[0001] 本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种人源化原位肝癌动物模型及其构建方法和应用。

[0002] 原发性肝癌(primary liver cancer，PLC)又称原位肝癌，是全球癌症相关的第三死因，其发病率呈上升趋势，预估到2025年罹患肝癌的病患，在全球范围内每年将成长大于一百万人。肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最常见的原发性肝癌形式，约占病例90％，它是一种预后较差的恶性肿瘤之一。HCC最常见的病因是乙型肝炎病毒(HBV)或丙型肝炎病毒(HCV)感染，由于患者使用抗病毒药物获得持续的病毒学应答(SVR，sustained virological response)，约占病例60％(Llovet JM,Kelley RK,Villanueva A,Singal AG,Pikarsky E,Roayaie S,Lencioni R,Koike K,Zucman‑Rossi J,Finn RS.Hepatocellular carcinoma.Nat Rev Dis Primers.2021；7(1):6)。

[0003] 随著高通量二代测序(NGS)的发展与普及，能够鉴定出具有致癌功能的癌症驱动基因，且初步应用在肝癌个人化风险预测。KRAS G12D的获得性功能突变(gain‑of‑function mutations)是驱动原发性肝癌的突变因子(factor)之一(D'Artista L,Moschopoulou AA,Barozzi I,Craig AJ,Seehawer M,Herrmann L,Minnich M,Kang TW,Rist E,Henning M,Klotz S,Heinzmann F,Harbig J,Sipos B,Longerich T,Eilers M,Dauch D,Zuber J,Wang XW,Zender L.MYC determines lineage commitment in KRAS‑driven primary liver cancer development.J Hepatol.2023；79(1):141‑149)；其他原发性肝癌驱动因子还包括TP53、CTNNB1和TERT等突变，HCC存在突变约占25％，然而这些突变尚未转化为临床实践。

[0004] G12D是最常见的KRAS激活突变，不仅仅是原发性肝癌，KRAS  G12D是腺癌(adenocarcinomas)中最常见的突变基因之一(Zeissig MN,Ashwood LM,Kondrashova O,Sutherland  KD.Next  batter  up！Targeting  cancers with KRAS‑G12D mutations.Trends Cancer.2023.pii:S2405‑8033(23)00137‑1)，随着KRAS G12D抑制剂进入临床试验，为了了解KRAS G12D癌症的生物学，确定免疫微环境如何影响治疗反应，一个有效评价的动物模型至关重要。然而针对KRAS G12D抑制剂的动物模型开发，大多为胰腺癌动物模型，且仅是皮下而非原位胰腺癌模型(Kemp SB,Cheng N,Markosyan N,Sor R,Kim IK,Hallin J,Shoush J,Quinones L,Brown NV,Bassett JB,Joshi N,Yuan S,Smith M,Vostrejs WP,Perez‑Vale KZ,Kahn B,Mo F,Donahue TR,Radu CG,Clendenin C,Christensen JG,Vonderheide RH,Stanger BZ.Efficacy of aSmall‑Molecule Inhibitor of KrasG12D in Immunocompetent Models of Pancreatic Cancer.Cancer Discov.2023；13(2):298‑311)，目前仍缺乏人源化KRAS G12D原位肝癌动物模型，然而原位肝癌模型较皮下肿瘤模型更趋于HCC临床病患的肿瘤微环境(Qiu R,Murata S,Cheng C,Mori A,Nie Y,Mikami S,Hasegawa S,Tadokoro T,Okamoto S,Taniguchi H.A Novel Orthotopic  Liver  Cancer Model  for  Creating a  Human‑like  Tumor Microenvironment.Cancers(Basel).2021；13(16)pii:cancers13163997)。

[0005] 现有的原位肝癌小鼠模型通过化学诱导，如二乙基亚硝胺(DEN)诱导成瘤的时间长达8个月至一年，而且还不是人源的仅是鼠源的原位肝癌模型，无法呈现人类肿瘤微环境。通过肝细胞特异性Alb‑Cre；KrasG12D转基因小鼠品系，自发的HCC成瘤时间约10个月，成模率46.2％(Ye H,Zhang C,Wang BJ,Tan XH,Zhang WP,Teng Y,Yang X.Synergistic function of Kras mutation and  HBx in initiation and progression  of hepatocellular carcinoma in mice.Oncogene.2014；33(43):5133‑8)，若再导入HBV X蛋白(HBx)，可提早至8个月成瘤，成模率62.5％。

[0006] 诱导的肝细胞癌(iHCC,induced HCC)大鼠模型，先建立原代人类肝细胞(PHH,primary human hepatocytes)后，使用慢病毒将MYC、TP53 R249S和KRAS G12D三个基因导入PHH基因组后，大鼠肝脏原位接种，再经过2～4个月建立iHCC大鼠模型(Jiang Z,Cheng L,Wu Z,Zhou L,Wang H,Hong Q,Wu Q,Long Y,Huang Y,Xu G,Yao Y,Tang Z,Zhang Z,Yang L,Luo W,Yang J,Gong L,Liu P,Chen X,Cui S,Zhang Q,Li Y,Li P.Transforming primary human hepatocytes into hepatocellular carcinoma with genetically defined factors.EMBO Rep.2022Jun7；23(6):e54275)，是目前比较成功的人源化原位肝癌大鼠模型，但造模时间自准备细胞、筛选、建模到成瘤至少需要6个月，且需要导入3个基因。

[0007] 现有的KRAS G12D基因敲入小鼠的底层小鼠模型使用的是免疫完全鼠如C57BL/6等(Kras‑G12D mice(Strain NO.T007054)on the GemPharmatech(Nanjing,China)Website.https://www.gempharmatech.com/shop/detail/11322.html)，免疫完全鼠对于异源细胞产生很强的免疫排斥，使用细胞液进行原位肝癌模型的造模成瘤率极低，一般都需要在免疫缺陷小鼠如裸小鼠上进行二次造模，因此目前市场上缺乏导入人源化KRAS G12D基因的人源化原位肝癌模型。

[0008] 美国西奈山伊坎医学院肿瘤学系，通过HDI裸质粒DNA建立9个人源化转基因HCC小鼠模型，以探讨MYC与TP53、CTNNB1、TERT、Kmt2b、Kmt2c、Pten、Axin1等的HCC驱动因子的相关性(Molina‑Sánchez P,Ruiz de Galarreta M,Yao MA,Lindblad KE,Bresnahan E,Bitterman E,Martin TC,Rubenstein T,Nie K,Golas J,Choudhary S,Bárcena‑Varela M,Elmas A,Miguela V,Ding Y,Kan Z,Grinspan LT,Huang KL,Parsons RE,Shields DJ,Rollins RA,Lujambio A.Cooperation Between Distinct Cancer Driver Genes Underlies  Intertumor  Heterogeneity  in  Hepatocellular Carcinoma.Gastroenterology.2020；159(6):2203‑2220.e14)，但仍缺乏人源化KRAS G12D转基因HCC小鼠模型。

[0041] 下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明。

[0042] 实施例1：KRAS G12D裸质粒DNA的设计与纯化

[0043] 以人KRAS基因(Genebank ID：NM_001369787.1)为参考序列，设计第12个氨基酸自甘氨酸(Glycine，Gly，G)突变为天冬氨酸(Aspartic acid，Asp，D)，相应核苷酸序列GGT定点突变为GAT，在KRAS G12D基因起始密码(ATG)之前设计了序列为GCCACC的Kozak序列，在人KRAS G12D基因的终止密码(TAA)5’端加入三个FLAG标签序列(SEQ ID NO.1)。最终，在5’端设计序列为GGATCC的BamHI和3’端序列为CTCGAG的XhoI的酶切序列，共657bp长度的设计，委托基因合成(南京金斯瑞生物科技有限公司)后通过酶切位点连接至pLC载体，成为全长4053bp长度的质粒DNA，详见图1。

[0044] 实施例2：Huh6原位肝癌裸小鼠模型的建模

[0045] 将人肝母细胞瘤细胞Huh6(浙江美森细胞科技有限公司，CTCC‑400‑0177)分装于2
数只底面积为75cm的培养瓶中，按常规方法培养，即用含10％胎牛血清的DMEM培养液，置
37℃、5％ CO2的恒温恒湿培养箱中培养。在细胞处于对数生长期时，以0.25％胰酶消化，收
6
集消化液，离心后去除上清液，PBS液洗2次后制成细胞悬液，调节至每20μl PBS悬浮2x10细胞液用于后续接种。

[0046] 使用SPF级无胸腺Balb/c‑Nu裸小鼠，雌性，周龄为4‑5周，体重为18‑22g[上海斯莱克，SCXK(沪)2022‑0004]，适应性饲养数天。将裸小鼠麻醉后取仰卧位固定于板上，腹部消6
毒后，延腹中线打开腹腔，暴露肝脏(一叶)，采用微量注射器抽取20μl(包含2x10个Huh6细胞/20μl PBS)细胞悬液，进针深度3mm(垂直距离肝叶表面的距离)，不可穿透肝叶，并保持注射角度小于30度，针头没入1cm及以上进行注射，缓慢注射细胞液，并留针5秒以上，拔针后棉球按压止血。缝合伤口，并消毒。动物放在37℃恒温加热板上待苏醒后放入笼中常规饲养。

[0047] 期间每三天秤体重且观察小鼠健康情况，至第四周触诊肝脏有硬物感似有肿瘤。

[0048] 实施例3：人源化KRAS G12D转基因原位肝癌裸小鼠模型的建模

[0049] Huh6人源化原位肝癌裸小鼠造模4周后，每只小鼠拟注射总体积为体重的10％液体，以0.9％ NaCl生理盐水为溶剂，配制20μg/只小鼠的pLC载体阴性对照组、2μg/只小鼠的pLC‑KRAS G12D低剂量模型组、20μg/只小鼠的pLC‑KRAS G12D高剂量模型组的质粒DNA溶液。用小鼠固定器固定小鼠，以45℃温水浸泡裸小鼠尾巴，暴露小鼠尾静脉后，通过小鼠尾静脉HDI，5～8秒内快速将相当小鼠体重10％体积的液体(例如30g裸小鼠的注射体积为3ml的质粒溶液)，将表达人源化基因的KRAS G12D裸质粒，递送至肝脏细胞中表达，建立人源化KRAS G12D转基因原位肝癌小鼠模型，二次造模流程详见图2。

[0050] 期间每三天秤体重且观察小鼠健康情况，至第7周触诊肝脏有明显肿瘤，部分模型已有瘦弱弓背等表型。7周解剖14只模型皆成瘤，成瘤率100％(图3)，将肿瘤与肝脏小心剥离，并且秤重，统计：(1)Huh6+pLC阴性对照组(n＝2)平均瘤重212.0mg、平均全肝重1733.0mg；(2)Huh6+pLC‑KRAS G12D 2μg低剂量模型组(n＝6)平均瘤重471.3mg、平均全肝重2029.5mg；(3)Huh6+pLC‑KRAS G12D 20μg高剂量模型组(n＝6)平均瘤重1022.3mg、平均全肝重2652.8mg。

[0051] 期间继续每三天秤体重且观察小鼠健康情况，至第9周触诊肝脏有更明显肿瘤，全部模型皆有瘦弱弓背等表型，至实验终点。解剖14只模型皆成瘤，成瘤率100％(图4)，将肿瘤与肝脏小心剥离，并且秤重，统计：(1)Huh6+pLC阴性对照组(n＝2)平均瘤重362.2mg、平均全肝重1955.9mg；(2)Huh6+pLC‑KRAS G12D 2μg低剂量模型组(n＝6)平均瘤重1365.7mg、平均全肝重3007.4mg；(3)Huh6+pLC‑KRAS G12D 20μg高剂量模型组(n＝6)平均瘤重2488.2mg、平均全肝重4032.1mg；从平均瘤重可看出KRasG12D转基因与原位肝癌表型有相关性(图5)。

[0052] 人源化KRAS G12D原位肝癌裸小鼠7周肝组织匀浆后，以Trizol法提取总RNA，反转录成1st‑cDNA后，以正向引物序列5’‑ACAAGACAGGGTGTTGATGATGC‑3’和位于三个FLAG标签(3xFlag)上的反向引物序列5’‑GTCCTTATCGTCGTCATCTTTGTAATCC‑3’，此组引物能特异性鉴定KRAS G12D‑3xFlag mRNA水平，与鼠源Actin mRNA相对定量后，结果表明高剂量模型组过表达人源化KRAS G12D‑3xFlag较载体阴性对照高161.0±13.78倍高，低剂量模型组则过表达107.2±7.20倍高，转基因mRNA水平与瘤子表型呈正相关(图6)。

[0053] 人源化KRAS G12D原位肝癌裸小鼠9周肝组织固定后，通过HE染色进行病理鉴定(图7)。大多数的肝癌肿瘤突出于肝脏表面，通过解剖可清晰看到肿瘤组织，其中白色是因胞质内大量脂肪或糖原的累积所呈透明细胞样外观(图3和4)，但少部分肝癌肿瘤从细胞液接种处往肝脏内部生长，形成了边界清晰呈马赛克样的肝脏实体瘤，当瘤子较小时如直径不到1mm(图7A，双箭头代表肿瘤直径)，则需要通过病理组织学检查如HE染色得以鉴定。人源化KRAS G12D原位肝癌裸小鼠9周肝组织，呈现了近似人类临床HCC的组织学特徵包括：①肿瘤浸润淋巴细胞(TILs；图7B，箭头)，是一种存在于肿瘤组织内部具有高度异质性的淋巴细胞，临床上TILs的数量与患者预后密切相关；②坏死区域(图7C)、③血管浸润或受侵(图7D，箭头)、④马洛里(Mallory‑Denk)小体(图7E，箭头)，是透明质酸小体，肝细胞癌高分化的特徵之一；以及⑤肿瘤细胞分泌胆汁，造成了黄绿色的胆汁淤积(图7F，箭头)。