具体技术细节
[0009] 针对现有技术中存在的问题，为克服现有动物模型的缺陷，本发明的目的在于解决用目前缺乏跟临床表型具备相近的肿瘤微环境的人源化原位肝癌模型，为了达到本发明的目的，本发明人利用质粒构筑、肝癌细胞液肝脏原位接种、HDI二次造模技术构建了一种人源化KRAS G12D原位肝癌动物模型。
[0010] 本发明的一方面提供了一种人源化KRAS G12D原位肝癌动物模型的构建方法，包括步骤：
[0011] 步骤(1)：KRAS G12D裸质粒DNA的设计、放大与纯化；
[0012] 步骤(2)：Huh6人肝母细胞瘤细胞液接种裸小鼠肝脏；
[0013] 步骤(3)：通过HDI二次造模建立人源化KRAS G12D转基因原位肝癌小鼠模型。
[0014] 优选的，步骤(1)中，所述KRAS G12D裸质粒是以人KRAS基因为参考序列，核苷酸序列GGT定点突变为GAT获得的KRAS G12D基因。
[0015] 进一步的，步骤(1)中，所述KRAS G12D裸质粒是在KRAS G12D基因起始密码之前加入Kozak序列，在终止密码5’端加入FLAG标签序列。
[0016] 所述Kozak序列优选为GCCACC的，FLAG标签序列为三个。
[0017] 优选的，步骤(1)中，在5’端设计序列为GGATCC的BamHI和3’端序列为CTCGAG的XhoI的酶切序列，连接至具有小鼠肝脏组织特异性启动子与增强子的pLC载体质粒DNA，转化DH5α感受态细胞，放大与纯化获得所述KRAS G12D裸质粒。
[0018] 步骤(2)中，优选的使用人肝母细胞瘤细胞株Huh6，将Huh6细胞移至培养瓶中培养，取对数期细胞消化制成细胞悬液，将所述细胞悬液接种至SPF级无胸腺Balb/c‑Nu裸小鼠肝脏。
[0019] 优选的，步骤(2)中，以0.25％胰酶消化细胞，制成每20μPBS悬浮2x106细胞的细胞悬液。
[0020] 步骤(3)中，Huh6人源化原位肝癌裸小鼠造模后，注射pLC‑KRAS G12D质粒DNA溶液，尾静脉HDI建立人源化KRAS G12D转基因原位肝癌小鼠模型。
[0021] 优选的，Huh6人源化原位肝癌裸小鼠造模4周后进行HDI二次造模。
[0022] 优选的，pLC‑KRAS G12D溶液溶剂为0.9％ NaCl生理盐水。
[0023] 优选的，配制相当小鼠体重10％体积的pLC‑KRAS G12D质粒DNA溶液，如体重30g小鼠的溶液体积为3ml。
[0024] 优选的，通过小鼠尾静脉HDI，5～8秒内快速将pLC‑KRAS G12D质粒DNA溶液，将表达人源化基因的KRAS G12D裸质粒递送至肝脏细胞中表达，建立人源化KRAS G12D转基因原位肝癌小鼠模型。
[0025] 本发明的另一方面，提供了一种人源化KRAS G12D原位肝癌动物模型。
[0026] 在一方面，本发明提供了一种人源化KRAS G12D原位肝癌动物模型的应用，在研究原位肝癌致病机理上的应用或者用于筛选原位肝癌药物中的应用。
[0027] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种结合人源化原位肝癌裸小鼠和KRAS G12D裸质粒HDI转基因的复杂模型，自造模起计算7周即可快速达到100％成瘤，人源化原位肝癌裸小鼠保留了原有的肝癌组织结构特点，有和临床病患HCC肿瘤更为相近的生长环境和生物学特点，能够很好的模拟肝癌细胞的免疫逃逸和侵袭转移能力等肿瘤微环境，适用于肝癌精准治疗的PROTAC靶向蛋白降解剂、小分子药物、小核酸药物和基因治疗领域等新药研发的复杂模型，能实现各种人类致癌基因引起肝癌人源化小鼠的高效和经济建模。利用本发明提供的技术方案，可以有效的构建过程简单、经济、有效、快速成模的人源化KRAS G12D基因过表达的原位肝癌裸小鼠模型，更佳地模拟人类HCC病患的肿瘤微环境，且填补人源化KRAS G12D基因和原位肝癌动物复杂模型的空白，利用此动物模型的临床前药效评价，更能真实的反应在人类病患的临床试验。进一步以此模型为基础，能开发人类HCC相关突变致癌基因各种的人源化致癌基因原位肝癌动物复杂模型的建模。
[0028] 本发明人源化KRAS G12D原位肝癌裸小鼠模型及其底层技术延伸的大动物模型，将是用以临床前评价KRAS G12D靶点抑制剂优选的模型之一，对人类健康肝癌治疗将提供巨大的贡献。
[0029] 本发明的有益效果在于：第一、本发明公开的模型，短期7周即可实现造模，且原位肝癌成瘤率100％，克服了化学诱导要长达一年的限制，克服现有特定点突变基因敲入小鼠多是免疫完全鼠不易原位肝癌接种二次造模的限制，实现短期造模缩短研发时间，甚至能缩短此靶点肝癌临床前药效评价的时间；第二、小鼠模型的肝脏病理，呈现了近似人类临床HCC的组织学特徵如肿瘤浸润淋巴细胞、坏死、血管浸润、马洛里小体和胆汁淤积等；第三、本发明公开的模型构建方法的过程简单、成本低，能降低研发成本；第四、本发明公开的模型构建方法，不但能导入单个致癌突变基因，还能具有同时导入多个基因的潜力；第五、本发明公开的模型能填补KRAS G12D加上HCC肝癌模型的空白；第六、本发明公开的模型构建方法具有应用于大动物模型的潜力；第七、本发明公开的模型能应用于已开发KRAS G12D抑制剂新药研发的肝癌适应症拓展。
[0030] 综上所述，本发明公开的人源化KRAS G12D原位肝癌动物模型的构建方法，能短期快速于7周成模且成瘤率100％，且呈现了近似人类临床HCC的组织学特徵，能应用于靶向KRAS G12D抑制剂抗肝癌药物的临床前药效评价，有利于人类肝癌疾病发病机理的研究和肝癌靶向药物治疗的发展。
法律保护范围
涉及权利要求数量14：其中独权3项，从权-3项
1.一种人源化KRAS G12D原位肝癌动物模型的构建方法，包括步骤：
步骤(1)：KRAS G12D裸质粒DNA的设计、放大与纯化；
步骤(2)：将Huh6人肝母细胞瘤细胞液接种裸小鼠肝脏；
步骤(3)：通过尾静脉HDI二次造模建立人源化KRAS G12D转基因原位肝癌小鼠模型。
2.根据权利要求1所述的构建方法，所述步骤(1)中，KRAS G12D裸质粒是以人KRAS基因为参考序列，核苷酸序列GGT定点突变为GAT获得KRAS G12D基因后得到的。
3.根据权利要求2所述的构建方法，进一步包括，所述KRAS G12D裸质粒是在KRAS G12D基因起始密码之前加入Kozak序列，在终止密码5’端加入FLAG标签序列后得到的。
4.根据权利要求3所述的构建方法，所述Kozak序列为GCCACC，所述FLAG标签序列为三个。
5.根据权利要求3所述的构建方法，进一步包括，在5’端设计序列为GGATCC的BamHI和
3’端序列为CTCGAG的XhoI的酶切序列，连接至具有小鼠肝脏组织特异性启动子与增强子的pLC载体质粒DNA，转化DH5α感受态细胞，放大与纯化后获得所述KRAS G12D裸质粒。
6.根据权利要求1所述的构建方法，步骤(2)中，使用人肝母细胞瘤细胞株Huh6，将Huh6细胞移至培养瓶中培养，取对数期细胞消化制成细胞悬液，将所述细胞悬液接种至SPF级无胸腺Balb/c‑Nu裸小鼠肝脏。
7.根据权利要求6所述的构建方法，将Huh6细胞移至培养瓶中培养后，以0.25％胰酶消
6
化细胞，制成每20μl PBS悬浮2x10细胞的细胞悬液。
8.根据权利要求1所述的构建方法，步骤(3)中，Huh6人源化原位肝癌裸小鼠造模后，注射pLC‑KRAS G12D质粒DNA溶液，尾静脉HDI进行二次造模建立人源化KRAS G12D转基因原位肝癌小鼠模型。
9.根据权利要求8所述的构建方法，其中Huh6人源化原位肝癌裸小鼠造模4周后进行HDI二次造模。
10.根据权利要求8所述的构建方法，所述pLC‑KRAS G12D质粒DNA溶液的溶剂为0.9％NaCl生理盐水。
11.根据权利要求10所述的构建方法，HDI注入相当小鼠体重10％体积的pLC‑KRAS G12D质粒DNA溶液。
12.根据权利要求11所述的构建方法，通过小鼠尾静脉HDI，5～8秒内快速将pLC‑KRAS G12D质粒DNA溶液，将表达人源化基因的KRAS G12D裸质粒递送至肝脏细胞中表达，建立人源化KRAS G12D转基因原位肝癌小鼠模型。
13.一种权利要求1‑12任一权利要求制备得到的人源化KRAS G12D原位肝癌动物模型。
14.一种权利要求13所述人源化KRAS G12D原位肝癌动物模型的应用，在研究原位肝癌致病机理上的应用或者用于筛选原位肝癌药物中的应用。
