),4.80(s,1H),4.62(s,2H),4.30(s,1H),3.72(s,4H),2.88(d,J＝68.0Hz,2H),2.54(d,J＝19.4Hz,4H),2.42(s,2H),2.08(s,5H),1.64(s,6H)。

[0178] (38)N‑((4,6‑dimethyl‑2‑oxo‑1,2‑dihydropyridin‑3‑yl)methyl)‑5‑(1‑(dimethylamino)‑2,3‑

[0179] dihydro‑1H‑inden‑5‑yl)‑3‑(N‑ethylcyclopropanecarboxamido)‑2‑methylbenzamide(化合物

[0180] 3)的合成

[0181]

[0182] 50mL三颈瓶中加入中间体13(100mg,0.22mmol)、中间体5b(125mg,0.44mmol)、乙酸钾(35mg,0.33mmol)，12mL二氧六环水溶液(3:1)充分溶解，氮气鼓泡30min，加入Pd(pph3)2Cl2(7mg,0.01mmol)，抽真空三次，氮气保护100℃反应。采用终产物化合物1的反应条件和后处理方法，得到22mg白色固体，产率18.96％。

[0183] MS(ESI)m/z(％):540.30[M]+,541.30[M+H]+。1H NMR(600MHz,DMSO‑d6)δ11.48(s,1H),8.37(s,1H),7.63(d,J＝39.0Hz,2H),5.87(s,1H),4.32(s,2H),3.80(s,1H),3.48(s,
1H),2.50(s,10H),2.15(d,J＝50.9Hz,9H),1.23(s,4H),1.03(s,3H),0.76(s,3H),0.55(d,J＝41.2Hz,2H)。

[0184] (39)N‑((4,6‑dimethyl‑2‑oxo‑1,2‑dihydropyridin‑3‑yl)methyl)‑6‑(1‑(dimethylamino)‑2,3‑

[0185] dihydro‑1H‑inden‑5‑yl)‑1‑isopropyl‑1H‑indazole‑4‑carboxamide(化合物4)的合成

[0186]

[0187] 50mL三颈瓶中加入中间体18(100mg,0.24mmol)、中间体5b(137mg,0.48mmol)、乙酸钾(35mg,0.36mmol)，12mL二氧六环水溶液(3:1)充分溶解，氮气鼓泡30min，加入Pd(pph3)2Cl2(8mg,0.01mmol)，抽真空三次，氮气保护100℃反应。采用终产物化合物1的反应条件和后处理方法，得到33mg白色固体，产率27.86％。

[0188] MS(ESI)m/z(％):498.20[M+H]+,520.20[M+Na]+。1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ11.57(s,1H),8.66(s,1H),8.37(s,1H),8.13(s,1H),7.97‑7.40(m,4H),7.31(s,1H),6.70(s,1H),5.89(s,1H),5.19(s,1H),4.78(s,1H),4.41(d,J＝22.8Hz,2H),3.04(d,J＝69.6Hz,
5H),2.32(s,2H),2.16(d,J＝38.1Hz,5H),1.78‑1.01(m,8H)。

[0189] (40)N‑((4,6‑dimethyl‑2‑oxo‑1,2‑dihydropyridin‑3‑yl)methyl)‑6‑(1‑(dimethylamino)‑2,3‑

[0190] dihydro‑1H‑inden‑5‑yl)‑1‑isopropyl‑1H‑indole‑4‑carboxamide(化合物5)的合成

[0191]

[0192] 50mL三颈瓶中加入中间体23(100mg,0.24mmol)、中间体5b(125mg,0.48mmol)、乙酸钾(35mg,0.36mmol)，12mL二氧六环水溶液(3:1)充分溶解，氮气鼓泡30min，加入Pd(pph3)2Cl2(8mg,0.01mmol)，抽真空三次，氮气保护100℃反应。采用中间体化合物1的反应条件和后处理方法，得到29mg白色固体，产率24.56％。

[0193] MS(ESI)m/z(％):497.40[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ11.57(s,1H),8.30(s,1H),7.93(d,J＝11.8Hz,1H),7.80(s,1H),7.75‑7.38(m,5H),6.88(s,1H),5.84(s,1H),
4.78(s,1H),4.30(s,2H),2.13(d,J＝17.8Hz,9H),1.38(s,8H),1.23(s,4H)。

[0194] (41)N‑((4,6‑dimethyl‑2‑oxo‑1,2‑dihydropyridin‑3‑yl)methyl)‑3‑(N‑[0195] ethylcyclopropanecarboxamido)‑2‑methyl‑5‑(1‑(4‑methylpiperazin‑1‑yl)‑2,3‑dihydro‑1H‑

[0196] inden‑5‑yl)benzamide(化合物6)的合成

[0197]

[0198] 50mL三颈瓶中加入中间体13(100mg,0.22mmol)、中间体5c(125mg,0.44mmol)、乙酸钾(32mg,0.33mmol)，12mL二氧六环水溶液(3:1)充分溶解，氮气鼓泡30min，加入Pd(pph3)2Cl2(7mg,0.01mmol)，抽真空三次，氮气保护100℃反应。采用终产物化合物1的反应条件和后处理方法，得到42mg白色固体，产率32.63％。

[0199] MS(ESI)m/z(％):596.40[M+H]+,618.3[M+Na]+。1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ11.51(s,1H),8.40(s,1H),7.66‑7.58(m,1H),7.56(s,1H),7.53(s,2H),7.32(d,J＝7.8Hz,1H),5.87(s,1H),4.29(t,J＝7.0Hz,3H),3.87(dd,J＝14.1,7.4Hz,1H),3.04‑2.62(m,3H),
2.45‑2.30(m,6H),2.26‑2.08(m,13H),2.02(dq,J＝14.7,8.4,7.4Hz,3H),1.39(s,1H),
1.03(d,J＝14.2Hz,3H),0.75(d,J＝4.1Hz,2H),0.57(dd,J＝20.2,5.6Hz,2H)。

[0200] (42)N‑((4,6‑dimethyl‑2‑oxo‑1,2‑dihydropyridin‑3‑yl)methyl)‑1‑isopropyl‑6‑(1‑(4‑methylpiperazin‑1‑yl)‑2,3‑

[0201] dihydro‑1H‑inden‑5‑yl)‑1H‑indazole‑4‑carboxamide(化合物7)的合成[0202]

[0203] 50mL三颈瓶中加入中间体18(100mg,0.24mmol)、中间体5c(125mg,0.48mmol)、乙酸钾(35mg,0.36mmol)，12mL二氧六环水溶液(3:1)充分溶解，氮气鼓泡30min，加入Pd(pph3)2Cl2(8mg,0.01mmol)，抽真空三次，氮气保护100℃反应。采用终产物化合物1的反应条件和后处理方法，得到32mg白色固体，产率24.63％。

[0204] MS(ESI)m/z(％):553.40[M+H]+,575.40[M+Na]+。1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ11.53(s,1H),8.64(s,2H),7.95(s,1H),7.85(s,1H),7.67‑7.58(m,2H),7.34(d,J＝7.8Hz,1H),5.88(s,1H),4.89(p,J＝6.6Hz,1H),4.42‑4.25(m,3H),2.89(ddt,J＝46.8,15.3,6.8Hz,
2H),2.47‑2.35(m,5H),2.28‑1.97(m,12H),1.58(s,5H),1.39(s,1H),1.25(d,J＝20.0Hz,
1H),1.00‑0.76(m,1H)。

[0205] (43)N‑((4,6‑dimethyl‑2‑oxo‑1,2‑dihydropyridin‑3‑yl)methyl)‑1‑isopropyl‑6‑(1‑(4‑

[0206] methylpiperazin‑1‑yl)‑2,3‑dihydro‑1H‑inden‑5‑yl)‑1H‑indole‑4‑carboxamide(化合物8)的合成

[0207]

[0208] 50mL三颈瓶中加入中间体23(100mg,0.24mmol)、中间体5c(125mg,0.48mmol)、乙酸钾(35mg,0.36mmol)，12mL二氧六环水溶液(3:1)充分溶解，氮气鼓泡30min，加入Pd(pph3)2Cl2(7mg,0.01mmol)，抽真空三次，氮气保护100℃反应。采用终产物化合物1的反应条件和后处理方法，得到42mg白色固体，产率31.53％。

[0209] MS(ESI)m/z(％):552.40[M+H]+,574.30[M+Na]+。1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ11.56(s,1H),8.31(t,J＝5.0Hz,1H),7.88(s,1H),7.76‑7.52(m,6H),7.32(d,J＝7.8Hz,1H),6.86(d,J＝3.1Hz,1H),5.88(s,1H),5.05‑4.83(m,1H),4.37(d,J＝5.0Hz,2H),4.29(t,J＝
6.8Hz,1H),3.03‑2.61(m,4H),2.22(s,4H),2.15‑2.00(m,11H),1.46(d,J＝6.6Hz,7H)。

[0210] (44)N‑(3‑(3‑(4,6‑dimethyl‑2‑oxo‑1,2‑dihydropyridin‑3‑yl)propanoyl)‑5‑(1‑((2S,6R)‑2,6‑

[0211] dimethylmorpholino)‑2,3‑dihydro‑1H‑inden‑5‑yl)‑2‑methylphenyl)‑N‑[0212] ethylcyclopropanecarboxamide(化合物9)的合成

[0213]

[0214] 50mL三颈瓶中加入中间体13(100mg,0.22mmol)、中间体5d(155mg,0.44mmol)、乙酸钾(32mg,0.33mmol)，12mL二氧六环水溶液(3:1)充分溶解，氮气鼓泡30min，加入Pd(pph3)2Cl2(7mg,0.01mmol)，抽真空三次，氮气保护100℃反应。采用终产物化合物1的反应条件和后处理方法，得到42mg白色固体，产率31.84％。

[0215] MS(ESI)m/z(％):611.40[M+H]+,633.40[M+Na]+。1H NMR(600MHz,DMSO‑d6)δ11.48(s,1H),8.35(s,1H),7.59‑7.49(m,4H),7.34(d,J＝7.7Hz,1H),5.86(s,1H),4.36‑4.24(m,3H),3.86(s,1H),3.56(d,J＝61.8Hz,2H),2.91(s,1H),2.81(s,1H),2.73(s,1H),2.36(d,J＝10.3Hz,1H),2.21(d,J＝12.3Hz,6H),2.15(s,4H),2.07‑2.01(m,2H),1.98(s,1H),1.20(d,J＝36.4Hz,2H),1.08‑0.94(m,10H),0.80‑0.69(m,2H),0.56(d,J＝33.6Hz,2H)。

[0216] (45)N‑((4,6‑dimethyl‑2‑oxo‑1,2‑dihydropyridin‑3‑yl)methyl)‑6‑(1‑((2S,6R)‑2,6‑

[0217] dimethylmorpholino)‑2,3‑dihydro‑1H‑inden‑5‑yl)‑1‑isopropyl‑1H‑indazole‑4‑

[0218] carboxamide(化合物10)的合成

[0219]

[0220] 以50mL三颈瓶中加入中间体18(100mg,0.24mmol)、中间体5d(171mg,0.48mmol)、乙酸钾(35mg,0.36mmol)，12mL二氧六环水溶液(3:1)充分溶解，氮气鼓泡30min，加入Pd(pph3)2Cl2(8mg,0.01mmol)，抽真空三次，氮气保护100℃反应。采用终产物化合物1的反应条件和后处理方法，得到21mg白色固体，产率15.63％。

[0221] MS(ESI)m/z(％):568.40[M+H]+,590.40[M+Na]+。1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ11.57(s,1H),8.64(s,2H),8.10‑7.81(m,2H),7.68(d,J＝30.2Hz,2H),7.36(s,1H),5.88(s,1H),4.90(s,1H),4.34(d,J＝24.4Hz,3H),3.17‑2.60(m,4H),2.39(s,1H),2.30‑2.00(m,7H),
1.88(d,J＝7.7Hz,1H),1.53(d,J＝30.6Hz,6H),1.22(s,2H),1.13‑0.66(m,7H)。

[0222] (46)N‑((4,6‑dimethyl‑2‑oxo‑1,2‑dihydropyridin‑3‑yl)methyl)‑6‑(1‑((2S,6R)‑2,6‑

[0223] dimethylmorpholino)‑2,3‑dihydro‑1H‑inden‑5‑yl)‑1‑isopropyl‑1H‑indole‑4‑carboxamide(h化合物11)的合成

[0224]

[0225] 50mL三颈瓶中加入中间体23(100mg,0.24mmol)、中间体5d(125mg,0.48mmol)、乙酸钾(35mg,0.36mmol)，12mL二氧六环水溶液(3:1)充分溶解，氮气鼓泡30min，加入Pd(pph3)2Cl2(8mg,0.01mmol)，抽真空三次，氮气保护100℃反应。采用终产物化合物1的反应条件和后处理方法，得到27mg白色固体，产率19.63％。

[0226] MS(ESI)m/z(％):567.40[M+H]+,589.40[M+Na]+。1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ11.58(s,1H),8.28(s,1H),8.02(d,J＝36.3Hz,1H),7.70(d,J＝69.8Hz,2H),6.83(s,1H),5.89(s,1H),5.37(d,J＝53.0Hz,1H),4.97(s,1H),4.52(d,J＝104.4Hz,6H),2.73(s,1H),2.18(d,J＝56.2Hz,10H),1.36(d,J＝105.8Hz,13H),0.94(d,J＝79.8Hz,3H)。

[0227] (47)N‑((4,6‑dimethyl‑2‑oxo‑1,2‑dihydropyridin‑3‑yl)methyl)‑3‑(N‑[0228] ethylcyclopropanecarboxamido)‑5‑(1‑(4‑methoxypiperidin‑1‑yl)‑2,3‑dihydro‑1H‑inden‑5‑

[0229] yl)‑2‑methylbenzamide(化合物12)的合成

[0230]

[0231] 50mL三颈瓶中加入中间体13(100mg,0.22mmol)、中间体5e(155mg,0.44mmol)、乙酸钾(32mg,0.33mmol)，12mL二氧六环水溶液(3:1)充分溶解，氮气鼓泡30min，加入Pd(pph3)2Cl2(7mg,0.01mmol)，抽真空三次，氮气保护100℃反应。采用终产物化合物1的反应条件和后处理方法，得到21mg白色固体，产率15.69％。

[0232] MS(ESI)m/z(％):611.40[M+H]+,633.40[M+Na]+。1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ11.56(s,1H),8.65(s,1H),8.36(s,1H),8.07(s,1H),7.84(s,1H),7.67(d,J＝19.4Hz,2H),7.36(s,1H),5.88(s,1H),5.15(s,1H),5.00(s,1H),4.36(d,J＝14.4Hz,4H),3.20(s,4H),2.34‑1.94(m,17H),1.82(s,3H),1.49(s,8H)。

[0233] (48)N‑((4,6‑dimethyl‑2‑oxo‑1,2‑dihydropyridin‑3‑yl)methyl)‑1‑isopropyl‑6‑(1‑(4‑

[0234] methoxypiperidin‑1‑yl)‑2,3‑dihydro‑1H‑inden‑5‑yl)‑1H‑indazole‑4‑carboxamide(化合物

[0235] 13)的合成

[0236]

[0237] 50mL三颈瓶中加入中间体18(100mg,0.24mmol)、中间体5e(171mg,0.48mmol)、乙酸钾(35mg,0.36mmol)，12mL二氧六环水溶液(3:1)充分溶解，氮气鼓泡30min，加入Pd(pph3)2Cl2(8mg,0.01mmol)，抽真空三次，氮气保护100℃反应。采用终产物化合物1的反应条件和后处理方法，得到25mg白色固体，产率18.64％。

[0238] MS(ESI)m/z(％):568.40[M+H]+,590.30[M+Na]+。1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ11.54(s,1H),8.39(s,1H),7.55(d,J＝11.2Hz,4H),5.87(s,1H),4.30(s,3H),3.86(d,J＝7.1Hz,1H),3.20(s,3H),3.00‑2.78(m,2H),2.20(d,J＝8.8Hz,7H),2.10(s,5H),1.84(s,2H),1.39(s,2H),1.20(d,J＝24.7Hz,2H),1.03(t,J＝7.1Hz,3H),0.92(s,1H),0.76(s,2H),0.58(d,J＝11.4Hz,2H)。

[0239] (49)N‑((4,6‑dimethyl‑2‑oxo‑1,2‑dihydropyridin‑3‑yl)methyl)‑3‑(N‑[0240] ethylcyclopropanecarboxamido)‑5‑(1‑(4‑(2‑methoxyethyl)piperazin‑1‑yl)‑2,3‑dihydro‑1H‑

[0241] inden‑5‑yl)‑2‑methylbenzamide(化合物14)的合成

[0242]

[0243] 50mL三颈瓶中加入中间体13(100mg,0.22mmol)、中间体5f(168mg,0.44mmol)、乙酸钾(32mg,0.33mmol)，12mL二氧六环水溶液(3:1)充分溶解，氮气鼓泡30min，加入Pd(pph3)2Cl2(7mg,0.01mmol)，抽真空三次，氮气保护100℃反应。采用终产物化合物1的反应条件和后处理方法，得到33mg白色固体，产率23.67％。

[0244] MS(ESI)m/z(％):640.40[M+H]+,662.40[M+Na]+。1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ11.51(s,1H),8.39(s,1H),7.95(s,1H),7.55(d,J＝12.7Hz,4H),7.33(d,J＝7.4Hz,1H),5.87(s,1H),4.11(s,3H),3.88(s,1H),3.21(s,4H),2.87(d,J＝31.7Hz,3H),2.40(s,6H),2.20(d,J＝9.0Hz,6H),2.08(d,J＝20.8Hz,6H),1.59‑1.08(m,4H),1.03(t,J＝7.0Hz,2H),0.75(s,
3H),0.58(d,J＝13.8Hz,2H)。

[0245] (50)N‑((4,6‑dimethyl‑2‑oxo‑1,2‑dihydropyridin‑3‑yl)methyl)‑1‑isopropyl‑6‑(1‑(4‑(2‑

[0246] methoxyethyl)piperazin‑1‑yl)‑2,3‑dihydro‑1H‑inden‑5‑yl)‑1H‑indazole‑4‑carboxamide(化合物15)的合成

[0247]

[0248] 50mL三颈瓶中加入中间体18(100mg,0.24mmol)、中间体5f(185.56mg,0.48mmol)、乙酸钾(35.36mg,0.36mmol)，12mL二氧六环水溶液(3:1)充分溶解，氮气鼓泡30min，加入Pd(pph3)2Cl2(8.06mg,0.01mmol)，抽真空三次，氮气保护100℃反应。采用终产物化合物1的反应条件和后处理方法，得到24mg白色固体，产率16.53％。

[0249] MS(ESI)m/z(％):597.40[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ11.54(s,1H),8.64(s,1H),8.37(s,1H),8.07(s,1H),7.85(s,1H),7.67(d,J＝23.0Hz,3H),7.34(s,1H),5.88(s,1H),4.34(d,J＝27.8Hz,5H),3.21(s,7H),2.90(d,J＝41.8Hz,4H),2.16(d,J＝38.2Hz,12H),1.23(s,6H)。

[0250] (51)N‑((4,6‑dimethyl‑2‑oxo‑1,2‑dihydropyridin‑3‑yl)methyl)‑1‑isopropyl‑6‑(1‑(4‑(2‑

[0251] methoxyethyl)piperazin‑1‑yl)‑2,3‑dihydro‑1H‑inden‑5‑yl)‑1H‑indole‑4‑carboxamide(化合物16)的合成

[0252]

[0253] 50mL三颈瓶中加入中间体23(100mg,0.24mmol)、中间体5f(186mg,0.48mmol)、乙酸钾(35mg,0.36mmol)，12mL二氧六环水溶液(3:1)充分溶解，氮气鼓泡30min，加入Pd(pph3)2Cl2(8mg,0.01mmol)，抽真空三次，氮气保护100℃反应。采用终产物化合物1的反应条件和后处理方法，得到25mg白色固体，产率17.65％。

[0254] MS(ESI)m/z(％):596.40[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ11.56(s,1H),8.30(s,1H),8.11‑7.89(m,1H),7.87‑7.72(m,1H),7.72‑7.46(m,2H),6.87(d,J＝2.8Hz,1H),5.85(s,1H),5.41(d,J＝75.7Hz,1H),4.96(d,J＝36.6Hz,1H),4.84‑4.62(m,1H),4.54(s,1H),
4.30(d,J＝4.4Hz,1H),3.56(d,J＝44.0Hz,7H),3.25‑2.94(m,2H),2.66(s,1H),2.20‑1.93(m,4H),1.80‑1.29(m,7H),1.23(s,7H),1.09‑0.99(m,2H),0.94‑0.69(m,3H)。

[0255] (52)5‑(1‑(4‑acetylpiperazin‑1‑yl)‑2,3‑dihydro‑1H‑inden‑5‑yl)‑N‑((4,6‑dimethyl‑2‑oxo‑1,2‑

[0256] dihydropyridin‑3‑yl)methyl)‑3‑(N‑ethylcyclopropanecarboxamido)‑2‑[0257] methylbenzamide(化合物17)的合成

[0258]

[0259] 50mL三颈瓶中加入中间体13(100mg,0.22mmol)、中间体5g(160mg,0.44mmol)、乙酸钾(32mg,0.33mmol)，12mL二氧六环水溶液(3:1)充分溶解，氮气鼓泡30min，加入Pd(pph3)2Cl2(7mg,0.01mmol)，抽真空三次，氮气保护100℃反应。采用终产物化合物1的反应条件和后处理方法，得到32mg白色固体，产率23.61％。

[0260] MS(ESI)m/z(％):624.30[M+H]+,646.30[M+Na]+。1H NMR(600MHz,DMSO‑d6)δ11.48(s,1H),8.36(s,1H),7.57(s,1H),7.52(d,J＝12.9Hz,3H),7.36(d,J＝7.7Hz,1H),5.87(s,1H),4.37‑4.29(m,3H),3.92‑3.83(m,1H),3.48(d,J＝17.3Hz,2H),2.97‑2.77(m,2H),2.43(s,1H),2.37(d,J＝1.9Hz,1H),2.32(s,1H),2.21(d,J＝11.7Hz,6H),2.11(s,3H),2.05(d,J＝7.5Hz,2H),1.97(s,3H),1.39(s,4H),1.03(t,J＝6.9Hz,4H),0.76(d,J＝3.8Hz,2H),
0.56(d,J＝20.4Hz,2H)。

[0261] (53)6‑(1‑(4‑acetylpiperazin‑1‑yl)‑2,3‑dihydro‑1H‑inden‑5‑yl)‑N‑((4,6‑dimethyl‑2‑oxo‑1,2‑

[0262] dihydropyridin‑3‑yl)methyl)‑1‑isopropyl‑1H‑indazole‑4‑carboxamide(化合物18)的合成

[0263] 50mL三颈瓶中加入中间体18(100mg,0.24mmol)、中间体5g(177mg,0.48mmol)、乙酸钾(35mg,0.36mmol)，12mL二氧六环水溶液(3:1)充分溶解，氮气鼓泡30min，加入Pd(pph3)2Cl2(7mg,0.01mmol)，抽真空三次，氮气保护100℃反应。采用终产物化合物1的反应条件和后处理方法，得到30mg白色固体，产率21.32％。

[0264] MS(ESI)m/z(％):581.30[M+H]+,603.30[M+Na]+。1H NMR(600MHz,DMSO‑d6)δ11.50(s,1H),8.62(d,J＝19.0Hz,2H),7.96(s,1H),7.85(s,1H),7.68‑7.58(m,2H),7.37(d,J＝7.7Hz,1H),5.87(s,1H),4.90(dt,J＝13.0,6.4Hz,1H),4.39‑4.34(m,3H),3.49(d,J＝
12.6Hz,1H),3.41(s,3H),2.90(ddt,J＝66.6,15.6,7.2Hz,2H),2.21(s,3H),2.11(s,3H),
2.05(q,J＝6.9Hz,2H),1.97(s,3H),1.58(d,J＝6.5Hz,7H),1.39(s,3H)。

[0265] (54)6‑(1‑(4‑acetylpiperazin‑1‑yl)‑2,3‑dihydro‑1H‑inden‑5‑yl)‑N‑((4,6‑dimethyl‑2‑oxo‑1,2‑

[0266] dihydropyridin‑3‑yl)methyl)‑1‑isopropyl‑1H‑indole‑4‑carboxamide(化合物19)的合成

[0267]

[0268] 50mL三颈瓶中加入中间体23(100mg,0.24mmol)、中间体5g(125mg,0.48mmol)、乙酸钾(35mg,0.36mmol)，12mL二氧六环水溶液(3:1)充分溶解，氮气鼓泡30min，加入Pd(pph3)2Cl2(7mg,0.01mmol)，抽真空三次，氮气保护100℃反应。采用终产物化合物1的反应条件和后处理方法，得到得33mg白色固体，产率23.58％。

[0269] MS(ESI)m/z(％):580.30[M+H]+,602.20[M+Na]+。1H NMR(600MHz,DMSO‑d6)δ11.53(s,1H),8.28(s,1H),7.89(s,1H),7.78‑7.50(m,5H),7.36(s,1H),6.87(s,1H),5.88(s,1H),4.95(d,J＝28.7Hz,2H),4.38(s,4H),2.91(d,J＝64.9Hz,3H),2.23(s,3H),2.17‑1.93(m,10H),1.47(s,8H)。

[0270] (55)N‑((4,6‑dimethyl‑2‑oxo‑1,2‑dihydropyridin‑3‑yl)methyl)‑5‑(1‑(4‑[0271] (dimethylamino)piperidin‑1‑yl)‑2,3‑dihydro‑1H‑inden‑5‑yl)‑3‑(N‑[0272] ethylcyclopropanecarboxamido)‑2‑methylbenzamide(化合物20)的合成[0273]

[0274] 50mL三颈瓶中加入中间体13(100mg,0.22mmol)、中间体5h(178mg,0.44mmol)、乙酸钾(35mg,0.33mmol)，12mL二氧六环水溶液(3:1)充分溶解，氮气鼓泡30min，加入Pd(pph3)2Cl2(8mg,0.01mmol)，抽真空三次，氮气保护100℃反应。采用终产物化合物1的反应条件和后处理方法，得到44mg白色固体，产率32.56％。

[0275] MS(ESI)m/z(％):624.30[M+H]+,646.30[M+Na]+。1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ11.51(s,1H),8.39(t,J＝4.9Hz,1H),7.52(d,J＝22.0Hz,4H),7.32(d,J＝7.8Hz,1H),5.87(s,1H),4.30(d,J＝4.5Hz,3H),3.86(dt,J＝15.4,8.2Hz,1H),3.50(s,1H),2.91(dt,J＝13.5,
6.1Hz,2H),2.80(dt,J＝16.1,7.8Hz,1H),2.26(d,J＝11.2Hz,1H),2.23‑2.16(m,12H),
2.09(d,J＝8.2Hz,4H),2.02(dt,J＝14.6,7.3Hz,3H),1.71(dd,J＝29.0,11.4Hz,2H),1.42(d,J＝22.5Hz,2H),1.25‑1.12(m,2H),1.03(t,J＝7.1Hz,3H),0.75(d,J＝4.1Hz,2H),
0.63‑0.50(m,2H)。

[0276] (56)N‑((4,6‑dimethyl‑2‑oxo‑1,2‑dihydropyridin‑3‑yl)methyl)‑6‑(1‑(4‑[0277] (dimethylamino)piperidin‑1‑yl)‑2,3‑dihydro‑1H‑inden‑5‑yl)‑1‑isopropyl‑1H‑indazole‑4‑

[0278] carboxamide(化合物21)的合成

[0279]

[0280] 50mL三颈瓶中加入中间体18(100mg,0.24mmol)、中间体5h(125mg,0.48mmol)、乙酸钾(35mg,0.36mmol)，12mL二氧六环水溶液(3:1)充分溶解，氮气鼓泡30min，加入Pd(pph3)2Cl2(7mg,0.01mmol)，抽真空三次，氮气保护100℃反应。采用终产物化合物1的反应条件和后处理方法，得到50mg白色固体，产率39.46％。

[0281] MS(ESI)m/z(％):581.30[M+H]+,603.30[M+Na]+。1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ11.54(s,1H),8.64(s,2H),7.95(s,1H),7.85(s,1H),7.64‑7.55(m,2H),7.33(d,J＝7.9Hz,1H),5.87(s,1H),4.90(p,J＝6.6Hz,1H),4.37(d,J＝4.5Hz,2H),4.31(t,J＝6.8Hz,1H),2.96‑
2.80(m,3H),2.26(d,J＝11.3Hz,1H),2.21(s,4H),2.16(s,7H),2.11(s,4H),2.02(d,J＝
7.0Hz,3H),1.57(d,J＝6.5Hz,6H),1.49(d,J＝6.5Hz,1H),1.39(s,3H)。

[0282] (57)N‑((4,6‑dimethyl‑2‑oxo‑1,2‑dihydropyridin‑3‑yl)methyl)‑6‑(1‑(4‑[0283] (dimethylamino)piperidin‑1‑yl)‑2,3‑dihydro‑1H‑inden‑5‑yl)‑1‑isopropyl‑1H‑indole‑4‑

[0284] carboxamide(化合物22)的合成

[0285]

[0286] 50mL三颈瓶中加入中间体23(100mg,0.24mmol)、中间体5h(125mg,0.48mmol)、乙酸钾(35mg,0.36mmol)，12mL二氧六环水溶液(3:1)充分溶解，氮气鼓泡30min，加入Pd(pph3)2Cl2(7mg,0.01mmol)，抽真空三次，氮气保护100℃反应。采用终产物化合物1的反应条件和后处理方法，得到47mg，产率32.48％。

[0287] MS(ESI)m/z(％):580.30[M+H]+,602.30[M+Na]+。1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ8.31(t,J＝4.9Hz,1H),7.89(s,1H),7.69(s,1H),7.61(dd,J＝11.3,8.2Hz,3H),7.33(d,J＝7.8Hz,1H),6.87(d,J＝3.2Hz,1H),5.88(s,1H),4.93(q,J＝6.6Hz,1H),4.37(d,J＝5.1Hz,
2H),4.32(d,J＝6.8Hz,1H),2.99‑2.87(m,3H),2.85(t,J＝7.8Hz,1H),2.61‑2.52(m,3H),
2.25(s,8H),2.22(s,3H),2.11(s,3H),2.04(t,J＝7.1Hz,2H),1.47(d,J＝6.7Hz,7H),1.39(s,2H)。

[0288] (58)N‑((4,6‑dimethyl‑2‑oxo‑1,2‑dihydropyridin‑3‑yl)methyl)‑5‑(1‑((2‑[0289] (dimethylamino)ethyl)(methyl)amino)‑2,3‑dihydro‑1H‑inden‑5‑yl)‑3‑(N‑[0290] ethylcyclopropanecarboxamido)‑2‑methylbenzamide(化合物23)的合成[0291]

[0292] 50mL三颈瓶中加入中间体13(100mg,0.24mmol)、中间体5i(148mg,0.48mmol)、乙酸钾(32mg,0.36mmol)，12mL二氧六环水溶液(3:1)充分溶解，氮气鼓泡30min，加入Pd(pph3)2Cl2(8mg,0.01mmol)，抽真空三次，氮气保护100℃反应。采用终产物化合物1的反应条件和后处理方法，得到34mg，产率24.56％。

[0293] MS(ESI)m/z(％):595.30[M+H]+,617.30[M+Na]+。1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ11.54(s,1H),8.39(t,J＝4.2Hz,1H),7.68‑7.37(m,4H),7.31(d,J＝7.7Hz,1H),5.87(s,1H),4.29(s,3H),3.87(dd,J＝13.4,6.7Hz,1H),3.65‑3.46(m,1H),2.85(dd,J＝36.9,6.9Hz,
3H),2.45(d,J＝11.1Hz,1H),2.20(d,J＝8.9Hz,6H),2.15‑1.99(m,6H),1.89(s,1H),1.56(dd,J＝33.7,11.4Hz,2H),1.40‑1.13(m,4H),1.02(t,J＝5.7Hz,5H),0.88(d,J＝6.2Hz,
3H),0.76(s,2H)。

[0294] (59)N‑((4,6‑dimethyl‑2‑oxo‑1,2‑dihydropyridin‑3‑yl)methyl)‑5‑(1‑((2‑[0295] (dimethylamino)ethyl)(methyl)amino)‑2,3‑dihydro‑1H‑inden‑5‑yl)‑3‑(N‑[0296] ethylcyclopropanecarboxamido)‑2‑methylbenzamide(化合物24)的合成[0297]

[0298] 50mL三颈瓶中加入中间体13(100mg,0.24mmol)、中间体5j(149mg,0.48mmol)、乙酸钾(32mg,0.36mmol)，12mL二氧六环水溶液(3:1)充分溶解，氮气鼓泡30min，加入Pd(pph3)2Cl2(7mg,0.01mmol)，抽真空三次，氮气保护100℃反应。采用终产物化合物1的反应条件和后处理方法，得到49mg，产率29.65％。

[0299] MS(ESI)m/z(％):598.30[M+H]+,602.30[M+Na]+。1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ11.56(s,1H),8.39(t,J＝4.8Hz,1H),8.06(s,1H),7.60‑7.46(m,3H),7.31(d,J＝7.8Hz,1H),5.86(s,1H),4.65(s,1H),4.40‑4.28(m,2H),3.86(dd,J＝13.6,7.0Hz,1H),3.50(s,3H),
3.04‑2.73(m,2H),2.43(d,J＝6.8Hz,1H),2.34(dd,J＝11.7,6.6Hz,2H),2.20(d,J＝
9.1Hz,4H),2.12(d,J＝14.2Hz,8H),2.06‑1.90(m,2H),1.46(s,1H),1.19(d,J＝22.3Hz,
5H),1.02(t,J＝7.1Hz,3H),0.93‑0.66(m,4H)。

[0300] (60)N‑((4,6‑dimethyl‑2‑oxo‑1,2‑dihydropyridin‑3‑yl)methyl)‑6‑(1‑((2‑[0301] (dimethylamino)ethyl)(methyl)amino)‑2,3‑dihydro‑1H‑inden‑5‑yl)‑1‑isopropyl‑1H‑

[0302] indazole‑4‑carboxamide(化合物25)的合成

[0303]

[0304] 50mL三颈瓶中加入中间体18(100mg,0.24mmol)、中间体5j(165mg,0.48mmol)、乙酸钾(35mg,0.36mmol)，12mL二氧六环水溶液(3:1)充分溶解，氮气鼓泡30min，加入Pd(pph3)2Cl2(8mg,0.01mmol)，抽真空三次，氮气保护100℃反应。采用终产物化合物1的反应条件和后处理方法，得到34mg，产率27.61％。

[0305] MS(ESI)m/z(％):555.30[M+H]+,572.20[M+Na]+。1H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ11.57(s,1H),8.66(d,J＝4.9Hz,1H),8.37(s,1H),8.08(d,J＝9.0Hz,1H),7.86(s,1H),7.68(dd,J＝19.0,10.9Hz,2H),7.36(d,J＝8.0Hz,1H),5.89(s,1H),5.17(p,J＝6.4Hz,1H),4.41(dd,J＝11.5,5.9Hz,3H),3.00‑2.81(m,2H),2.46(d,J＝7.2Hz,2H),2.40‑2.30(m,2H),2.22(s,3H),2.17(s,3H),2.12(s,10H),1.67(s,1H),1.58(d,J＝6.6Hz,1H),1.49(d,J＝
6.5Hz,5H)。

[0306] 实施例2体外抗肿瘤细胞活性

[0307] 对含有取代噻吩并嘧啶结构的化合物进行了体外抑制人弥漫大B淋巴瘤细胞(WSU‑DLCL‑2)、人B淋巴瘤细胞(SU‑DHL‑6)活性筛选。

[0308] 1)铺板操作：选取处于对数增长阶段的SU‑DHL‑6细胞，进行离心处理后去除上清液，然后添加1mL的培养基进行细胞重悬。接下来，从细胞悬液中取出100μL，与900μL培养基混合进行10倍稀释，并利用细胞计数板进行精确计数。之后，在96孔板中每孔接种100μL的4
细胞悬液，细胞密度为每孔1×10个细胞。接种完成后，将96孔板置于培养箱中，维持培养环境24h。

[0309] 2)样品准备阶段：精确称量待测试的化合物以及作为阳性对照的Tazematostat药物。首先，使用100μL的DMSO将样品完全溶解，随后添加50μL的Tween80以增强溶解性，并用RPMI‑1640基础培养基将总体积调整到2mL。充分摇匀后，确保溶液是澄清透明的，此时母液的浓度为1000μmol/L。

[0310] 3)药物添加步骤：将药物按照100μmol/L、10μmol/L、1μmol/L、0.1μmol/L、0.01μmol/L的浓度进行10倍梯度稀释，总共制备5个不同浓度的药物溶液。然后，在96孔板的每个孔中添加100μL的药物溶液，此时由于与孔中原有的培养基混合，药物浓度会进一步被稀释两倍，因此最终的测试浓度为50μmol/L、5μmol/L、0.5μmol/L、0.05μmol/L和0.005μmol/L。加药后，将细胞继续培养48h以便进行后续的检测。

[0311] 4)检测流程：在避光条件下，利用移液器向96孔板中的每个孔加入20μL的0.5％MTT溶液，然后将孔板放置在37℃的培养箱中孵育4h。之后，以1500转/分钟的速度离心5min，去除上清液。随后，在每个孔中加入150μL的DMSO溶液，并利用酶标仪振动5min以确保蓝紫色的MTT结晶完全溶解。最后，在490nm的波长下测量每个孔的光密度值。测量完成后，根据所得数据计算各个药物浓度下的细胞抑制率，并进一步确定药物的半数抑制浓度。

[0312] 表1化合物体外抗肿瘤细胞活性结果

[0313]