[0001] 本发明涉及一种哌嗪类化合物及其制备方法、药物组合物和应用，尤其涉及一种具有EZH2抑制活性的哌嗪类化合物及其制备方法、药物组合物和应用。

[0002] EZH2是多梳抑制复合体2(PRC2)的酶催化亚基，可以催化组蛋白H3赖氨酸27的三甲基化，从而导致染色质压实改变下游靶基因的表达。EZH2在细胞增殖、凋亡和衰老中的功能已被确定，在肿瘤病理生理中的重要作用也受到广泛关注。

[0003] 与正常组织相比，EZH2蛋白在癌症组织中的表达水平异常升高，因此EZH2作为癌症治疗中一个的标志物。虽然以EZH2为靶点已开发出不同类型的EZH2抑制剂。但是一些报道的EZH2抑制剂存在疗效差、分子量大、剂量大、生物利用度低等局限性。

[0060] 下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步说明。

[0061] 实施例1：双(2‑氯乙基)胺盐酸盐(化合物2)

[0062]

[0063] 在双颈烧瓶中加入二乙醇胺(2mL，20.9mmol，1eq)和氯仿8mL，0℃冰浴条件下，缓慢滴加2mL氯仿稀释的二氯亚砜(4.56mL，62.8mmol，3eq)，滴加结束后在室温下反应3h。然后在60℃下回流0.5h。冷却至室温，抽滤，真空干燥得白色固体双(2‑氯乙基)胺盐酸盐3.18g，产率：85.2％。

[0064] 实施例2：5‑溴‑2‑甲基‑3‑(哌嗪‑1‑基)苯甲酸甲酯盐酸盐(化合物4)的制备[0065]

[0066] 在双颈烧瓶中加入3‑氨基‑5‑溴‑2‑甲基苯甲酸甲酯(4.11g，168mmol，1eq)、双(2‑氯乙基)胺盐酸盐(3g，168mmol，1eq)和12ml正丁醇。升温回流，在120℃下反应72h。反应结束后，冷却至室温，混合物用少量甲醇稍微溶解，再倒入适量乙醚，析出大量固体，抽滤得到白色固体4.49g，产率：76.4％。

[0067] 实施例3：5‑溴‑2‑甲基‑3‑(哌嗪‑1‑基)苯甲酸甲酯(化合物5)的制备[0068]

[0069] 将上步反应得到的化合物4.49g(128mmol)，用40％氢氧化钠溶液调节pH值大于11。乙酸乙酯萃取后，再用饱和食盐水洗涤有机相，无水硫酸钠干燥，减压脱溶，得到黄色油状物4.01g，产率：89.5％。

[0070] 1H NMR(600MHz,DMSO‑d6)δ:7.03(d,J＝2.0Hz,1H),6.93(d,J＝2.0Hz,1H),3.81(s,3H),3.52(s,4H),3.17(s,4H),2.21(s,3H),1.24(s,1H).

[0071] 实施例4：3‑(4‑乙酰基哌嗪‑1‑基)‑5‑溴‑2‑甲基苯甲酸甲酯(化合物6)的制备[0072]

[0073] 将化合物5(1.77g，5mmol，1eq)溶解于5mL二氯甲烷溶液中，加入三乙胺(0.42mL，3mmol，1.5eq)并将混合物冷却至0℃。滴加乙酰氯(0.22mL，3mmol，1.5eq)。0.5h后让反应混合物升温至室温反应1h。减压过滤，真空干燥得到白色固体1.15g，产率65.1％。

[0074] 1H NMR(600MHz,DMSO‑d6)δ:7.58(d,J＝2.1Hz,1H),7.36(d,J＝2.2Hz,1H),3.83(s,3H),3.65‑3.50(s,4H),2.83(dt,J＝42.0,5.0Hz,4H),2.37(s,3H),2.04(s,3H).[0075] 实施例5：3‑(4‑乙酰基哌嗪‑1‑基)‑5‑溴‑2‑甲基苯甲酸(化合物7)的制备[0076]

[0077] 将化合物6(1.15g，3.37mmol，1eq)，50％氢氧化钠水溶液(2eq)和6mL甲醇溶液混合，在60℃回流2h，反应结束后，减压除溶。混合物溶于10mL水中，用盐酸酸化至pH＝1.0，抽滤收集沉淀物，真空干燥，得到白色固体0.79g，产率68.7％。

[0078] 1H NMR(600MHz,DMSO‑d6)δ:13.23(s,1H),7.56(d,J＝2.1Hz,1H),7.32(d,J＝2.1Hz,1H),3.57(s,4H),2.82(dt,J＝41.6,5.0Hz,4H),2.38(s,3H),2.04(s,3H).[0079] 实施例6：3‑(4‑乙酰基哌嗪‑1‑基)‑5‑溴‑N‑((4,6‑二甲基‑2‑氧代‑1,2‑二氢吡啶‑3‑基)甲基)‑2‑甲基苯甲酰胺(化合物8)的制备

[0080]

[0081] 将化合物7(0.57g，1.66mmol，1.2eq)、PyboP(1.08g，2.07mmol，1.5eq)、DIPEA(0.74mL，4.14mmol，3eq)溶于10mL无水DMF溶液中，将反应混合物在室温下搅拌活化30min后，加入3‑(氨基甲基)‑4,6‑二甲基吡啶‑2(1H)‑酮(0.21g，1.38mmol，1eq)，继续在室温下反应14h。经过薄层色谱法测定反应完全后，将反应混合物导入冷水100mL中搅拌30min，减压抽滤收集沉淀固体，用饱和食盐水(50mL)洗涤，干燥。粗产物经甲醇：二氯甲烷柱层析洗脱纯化得到所需浅褐色固体278mg，产率42.4％。

[0082] 1H NMR(600MHz,DMSO‑d6)δ:11.49(s,1H),8.24(t,J＝5.0Hz,1H),7.16(d,J＝2.1Hz,1H),7.09(d,J＝2.1Hz,1H),5.86(s,1H),4.25(d,J＝5.0Hz,2H),3.56(s,4H),2.80(dt,J＝42.8,5.0Hz,4H),2.19(s,3H),2.18(s,3H),2.11(s,3H),2.04(s,3H).

[0083] 实施例7：化合物C‑1的制备

[0084]

[0085] 在圆底烧瓶中依次加入化合物8(238mg，0.5mmol，1eq)、4‑氯苯硼酸(94mg，0.60mmol，1.2eq)、无水碳酸钠(64mg，0.6mmol，1.2eq)、1,4‑二氧六环(10mL)和水(1mL)的混合溶液，加入加四(三苯基膦)钯(0.56g，0.05mmol)后立即用氮气置换3次。反应混合物在
105℃下反应4h。经薄层色谱测定反应完成后，用水稀释，10％MeOH/DCM萃取，有机层经无水硫酸钠干燥，过滤后减压浓缩。粗产物经甲醇：二氯甲烷柱层析纯化得到灰白色产物91mg，产率43.1％(mp：201‑203℃)。

[0086] 化合物C‑1的检测数据如下：

[0087] 1H NMR(600MHz,DMSO‑d6)δ:11.49(s,1H),8.22(t,J＝4.9Hz,1H),7.70(d,J＝8.5Hz,2H),7.50(d,J＝7.1Hz,2H),7.29(d,J＝1.5Hz,1H),7.23(d,J＝1.6Hz,1H),5.86(s,
1H),4.29(d,J＝4.9Hz,2H),3.58(s,4H),2.95‑2.79(m,4H),2.27(s,3H),2.20(s,3H),2.11
13
(s,3H),2.05(s,3H). C NMR(150MHz,DMSO‑d6)δ:169.27,168.80,163.49,152.36,150.05,
143.26,140.05,137.36,136.84,136.82,129.31(2C),129.12(2C),122.03,120.81,
118.72,116.19,107.86,52.24,51.92,46.68,41.80,35.40,21.75,19.43,18.67,14.94.MS calcd for C28H31ClN4O3[M+H]+m/z:507.21630,found 507.21618.

[0088] 实施例8：化合物C‑2的制备

[0089]

[0090] 在圆底烧瓶中依次加入化合物8(238mg，0.5mmol，1eq)、4‑三氟甲基苯硼酸(114mg，0.60mmol，1.2eq)、无水碳酸钠(64mg，0.6mmol，1.2eq)、1,4‑二氧六环(10mL)和水(1mL)的混合溶液，加入加四(三苯基膦)钯(0.56g，0.05mmol)后立即用氮气置换3次。反应混合物在105℃下反应4h。经薄层色谱测定反应完成后，用水稀释，10％MeOH/DCM萃取，有机层经无水硫酸钠干燥，过滤后减压浓缩。粗产物经甲醇：二氯甲烷柱层析纯化得到灰白色产物94mg，产率41.8％(mp：203‑205℃)。

[0091] 化合物C‑2的检测数据如下：

[0092] 1H NMR(600MHz,DMSO‑d6)δ:11.48(s,1H),8.21(t,J＝4.9Hz,1H),7.70(d,J＝8.6Hz,2H),7.50(d,J＝8.6Hz,2H),7.29(d,J＝1.7Hz,1H),7.23(d,J＝1.7Hz,1H),5.86(s,
1H),4.29(d,J＝4.9Hz,2H),3.59(s,4H),2.87(dt,J＝44.3,4.6Hz,4H),2.27(s,3H),2.20
13
(s,3H),2.11(s,3H),2.05(s,3H). C NMR(150MHz,DMSO‑d6)δ:169.11,168.79,163.47,
152.50,150.06,144.33,143.27,140.23,136.76,130.52,127.89(2C),126.18(2C),
125.76,123.96,121.99,121.15,119.04,107.84,52.21,51.88,46.65,41.77,35.38,+
21.74,19.41,18.66,15.03.MS calcd for C29H31F3N4O3[M+H] m/z:541.24702,found 
541.24796.

[0093] 实施例9：化合物C‑3的制备

[0094]

[0095] 在圆底烧瓶中依次加入化合物8(238mg，0.5mmol，1eq)、4‑三氟甲基苯硼酸(84mg，0.60mmol，1.2eq)、无水碳酸钠(64mg，0.6mmol，1.2eq)、1,4‑二氧六环(10mL)和水(1mL)的混合溶液，加入加四(三苯基膦)钯(0.56g，0.05mmol)后立即用氮气置换3次。反应混合物在
105℃下反应4h。经薄层色谱测定反应完成后，用水稀释，10％MeOH/DCM萃取，有机层经无水硫酸钠干燥，过滤后减压浓缩。粗产物经甲醇：二氯甲烷柱层析纯化得到灰白色产物109mg，产率46.4％(mp：201‑203℃)。

[0096] 化合物C‑3的检测数据如下：

[0097] 1H NMR(600MHz,DMSO‑d6)δ:11.48(s,1H),8.20(t,J＝4.9Hz,1H),7.70(d,J＝8.7,5.5Hz,2H),7.27(t,J＝8.8Hz,3H),7.21(d,J＝1.5Hz,1H),5.86(s,1H),4.29(d,J＝4.9Hz,
13
2H),3.58(s,4H),3.01‑2.72(m,4H),2.27(s,3H),2.20(s,3H),2.11(s,3H),2.05(s,3H). C NMR(150MHz,DMSO‑d6)δ:169.26,168.79,163.47,152.35,150.03,143.25,140.04,137.34,
136.83,136.81,129.30,129.05(2C),122.01,120.79,118.70,116.03(2C),107.84,52.23,+
51.90,46.67,41.78,35.38,21.74,19.41,18.66,14.92.MS calcd for C28H31FN4O3[M+H]m/z:491.24302,found 491.24358.

[0098] 实施例10：化合物C‑4的制备

[0099]

[0100] 在圆底烧瓶中依次加入化合物8(238mg，0.5mmol，1eq)、3‑吡啶硼酸(73.7mg，0.60mmol，1.2eq)、无水碳酸钠(64mg，0.6mmol，1.2eq)、1,4‑二氧六环(10mL)和水(1mL)的混合溶液，加入加四(三苯基膦)钯(0.56g，0.05mmol)后立即用氮气置换3次。反应混合物在
105℃下反应4h。经薄层色谱测定反应完成后，用水稀释，10％MeOH/DCM萃取，有机层经无水硫酸钠干燥，过滤后减压浓缩。粗产物经甲醇：二氯甲烷柱层析纯化得到灰白色产物
83.3mg，产率40.7％(mp：196‑198℃)。

[0101] 化合物C‑4的检测数据如下：

[0102] 1H NMR(600MHz,DMSO‑d6)δ:11.49(s,1H),8.89(d,J＝1.5Hz,1H),8.55(d,J＝3.8Hz,1H),8.22(t,J＝4.8Hz,1H),8.08(d,J＝7.9Hz,1H),7.47(dd,J＝7.8,4.8Hz,1H),
7.35(s,1H),7.29(s,1H),5.87(s,1H),4.29(d,J＝4.8Hz,2H),3.59(s,4H),2.89(m,4H),
13
2.29(s,3H),2.21(s,3H),2.11(s,3H),2.05(s,3H). C NMR(150MHz,DMSO‑d6)δ:169.13,
168.81,163.48,152.55,148.89,148.09,143.30,140.21,135.76,135.25,134.54,130.14,
124.30,124.29,121.98,120.98,118.95,107.88,52.20,51.85,46.66,41.78,35.40,+
21.73,19.42,18.66,15.01.MS calcd for C27H31N5O3[M+H] m/z:474.24769,
found474.24753.

[0103] 实施例11：化合物C‑5的制备

[0104]

[0105] 在圆底烧瓶中依次加入化合物8(238mg，0.5mmol，1eq)、5‑甲基吡啶‑3‑硼酸(82.2mg，0.60mmol，1.2eq)、无水碳酸钠(64mg，0.6mmol，1.2eq)、1,4‑二氧六环(10mL)和水(1mL)的混合溶液，加入加四(三苯基膦)钯(0.56g，0.05mmol)后立即用氮气置换3次。反应混合物在105℃下反应4h。经薄层色谱测定反应完成后，用水稀释，10％MeOH/DCM萃取，有机层经无水硫酸钠干燥，过滤后减压浓缩。粗产物经甲醇：二氯甲烷柱层析纯化得到灰白色产物84.9mg，产率41.5％(mp：198‑202℃)。

[0106] 化合物C‑5的检测数据如下：

[0107] 1H NMR(600MHz,DMSO‑d6)δ:11.49(s,1H),8.68(d,J＝1.9Hz,1H),8.39(d,1H),8.21(t,J＝4.9Hz,1H),7.91(s,1H),7.35(d,J＝1.6Hz,1H),7.28(d,J＝1.6Hz,1H),5.87(s,1H),4.29(d,J＝4.9Hz,2H),3.59(s,4H),2.88(dt,J＝43.6,5.0Hz,4H),2.36(s,3H),
13
2.28(s,3H),2.21(s,3H),2.11(s,3H),2.05(s,3H). C NMR(150MHz,DMSO‑d6)δ:169.15,
168.78,163.48,152.52,150.05,149.23,145.27,143.26,140.22,135.29,135.21,134.85,
133.51,130.03,122.00,120.89,118.91,107.85,52.24,51.91,46.67,41.78,35.40,+
21.74,19.43,18.67,18.33,15.00.MS calcd for C28H33N5O3[M+H] m/z:488.26834,found488.26365.

[0108] 实施例12：化合物C‑6的制备

[0109]

[0110] 在圆底烧瓶中依次加入化合物8(238mg，0.5mmol，1eq)、4‑氰基硼酸(88.16mg，0.60mmol，1.2eq)、无水碳酸钠(64mg，0.6mmol，1.2eq)、1,4‑二氧六环(10mL)和水(1mL)的混合溶液，加入加四(三苯基膦)钯(0.56g，0.05mmol)后立即用氮气置换3次。反应混合物在
105℃下反应4h。经薄层色谱测定反应完成后，用水稀释，10％MeOH/DCM萃取，有机层经无水硫酸钠干燥，过滤后减压浓缩。粗产物经甲醇：二氯甲烷柱层析纯化得到灰白色产物
95.6mg，产率46.7％(mp：203‑205℃)。

[0111] 化合物C‑6的检测数据如下：

[0112] 1H NMR(600MHz,DMSO‑d6)δ:11.49(s,1H),8.24(s,1H),7.93(s,4H),7.91(s,1H),7.32(s,1H),5.86(s,1H),4.29(s,2H),3.61(s,4H),2.99‑2.91(m,4H),2.28(s,3H),2.20
13
(s,3H),2.11(s,3H),2.06(s,3H). C NMR(150MHz,DMSO‑d6)δ:169.20,168.78,163.48,
152.43,150.01,143.25,140.14,139.14,137.01,132.71,129.77,129.27(2C),128.87(2C),122.02,120.78,118.67,107.83,52.23,51.91,46.67,41.79,35.40,21.74,19.42,
18.67,14.96.MS calcd for C29H31N5O3[M+H]+m/z:498.25269,found498.25219.[0113] 实施例13：化合物C‑7的制备

[0114]

[0115] 在圆底烧瓶中依次加入化合物8(238mg，0.5mmol，1eq)、4‑甲氧基苯硼酸(91.2mg，0.60mmol，1.2eq)、无水碳酸钠(64mg，0.6mmol，1.2eq)、1,4‑二氧六环(10mL)和水(1mL)的混合溶液，加入加四(三苯基膦)钯(0.56g，0.05mmol)后立即用氮气置换3次。反应混合物在
105℃下反应4h。经薄层色谱测定反应完成后，用水稀释，10％MeOH/DCM萃取，有机层经无水硫酸钠干燥，过滤后减压浓缩。粗产物经甲醇：二氯甲烷柱层析纯化得到灰白色产物
91.5mg，产率43.4％(mp：201‑202℃)。

[0116] 化合物C‑7的检测数据如下：

[0117] 1H NMR(600MHz,DMSO‑d6)δ:11.49(s,1H),8.19(t,J＝4.9Hz,1H),7.63(d,J＝8.8Hz,1H),7.59(d,J＝7.1Hz,2H),7.27(d,J＝1.7Hz,1H),7.24(d,J＝1.6Hz,1H),5.87(s,
1H),4.29(d,J＝4.9Hz,2H),3.79(s,3H),3.59(s,4H),2.92‑2.81(m,4H),2.26(s,3H),2.21
13
(s,3H),2.11(s,3H),2.05(s,3H). C NMR(150MHz,DMSO‑d6)δ:169.40,168.78,163.48,
159.46,159.34,152.27,149.98,143.21,140.02,138.07(2C),132.72,128.16,122.05,
120.36,118.19,114.75(2C),107.83,55.65,52.25,51.94,46.68,41.80,35.38,21.74,
19.41,18.66,14.85.MS calcd for C29H34N4O4[M+H]+m/z:503.25801,found 503.25733.[0118] 实施例14：化合物C‑8的制备

[0119]

[0120] 在圆底烧瓶中依次加入化合物8(238mg，0.5mmol，1eq)、喹啉‑6‑硼酸(103mg，0.60mmol，1.2eq)、无水碳酸钠(64mg，0.6mmol，1.2eq)、1,4‑二氧六环(10mL)和水(1mL)的混合溶液，加入加四(三苯基膦)钯(0.56g，0.05mmol)后立即用氮气置换3次。反应混合物在
105℃下反应4h。经薄层色谱测定反应完成后，用水稀释，10％MeOH/DCM萃取，有机层经无水硫酸钠干燥，过滤后减压浓缩。粗产物经甲醇：二氯甲烷柱层析纯化得到灰白色产物
94.1mg，产率42.8％(mp：199‑201℃)。

[0121] 化合物C‑8的检测数据如下：

[0122] 1H NMR(600MHz,DMSO‑d6)δ:11.47(s,1H),8.95‑8.89(m,3H),8.28(d,J＝2.8Hz,1H),8.08(d,J＝8.6Hz,2H),7.45(d,J＝4.2Hz,2H),7.21(s,1H),5.84(s,1H),4.28(s,2H),
13
3.58(s,4H),2.94(m,4H),2.30(s,3H),2.18(s,3H),2.09(s,3H),2.02(s,3H). C NMR(150MHz,DMSO‑d6)δ:169.37,168.78,163.48,152.31,149.98,143.22,140.08,139.09,
138.30,137.45,137.15,135.04,129.96,129.93,128.96,126.99,126.92,126.89,122.05,
120.57,118.41,107.83,52.26,51.96,46.69,41.81,35.40,21.14,19.41,18.67,14.88.MS calcd for C31H33N5O3[M+H]+m/z:524.25334,found 524.25321.

[0123] 实施例15：化合物C‑9的制备

[0124]

[0125] 在圆底烧瓶中依次加入化合物8(238mg，0.5mmol，1eq)、4‑甲基苯硼酸(81.6mg，0.60mmol，1.2eq)、无水碳酸钠(64mg，0.6mmol，1.2eq)、1,4‑二氧六环(10mL)和水(1mL)的混合溶液，加入加四(三苯基膦)钯(0.56g，0.05mmol)后立即用氮气置换3次。反应混合物在
105℃下反应4h。经薄层色谱测定反应完成后，用水稀释，10％MeOH/DCM萃取，有机层经无水硫酸钠干燥，过滤后减压浓缩。粗产物经甲醇：二氯甲烷柱层析纯化得到灰白色产物
96.9mg，产率47.4％(mp：201‑203℃)。

[0126] 化合物C‑9的检测数据如下：

[0127] 1H NMR(600MHz,DMSO‑d6)δ:11.50(s,1H),8.20(t,J＝4.9Hz,1H),7.55(d,J＝8.1Hz,2H),7.26(d,J＝3.8Hz,2H),7.25(s,1H),7.21(s,1H),5.86(s,1H),4.29(d,J＝
4.9Hz,2H),3.59(s,4H),2.91‑2.76(m,4H),2.33(s,3H),2.27(s,3H),2.21(s,3H),2.11(s,
13
3H),2.05(s,3H). C NMR(150MHz,DMSO‑d6)δ:169.37,168.78,163.48,152.28,150.00,
143.50,143.23,140.04,138.37,137.77,128.95,128.75(2C),127.00(2C),122.03,
120.63,118.47,107.83,52.25,51.94,46.68,41.79,35.37,22.96,21.75,19.41,18.66,
16.13.MS calcd for:C29H34N4O3[M+H]+m/z:487.26309,found 487.26319.

[0128] 实施例16：化合物C‑10的制备

[0129]

[0130] 在圆底烧瓶中依次加入化合物8(238mg，0.5mmol，1eq)、4‑乙基苯硼酸(89.9mg，0.60mmol，1.2eq)、无水碳酸钠(64mg，0.6mmol，1.2eq)、1,4‑二氧六环(10mL)和水(1mL)的混合溶液，加入加四(三苯基膦)钯(0.56g，0.05mmol)后立即用氮气置换3次。反应混合物在
105℃下反应4h。经薄层色谱测定反应完成后，用水稀释，10％MeOH/DCM萃取，有机层经无水硫酸钠干燥，过滤后减压浓缩。粗产物经甲醇：二氯甲烷柱层析纯化得到灰白色产物
96.1mg，产率45.7％(mp：203‑204℃)。

[0131] 化合物C‑10的检测数据如下：

[0132] 1HNMR(600MHz,DMSO‑d6)δ:11.48(s,1H),8.18(t,J＝5.0Hz,1H),7.56(d,J＝8.2Hz,2H),7.28(d,J＝8.2Hz,2H),7.27(s,1H),7.21(d,J＝1.7Hz,1H),5.86(s,1H),4.30(d,J＝4.9Hz,2H),3.59(s,4H),2.93‑2.82(m,4H),2.68‑2.60(m,2H),2.27(s,3H),2.21(s,
13
3H),2.11(s,3H),2.05(s,3H),1.22‑1.18(m,3H). CNMR(150MHz,DMSO‑d6)δ:169.36,
168.78,163.47,152.28,150.00,143.50,143.22,140.04,138.37,137.76,128.95,128.75(2C),127.00(2C),122.03,120.63,118.47,107.83,52.25,51.94,46.68,41.79,35.37,+
28.28,21.75,19.41,18.66,16.13,14.90.MScalcdforC30H36N4O3[M+H] m/z:501.27874,found501.27975.

[0133] 实施例17：化合物的体外EZH2抑制活性评价

[0134] 1、实验方法

[0135] (1)分布细胞：将已经培养好的NCI‑H1975细胞消化，均匀接种于96孔板中，每孔中加入150μL的DMEM培养液，轻微震荡使得细胞分布均匀。

[0136] (2)培养细胞：置于标准细胞培养箱中，培养3天(观察细胞状态适时做出相应的调整)，直到细胞铺满单层。

[0137] (3)给药：加入浓度梯度的用DMSO配制的药物，每孔100μL。

[0138] (4)显色：培养24h后，取出细胞显微镜下观察状态，每孔加10μL浓度为5mg/mL的MTT溶液。继续孵育3h后，终止培养拿出处理，用PBS沿板壁冲洗3次，每孔加入80μL的DMSO溶液，摇床震荡20min。

[0139] (5)比色：选上机测定每孔的吸光度，并记录吸光度数值，利用软件计算得到IC50值。

[0140] 2、实验结果

[0141] 表1.化合物抑制NCI‑H1975肿瘤细胞增殖活性

[0142]化合物 IC50(μM)
Tazemetostat 3.42
C‑1 1.06
C‑2 0.39
C‑3 0.53
C‑4 1.63
C‑5 1.51
C‑6 0.92
C‑7 1.05
C‑8 2.32
C‑9 1.67
C‑10 2.56

[0143] 由表1可见，本发明的化合物与Tazemetostat相比具有更优的抑制活性，IC50值最优低于1μM，这说明本发明以Tazemetostat为先导化合物，对其进行优化改造策略的可行性。