[0003] 本公开一般涉及用于在测序期间进行模板捕获和扩增的策略。

[0004] 生物样品中存在的分析物(诸如核酸序列)的检测已被用作鉴定和分类微生物、诊断传染病、检测和表征遗传异常、鉴定与癌症相关联的遗传变化、研究对疾病的遗传易感
性，以及测量对各种类型的治疗的反应的方法。用于检测生物样品中的分析物(诸如核酸序
列)的常用技术是核酸测序。

[0005] 生物分子研究的进展部分地由用于表征分子或其生物反应的技术的改进引起。特别地，核酸DNA和RNA研究得益于对用于序列分析的技术的开发。

[0006] 核酸扩增方法是已知的，该方法允许将扩增产物固定在固体载体上，以便形成由簇或“集落”构成的阵列，该簇或“集落”由多个相同的固定多核苷酸链和多个相同的固定互补链形成。根据这些方法制备的簇阵列上的DNA集落中存在的核酸分子可提供用于测序反
应的模板。

[0007] 用于对多核苷酸模板进行测序的一种方法涉及使用DNA聚合酶进行多个延伸反应以将标记的核苷酸连续掺入模板链。在此类“合成测序”反应中，通过连续掺入与模板链互
补的单独核苷酸在5’至3’方向上构建与模板链碱基成对的新核苷酸链。

[0039] 以下特征适用于本公开的所有方面。

[0040] 本公开涉及将文库捕获(模板接种)与簇生成解耦以优化这两个过程。这通过在接种和成簇引物之间引入正交性来实现。

[0041] 本公开可用于测序，例如成对测序。适用于本公开的方法已描述于WO 08/041002、WO 07/052006、WO 98/44151、WO 00/18957、WO 02/06456、WO 07/107710、WO05/068656、
US13/661,524和US 2012/0316086中，其内容以引用方式并入本文。另外的信息可见于US 
20060024681、US200602926U、WO 06110855、WO 06135342、WO 03074734、WO07010252、WO 
07091077、WO 00179553和WO 98/44152中，其内容以引用方式并入本文。

[0042] 测序一般包括四个基本步骤：1)文库制备以形成多个可用于测序的模板分子；2)簇生成以在固体载体上形成扩增的单模板分子的阵列；3)对簇阵列进行测序；和4)数据分
析以确定靶标序列。

[0043] 文库制备是任何高通量测序平台中的第一步。在文库制备期间，将核酸序列(例如基因组DNA样品，或cDNA或RNA样品)转化到测序文库中，然后可以对其进行测序。以DNA样品
为例，文库制备的第一步是DNA样品的随机片段化。首先将样品DNA片段化并将特定大小(通
常为200bp至500bp，但也可以更大)的片段连接、亚克隆或“插入”在两个寡核苷酸衔接子
(衔接子序列)之间。这之后可以进行扩增和测序。原始样品DNA片段被称为“插入序列”。另选地，“标签化”可用于将样品DNA附接到衔接子。在标签化中，双链DNA同时被片段化并用衔接子序列和PCR引物结合位点标记。组合反应消除了在文库制备期间对单独的机械剪切步
骤的需要。在用衔接子序列修饰之前，靶多核苷酸也可以有利地进行大小分级。

[0044] 如本文所用，“衔接子”序列包含短序列特异性寡核苷酸，其作为文库制备的部分连接到测序文库中每个DNA(或RNA)片段的5’端和3’端。衔接子序列还可包含非肽接头。

[0045] 如技术人员将理解的，双链核酸通常将由两个互补的多核苷酸链形成，该两个互补多核苷酸链由通过磷酸二酯键连接的脱氧核糖核苷酸构成，但可另外包含一个或多个核
糖核苷酸和/或非核苷酸化学部分和/或非天然存在的核苷酸和/或非天然存在的主链键。
具体地讲，双链核酸可包括非核苷酸化学部分，例如在一条或两条链的5’端处的接头或间
隔子。作为非限制性示例，双链核酸可包括甲基化核苷酸、尿嘧啶碱基、硫代磷酸酯基团，也可包括肽偶联物等。可包括此类非DNA或非天然修饰以便赋予核酸一些期望的特性，例如以
实现对固体载体的共价、非共价或金属配位附接，或充当间隔子以将裂解位点定位成与固
体载体的最佳距离。单链核酸由一个此类多核苷酸链组成。在多核苷酸链仅与互补链部分
杂交的情况下，例如，与短核苷酸引物杂交的长多核苷酸链，其在本文中仍可被称为单链核
酸。

[0046] 典型的单链核酸模板的示例示于图1中。在一个实施方案中，模板在5’至3’方向上包括第一引物结合序列(例如P5)、索引序列(例如i5)、第一测序结合位点(例如SBS3)、插入
序列、第二测序结合位点(例如SBS12’)、第二索引序列(例如i7’)和第二引物结合序列(例
如P7’)。在另一个实施方案中，模板在3’至5’方向上包括第一引物结合位点(例如与P5互补的P5’)、索引序列(例如与I5互补的i5’)、第一测序结合位点(例如与SBS3互补的SBS3’)、插入序列、第二测序结合位点(例如与SBS12互补的SBS12)、第二索引序列(例如与I7互补的
i7)和第二引物结合序列(例如与P7’互补的P7)。任一模板在本文中被称为“模板链”或“单链模板”。如图1所示退火在一起的两条模板链在本文中称为“双链模板”。引物结合序列、索引序列和测序结合位点的组合在本文中被称为衔接子序列，并且单个插入序列侧接5’衔接
子序列和3’衔接子序列。

[0047] P5’引物结合序列和P7’引物结合序列与流动池表面上存在的短引物序列(或草坪引物(lawn primer))互补。P5’和P7’与它们的互补序列(P5和P7)在例如流动池表面上的结
合允许核酸扩增。如本文所用，“’”表示互补链。

[0048] 允许与扩增引物杂交的衔接子中的引物结合序列的长度通常为约20个至40个核苷酸，但在实施方案中，本公开不限于这种长度的序列。扩增引物的精确同一性，并且因此
衔接子中的同源序列对于本公开而言一般不重要，只要引物结合序列能够与扩增引物相互
作用以便引导PCR扩增即可。扩增引物的序列可对期望扩增的特定靶核酸具有特异性，但是
在其他实施方案中，这些序列可以为“通用”引物序列，其能够扩增具有已知或未知序列的
任何靶核酸，所述靶核酸已被修饰成能够用通用引物进行扩增。PCR引物的设计标准一般来
讲是本领域普通技术人员所熟知的。在本公开中，“引物结合序列”也可称为“成簇序列”、“成簇引物”或“簇引物”，并且这些术语可互换使用。

[0049] 索引序列(也称为条形码或标签序列)是独特的短DNA序列，其在文库制备期间被添加到每个DNA片段中。独特的序列允许许多文库汇集在一起并同时测序。在最终数据分析
之前，基于它们的条形码，鉴定并计算分类来自汇集文库的测序读数。当处理小基因组或靶
向感兴趣的基因组区域时，文库多路复用也是有用的技术。与条形码的多路复用可以指数
地增加在单次运行中分析的样品的数目，而不显著增加运行成本或运行时间。标签序列的
示例见于WO05068656中，其内容全文以引用方式并入本文。可以在第一次读取结束时通过
与索引读取引物杂交来读取标签，或在第二次读取结束时通过使用表面引物作为索引读取
引物P7来读取标签。本公开不受每个簇的读数数目的限制，例如每簇两个读数：每个簇三个
或更多个读数可简单地通过使第一延伸测序引物去杂交并且在簇再引种/链再合成步骤之
前或之后再杂交第二引物来获得。制备用于索引的合适样品的方法描述于例如US60/
899221中。也可以使用单索引或双索引。使用单索引，可使用多达48个独特的6‑碱基索引来产生多达48个独特标记的文库。使用双索引，可以组合使用多达24个独特的8‑碱基索引1序
列和多达16个独特的8‑碱基索引2序列来产生多达384个独特标记的文库。也可以使用索引
对，使得每个i5索引和每个i7索引仅使用一次。使用这些独特的双索引，有可能鉴定和过滤
索引的跳变读数，从而在多路复用样品中提供甚至更高的置信度。

[0050] 测序结合位点是测序和/或索引引物结合位点并且指示测序读取的起始点。在测序期间，测序引物与模板链上的测序结合位点的一部分退火(即杂交)。DNA聚合酶与这个位
点结合并将互补核苷酸逐碱基掺入到生长的相反链中。在一个实施方案中，测序过程包括
第一测序读取和第二测序读取。第一测序读取可包括第一测序引物(读取1测序引物)与第
一测序结合位点(例如SBS3’)的结合，随后是互补链的合成和测序。这导致插入序列的测
序。在第二步中，索引测序引物(例如i7测序引物)结合到第二测序结合位点(例如SBS12)，
从而导致索引序列的合成和测序(例如i7引物的测序)。第二测序读取可包括索引测序引物
(例如i5测序引物)与模板上的第一测序结合位点的互补序列(例如SBS3)的结合，以及索引
序列(例如i5)的合成和测序。在第二步中，结合到引物(例如i7测序引物)的互补序列的第
二测序引物(读取2测序引物)结合到第二测序结合位点(例如SBS12')，从而导致在反向方
向上的插入序列的合成和测序。

[0051] 一旦形成双链核酸模板文库，通常将使该文库经受变性条件以提供单链核酸。适合的变性条件对于技术人员而言将是显而易见的，参考标准分子生物学方案(Sambrook等
人，2001，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第三版，Cold Spring Harbor 
Laboratory Press,Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY；Current Protocols，
Ausubel等人编辑)。在一个实施方案中，使用化学变性，诸如NaOH或甲酰胺。在另一个实施
方案中，通过加热使DNA热变性。

[0052] 在变性后，单链模板文库可以在游离溶液中接触到包含表面捕获部分(例如P5引物和P7引物)的固体载体上。这种固体载体通常是流动池，尽管在可选的实施方案中，可以
使用例如微珠等在分流池外进行接种和成簇。

[0053] 如本文所用，术语“固体载体”是指不溶于水性液体的刚性基底。该基底可以为无孔的或多孔的。该基底可任选地能够吸收液体(例如，由于孔隙率)，但是通常将足够刚性，
使得基底在吸收液体时不显著膨胀，并且在通过干燥去除液体时基本上不收缩。无孔固体
载体一般来讲对液体或气体不可渗透。示例性固体载体包括但不限于玻璃和改性或官能化
的玻璃、塑料(包括丙烯酸、聚苯乙烯以及苯乙烯和其他材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚TM
丁烯、聚氨酯、特氟隆 、环烯烃、聚酰亚胺等)、尼龙、陶瓷、树脂、Zeonor、二氧化硅或基于二氧化硅的材料(包括硅和改性硅)、碳、金属、无机玻璃、光纤束和聚合物。特别有用的材料为玻璃。其他合适的基底材料可包括聚合物材料、塑料、硅、石英(熔融石英)、硼浮法玻璃、二氧化硅、基于二氧化硅的材料、碳、金属(包括金)、光纤或光纤束、蓝宝石或塑性材料，诸如COC和环氧化物。可基于特定用途所期望的特性来选择特定材料。例如，对期望波长的辐射
是透明的材料可用于将利用期望波长的辐射的分析技术，诸如本文所阐述的技术中的一种
或多种。相反，可能期望选择不通过特定波长的辐射的材料(例如，不透明的、吸收性的或反射性的)。这可用于形成待在结构化基底的制造期间使用的掩模；或用于使用结构化基底进
行的化学反应或分析检测。可利用的材料的其他特性是对下游过程中使用的某些试剂的惰
性或反应性；或在制造加工期间易于操作或低成本。可用于本公开的结构化基底或方法中
的材料的另外的示例描述于美国序列号13/661,524和美国专利申请公开号2012/
0316086A1；这些文献中的每一篇文献均以引用方式并入本文。

[0054] 本公开可利用由基底或基质(例如，载玻片、聚合物小珠等)构成的固体载体，该基底或基质已例如通过施加包含反应性基团的中间材料层或涂层被官能化，这些反应性基团
允许共价附接到生物分子，诸如多核苷酸。此类载体的示例包括但不限于基底，诸如玻璃。
在此类实施方案中，生物分子(例如，多核苷酸)可直接共价附接到中间材料，但该中间材料
本身可非共价附接到基底或基质(例如，玻璃基底)。术语“共价附接到固体载体”应相应地
被解释为涵盖这种类型的布置。另选地，可处理基底(诸如玻璃)以允许生物分子的直接共
价附接；例如，玻璃可用盐酸处理，从而暴露玻璃的羟基基团，并且亚磷酸三酯化学物质被
用于经由玻璃的羟基基团与核苷酸的磷酸基团之间的共价键将核苷酸直接附接到玻璃。

[0055] 在其他实施方案中，固体载体可以通过施用包含允许非共价附接到生物分子的基团的中间材料的层或涂层来“官能化”。在这样的实施方案中，固体载体上的基团可以与生
物分子(例如多核苷酸)上的对应基团形成离子键、氢键、疏水相互作用、π‑π相互作用、范德瓦尔斯相互作用(van der Waals interaction)和主体‑客体相互作用中的一种或多种。在
固体载体上的基团和生物分子上的对应基团之间形成的相互作用可以被配置为在旨在使
用载体的条件下(例如在需要核酸扩增和/或测序的应用中)引起固定或附接。例如，在固体
载体上的基团和生物分子上的对应基团之间形成的相互作用可以被配置为使得生物分子
在扩增和/或测序期间保持附接到固体载体。

[0056] 在其他实施方案中，可以通过应用包含允许通过金属配位键附接到生物分子的基团的中间体材料来“官能化”固体载体。在这样的实施方案中，固体载体上的基团可以包括
配体(例如金属配位基团)，其能够与生物分子上的金属部分结合。另选地或另外，固体载体
上的基团可包括金属部分，其能够与生物分子上的配体结合。在配体和金属部分之间形成
的金属‑配位相互作用可以被配置为在旨在使用载体的条件下(例如在需要核酸扩增和/或
测序的应用中)引起生物分子的固定或附接。例如，在固体载体上的基团和生物分子上的对
应基团之间形成的相互作用可以被配置为使得生物分子在扩增和/或测序期间保持附接到
固体载体。

[0057] 当提及将分子(例如，核酸)固定或附接到固体载体时，术语“固定的”和“附接的”在本文中可互换使用，并且除非另外明确地或通过上下文指明，否则这两个术语旨在涵盖直接或间接、共价或非共价附接。在本公开的某些实施方案中，共价附接可以是优选的；在
其他实施方案中，使用非共价相互作用的附接可以是优选的；在又其他实施方案中，使用金
属配位键的附接可以是优选的。一般来说，分子(例如，核酸)在旨在使用载体的条件下(例
如，在需要核酸扩增和/或测序的应用中)保持固定或附接到载体。当提及核酸对其他核酸
的附接时，则本文使用术语“固定的”和“杂交的”，并且一般来讲是指互补核酸之间的氢键合。

[0058] 如果用单个或多个可延伸引物在珠子上进行扩增，则可以在溶液中、在微量滴定板或微微量滴定板的各个孔中分析珠子，将珠子固定在各个孔中，例如固定在光纤型装置
中，或作为阵列固定在固体载体上。固体载体可以是平坦表面，例如显微镜载片，其中珠子
随机沉积并且用聚合物膜(例如琼脂糖或丙烯酰胺)保持在适当位置。

[0059] 如上所述，一旦制备了包含模板核苷酸链的文库，就将模板接种到固体载体上，然后扩增以产生单模板分子簇。

[0060] 作为简单的示例，在附接P5引物和P7引物之后，可以在允许模板和固定引物之间杂交(或退火，这些术语可以互换使用)的条件下使固体载体与待扩增的模板接触。通常在
合适的杂交条件下在自由溶液中添加模板，这对于技术人员将是显而易见的。通常，杂交条
件是例如在40℃下5xSSC。然后可以进行固相扩增。扩增的第一步是引物延伸步骤，其中核
苷酸被添加到使用模板的固定引物的3’端以产生完全延伸的互补链。然后通常将模板从固
体载体上洗掉。互补链在其3’端处包括一个引物结合序列(即P5’或P7’)，该序列能够桥接到固定在固体载体上的第二引物分子上并与其结合。另一轮扩增(类似于标准PCR反应)导
致形成与固体载体结合的模板分子的簇或集落。

[0061] 本公开涉及新的文库制备、文库捕获(模板接种)和簇生成技术。本公开使得能够将模板接种与簇生成解耦，并且优化一个或两个过程。这通过在接种捕获剂和成簇引物之
间引入正交性来实现。

[0062] 如上所述，先前的方法利用接枝到基底表面的标准引物(P5/P7)来实现由于模板上互补序列(P5’和P7’)的存在而导致的文库捕获(接种)和随后的簇生成。因此，用于簇生
成的引物也用作文库模板捕获部分。接种和成簇的这种相互依赖使这些过程的优化复杂
化。

[0063] 在一个实施方案中，P5引物结合序列的序列包括SEQ ID NO:1或其变体，P5’衔接子的序列包括SEQ ID NO:3或其变体，P7衔接子的序列包括SEQ ID NO:2或其变体，并且P7’
衔接子的序列包括SEQ ID NO:4或其变体。

[0064] 在实施方案中，变体与SEQ ID NO:1、2、3或4具有至少80％的序列同一性。更优选地，该变体与SEQ ID NO:1、2、3或4具有至少86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、
94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的总序列同一性。

[0065] 举例来说，可能需要增加测序信号强度(例如响应于降低纳米孔尺寸)。实现这一点的策略是增加引物密度以通过最大化每个纳米孔扩增模板的数目来促进扩增。这在图2A
中呈现，其中显示了相对于接枝引物输入的每个纳米孔的模板数目。增加的引物密度的影
响示出在图2B中，其示出增加的引物密度可导致成簇时间的减少(周转时间或TAT的减少)。
然而，由于接枝引物也用作模板接种的捕获探针，并且杂交动力学受每个纳米孔的捕获探
针数目的影响，改变引物密度影响接种效率。这在图2C中示出，其中相对于引物密度示出了
通过过滤器平均值％(％PF)。％PF是在测序期间纳米孔被成功“读取”的能力的量度。随着
接枝密度增加，％PF开始增加，随后迅速下降，这是由于孔内多克隆性的增加导致清晰可读
的靶信号的减少。换句话讲，随着引物密度增加，两个或更多个模板杂交到孔表面上的可能
性增加。多于一种模板的存在增加了两种模板被扩增的可能性，导致多克隆性以及增加了
信号强度降低或不可读的可能性。％PF因此可用于测量克隆性的程度。为了避免疑问，虽然
上面提到了纳米孔，但是相同的概念适用于任何固体载体。

[0066] 因此，增加引物密度不仅转化为扩增模板数目的增加，而且转化为每个纳米孔接种分子数目的增加。因此，随着纳米孔变得更亮，它们也变得更加多克隆。这在图3中图示。
左侧图像示出包含多种引物(例如P5引物和P7引物)的代表性流动池表面。单个模板(例如
ss‑DNA)与流动池表面上的引物杂交。在典型的测序方法后，延伸模板，然后使用基底表面
上的游离P5/P7引物成簇以形成克隆(即单克隆)ss‑DNA簇，其然后可以被测序。可以看出，
引物密度随着图中从左向右移动而增加。在扩增期间，增加的引物密度导致更大的簇和序
列强度的增加。然而，这也导致多种模板杂交到表面上的可能性增加。如果两个不同的模板
杂交并且都在纳米孔内形成簇，则纳米孔将含有不同DNA样品的混合物，即单个孔将是多克
隆的(如第二表示和第三表示中所示)。如果多克隆性太高(例如，单个克隆家族的强度不足
以在测序期间提供正确的读数)，则读数将是不确定的或不正确的。这降低了平均百分比％
PF，并且因此增加了在测序运行中不包含可测量数据的读数的数目。由于文库杂交至少部
分是引物密度的函数，然后随着流动池中密度的增加，多文库接种和多克隆性的可能性也
增加。

[0067] 本公开已经确定了一种通过消除接种和成簇的相互依赖性来克服这些问题的方法，从而允许优化测序强度和模板文库接种。这通过在用于接种的捕获位点和用于扩增的
引物之间引入正交性来实现。图4中图示了一个示例。使用正交接种捕获部分，其将接种与
成簇解耦并将P5/P7再用作排他性“成簇”引物。通过将接种与成簇解耦，有可能增加成簇密度(例如P5/P7)以最大化信号强度，同时保持接种密度恒定以维持最佳克隆性。

[0068] “正交”是指用于将模板文库固定到流动池表面的捕获机制不同于用于产生簇的引物。也就是说，在簇生成期间使用的引物也不用作接种步骤的捕获部分。这些步骤相反被
解耦，使得消除了接种和成簇的相互依赖性。

[0069] 在接种期间可使用任何合适的正交捕获机制，条件是捕获机制与成簇引物正交。非限制性示例包括使用不同于任一成簇引物的寡核苷酸序列的基于核苷酸的方法，或基于
非核苷酸的结合方法，例如化学捕获(诸如生物素/链霉亲和素)、点击化学等。

[0070] 核苷酸结合

[0071] 在实施方案中，正交寡核苷酸用于接种以捕获模板(例如，正交序列或接种序列)。流动池表面上的这种接种序列可被命名为PX，文库模板上的互补序列被命名为PX’。可以使
用任何合适的接种序列。图5中示出了示例性的设置。

[0072] 本公开可以掺入到标准文库模板上。例如，标准PCR模板示于图1中。向标准文库中添加PX’，其基本上与接枝到基底上的PX基序互补。在正交捕获序列(PX’)和成簇序列(P5/
P7)之间包括不能被DNA聚合酶绕过的区域。这种区域的一个示例是将PX’序列(接种)与成
簇序列(P5/P7)分开的PEG接头。通常使用的基于PCR的DNA聚合酶不能绕过PEG接头，从而在
复制PX’序列之前终止DNA聚合。其他连接策略是可能的，以确保PX’不被延伸。这允许PX’保持单链并在所有时间都可用于杂交。

[0073] “互补”是指阻断寡核苷酸具有可通过将碱基对与衔接子或引物序列或其部分匹配而形成双链结构的核苷酸序列。“基本上互补”是指阻断核苷酸与互补序列具有至少
85％、90％、95％、98％或99％或100％总体序列相同。

[0074] 下文鉴定示例性的间隔子/接头。

[0075] 因此，根据本公开，基因组模板可作为双链DNA接种。这与需要dsDNA变性以形成用于接种的ssDNA的现有方法相反。这种差异是由于P5/P7’引物位于dsDNA区域内，因此在接
种期间不能接近P5/P7表面引物。

[0076] 为了产生正交模板文库，可以使用包含A‑L‑P的PX’引物，其中A表示PX’寡核苷酸，L表示接头，并且P表示与接头区域内的引物结合序列互补的序列(例如与P5’或P7’互补的序列)。

[0077] 图6A中示出了根据本公开的示例性的基于PCR的文库制备策略。在这个示例中，如上所述制备双链模板，包括片段化文库并将衔接子序列连接到插入序列。这产生在其5’和
3’端处侧接包含引物结合序列的衔接子序列的插入序列。一旦文库形成，就使文库变性并
在PCR富集期间引入正交模板(A‑L‑P)。如图6A中所示，引物结合序列P的互补序列结合(退
火)模板链中的其互补序列(例如P5’或P7’)。P7引物或P5引物的延伸产生了在5’端处附接
有PX‑L的双链模板。上述变性、退火和延伸步骤是本领域技术人员已知的，并且可以如本文所概述进行。

[0078] 将不同的工作流程应用于无PCR文库制备。图6B和图6C中示出了示例性过程。在图6B中，通过标准程序构建无PCR文库，然后变性以产生游离单链文库。在中和变性反应时，添加过量的阻断寡核苷酸。这种寡核苷酸含有PX’‑接头序列，其中该序列与无PCR的3’末端上的P7’互补。这些阻断寡核苷酸有效地使P7’双链化，因此它不能与FC退火，同时为正交杂交提供PX’。在图6C中，无PCR文库未变性。相反，上述相同的阻断寡核苷酸可与P7’退火，然后通过链置换聚合酶延伸以产生具有正交单链杂交基序的双链文库。

[0079] 当标签化用于附接衔接子序列时，也使用不同的工作流程。这在图6D中示出。总之，用于标签化衔接子序列的标准过程包括(a)将转座体整合到基因组DNA中以产生可扩增
和不可扩增的文库分子，(b)清洗文库以去除转座酶蛋白和(c)退火衔接子序列(各自包含
引物结合位点、索引和测序结合位点)并PCR扩增模板。在本工作流程中，除了如图所示使用
与Px连接的衔接子序列代替步骤(c)中的标准衔接子序列以外，遵循标准过程。

[0080] 在PCR文库制备策略的另一个示例中，将模板文库片段化以产生钝端，并且将腺苷添加到每条链的钝端以制备用于连接到衔接子序列(各自包含引物结合位点、索引和测序
结合位点)的模板。在这个示例中，每个衔接子序列将在其3'端含有胸腺嘧啶突出端，从而
提供用于连接衔接子序列(其将结合模板链上的腺苷)的互补突出端。然后将连接的插入序
列变性并使用引物结合序列(例如P5或P7)扩增以产生最终的双链模板文库。图6E中示出了
用于产生模板文库的这种替代标准过程。在本工作流程中，除了使用正交模板(A‑L‑P)代替使用引物结合序列(P5或P7)来扩增连接的模板以外，遵循标准过程。

[0081] 在所有情况下，接枝到基底表面的互补PX接种序列使得文库能够通过PX/PX’杂交退火到基底上。

[0082] 尽管不是限制性的，下面通过示例提供了示例性序列，包括用于文库制备的PX’接种序列和用于文库捕获的PX流动池序列：

[0083] SEQ ID NO:5PX’‑P5：

[0084] (PX加下划线。P5是粗体)

[0085] 5’CCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCT/iSp9/AATGATACGGCGACCACCGA 3’

[0086] SEQ ID NO:6PX’‑P7：

[0087] (PX加下划线。P7是粗体)

[0088] 5’CCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCT/iSp9/CAAGCAGAAGACGGCATAC 3’

[0089] SEQ ID NO:7PX基底序列：

[0090] 5’AGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGG/iSp9/U‑炔3’

[0091] 其中iSp9表示如下：

[0092]

[0093] 并且其中U‑炔表示5‑乙炔基尿嘧啶。另选地，乙炔基可附加到PX的5’端，因为通过任一取向的固定是功能性的。

[0094] 尽管可选择单一序列用于PX，但本公开不限于此，并且可使用任何数目的DNA序列作为正交接种序列。

[0095] 其他示例性引物如下所示：

[0096] SEQ ID NO:8PX

[0097] AGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGG

[0098] SEQ ID NO:9cPX(PX')

[0099] CCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCT

[0100] SEQ ID NO:10PA

[0101] GCTGGCACGTCCGAACGCTTCGTTAATCCGTTGAG

[0102] SEQ ID NO:11cPA(PA')

[0103] CTCAACGGATTAACGAAGCGTTCGGACGTGCCAGC

[0104] SEQ ID NO:12PB

[0105] CGTCGTCTGCCATGGCGCTTCGGTGGATATGAACT

[0106] SEQ ID NO:13cPB(PB')

[0107] AGTTCATATCCACCGAAGCGCCATGGCAGACGACG

[0108] SEQ ID NO:14PC

[0109] ACGGCCGCTAATATCAACGCGTCGAATCCGCAACT

[0110] SEQ ID NO:15cPV(PC')

[0111] AGTTGCGGATTCGACGCGTTGATATTAGCGGCCGT

[0112] SEQ ID NO:16PD

[0113] GCCGCGTTACGTTAGCCGGACTATTCGATGCAGC

[0114] SEQ ID NO:17cPD(PD')

[0115] GCTGCATCGAATAGTCCGGCTAACGTAACGCGGC

[0116] 上述序列是示例，但是本公开将适用于任何合适的正交寡聚策略。

[0117] 在实施方案中，本公开涉及上述序列的变体，其中所述变体与SEQ ID NO:5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、
90％、95％或99％序列同一性。

[0118] 非核苷酸结合

[0119] 在实施方案中，使用非核苷酸方法来捕获模板。在一个实施方案中，非核苷酸方法是化学捕获方法。化学捕获方法可以被配置为与模板形成非共价相互作用、共价键或金属
配位键。

[0120] 在一些实施方案中，模板可通过非共价相互作用附接到固体载体。这些非共价相互作用可包括离子键、氢键、疏水相互作用、π‑π相互作用、范德瓦尔斯相互作用和主体‑客体相互作用中的一种或多种。当使用非共价相互作用时，相互作用的类型不受特别限制，条
件是相互作用(共同地)足够强以使模板在延伸期间保持附接到固体载体。非共价相互作用
也可以足够弱，使得一旦模板的拷贝已经在表面引物上延伸，则可以从固体载体上去除模
板。

[0121] 如本文所用，术语“离子键”是指两种或更多种离子之间的化学键，其涉及阳离子与阴离子之间的静电吸引。例如，阳离子可以选自如本文所述的“金属阳离子”或“非金属阳离子”。非金属阳离子可包括铵盐(例如烷基铵盐)或鏻盐(例如烷基鏻盐)。阴离子可选自磷
酸根、硫代磷酸根、膦酸根、硫代膦酸根、次膦酸根、硫代次膦酸根、硫酸根、磺酸根、亚硫酸根、亚磺酸根、碳酸根、羧酸根、醇盐、酚盐和苯硫酚盐。

[0122] 如本文所用，术语“氢键”是指富电子原子(例如氮、氧或氟)上的孤对电子与附接到电负性原子(例如氮或氧)的氢原子之间的键合相互作用。

[0123] 如本文所用，术语“主体‑客体相互作用”是指能够通过分子识别经由一种或多种类型的非共价相互作用(诸如离子键合、氢键合、疏水相互作用、范德瓦尔斯相互作用和π‑π相互作用)形成结合复合物的两个或更多个基团。例如，主体‑客体相互作用可以包括在葫
芦脲(cucubituril)与金刚烷(例如1‑金刚烷基胺)、铵离子(例如氨基酸)、二茂铁；环糊精
与金刚烷(例如1‑金刚烷基胺)、铵离子(例如氨基酸)、二茂铁；杯芳烃与金刚烷(例如1‑金刚烷基胺)、铵离子(例如氨基酸)、二茂铁；冠醚(例如18‑冠‑6、15‑冠‑5、12‑冠‑4)或穴状配体(例如[2.2.2]穴状配体)与阳离子(例如金属阳离子、铵离子)；抗生物素蛋白(例如链霉
亲和素)和生物素；以及抗体和半抗原之间形成的相互作用。

[0124] 在优选的实施方案中，非共价相互作用是在抗生物素蛋白(例如链霉亲和素)和生物素之间形成的相互作用。在一些实施方案中，固体载体和模板都可以包含生物素，并且模
板通过抗生物素蛋白(例如链霉亲和素)桥接中间体附接到固体载体。在其他实施方案中，
固体载体可包含生物素，并且可附接到模板上的亲和素(例如链霉亲和素)。在其他实施方
案中，固体载体可包含亲和素(例如链霉亲和素)，并且可附接到模板上的生物素部分。其示
例在图7中示出。

[0125] 在其他实施方案中，模板可通过共价键附接到固体载体。当使用共价键时，该键可以是稳定的，使得模板保持附接到固体载体。共价键的非限制性示例包括亚烷基键、亚烯基
键、亚炔基键、醚键(例如，乙二醇、丙二醇、聚乙二醇)、胺键、酯键、酰胺键、碳环或杂环键、硫基键(例如，硫醚、二硫化物、多硫化物或亚砜键)、缩醛、半缩醛胺醚、缩醛胺、亚胺、腙、硼基键(例如，硼酸和次硼酸(borinic acid)/酯)、硅基键(例如，甲硅烷基醚、硅氧烷)和磷基键(例如，亚磷酸酯、磷酸酯)。

[0126] 在一些实施方案中，共价键可以是可逆的共价键，使得一旦模板的拷贝已经在表面引物上延伸，则可以从固体载体上去除模板。在其他实施方案中，共价键可以是不可逆的
键。

[0127] 如本文所用，术语“可逆的共价键”是指可例如在施加热、光或其他(生物)化学方法(例如，通过暴露于降解剂，诸如酶或催化剂)下裂解的共价键，而“不可逆的共价键”在此类条件下对降解稳定。可逆的共价键的非限制性示例包括可热裂解或光解裂解的环加成物
(例如，呋喃‑马来酰亚胺环加成物)、亚烯基键、酯、酰胺、缩醛、半缩醛胺醚、缩醛胺、亚胺、腙、多硫化物键(例如，二硫键)、硼基键(例如，硼酸和次硼酸/酯)、硅基键(例如，甲硅烷基醚、硅氧烷)和磷基键(例如，亚磷酸酯、磷酸酯)。

[0128] 在一些实施方案中，固体载体和/或模板可以包含选自以下各项的官能团：取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的环烯基(例如，降冰片烯基
(norbornenyl)、顺式或反式环辛烯基)、取代或未取代的环炔基(例如，环辛炔基、二苯并环辛炔基、双环壬炔基)、叠氮基、取代或未取代的四嗪基、取代或未取代的肼基、取代或未取代的四唑基、醛、酮、羧酸、磺酰氟、重氮(例如，α‑重氮羰基)、取代或未取代的肟、肟基卤化物、氧化腈、硝酮、取代或未取代的氨基、取代或未取代的肼、硫醇或羟基。

[0129] 如本文所用，术语“环加成物”是指由两种组分之间的环加成反应形成的环状结构(例如，二烯与亲双烯体之间的狄尔斯‑阿尔德(Diels‑Alder)或反电子需求狄尔斯‑阿尔德型环加成，或偶极与亲偶极之间的1,3‑偶极型环加成)。“环加成物”可以是可裂解的并且经历逆环加成反应以再生这两种组分(例如热或光解)。

[0130] 如本文所用，术语“烷基”或“亚烷基”是指分别具有1个至12个碳原子的单价或二价直链和支链基团。优选地，烷基或亚烷基是具有1个至6个碳原子的直链或支链烷基或亚
烷基，更优选具有1个至4个碳原子的直链或支链烷基或亚烷基。烷基或亚烷基可包含一个
或多个如本文所述的“取代基”。

[0131] 如本文所用，术语“烯基”或“亚烯基”是指分别具有1个至12个碳原子并且包含至少一个碳‑碳双键的单价或二价直链和支链基团。优选地，烯基或亚烯基是具有1个至6个碳
原子的直链或支链烯基或亚烯基，更优选具有1个至4个碳原子的直链或支链烯基或亚烯
基。烯基或亚烯基可包含一个或多个如本文所述的“取代基”。

[0132] 如本文所用，术语“炔基”或“亚炔基”是指分别具有1个至12个碳原子并且包含至少一个碳‑碳三键的单价或二价直链和支链基团。优选地，炔基或亚炔基是具有1个至6个碳
原子的直链或支链炔基或亚炔基，更优选具有1个至4个碳原子的直链或支链炔基或亚炔
基。炔基或亚炔基可包含一个或多个如本文所述的“取代基”。

[0133] 如本文所用，术语“醚键”是指‑O‑基团，其中氧原子在与该基团的附接点处与两个其他碳原子附接。

[0134] 如本文所用，术语“氨基”是指‑N(R)(R’)基团，其中R和R’独立地为氢或如本文所定义的“取代基”。如本文所用，术语“胺键”是指‑NR‑基团，并且其中R是氢或如本文所定义的“取代基”。

[0135] 如本文所用，术语“酯键”是指‑O‑C(＝O)‑基团，其中该基团在与该基团的附接点处与两个其他碳原子附接。

[0136] 如本文所用，术语“酰胺键”是指‑NR‑C(＝O)‑基团，其中R是氢或如本文所述的“取代基”。

[0137] 如本文所用，术语“碳环键”是指二价“亚环烷基”、二价“亚环烯基”或二价“亚芳基”。

[0138] “环烷基”或“亚环烷基”是指分别包含含有3个至10个碳原子(例如，3个至6个碳原子)的闭环的烷基或亚烷基。环烷基或亚环烷基可包含一个或多个如本文所述的“取代基”。

[0139] “环烯基”或“亚环烯基”是指分别包含含有3个至10个碳原子(例如，3个至6个碳原子)闭合非芳族环的烯基或亚烯基，并且其含有至少一个碳‑碳双键。环烯基或亚环烯基可包含一个或多个如本文所述的“取代基”。

[0140] “环炔基”是指分别包含含有8个至12个碳原子(例如，8个至10个碳原子)的闭合非芳族环的炔基，并且其含有至少一个碳‑碳三键。环炔基可包含一个或多个如本文所述的
“取代基”。

[0141] “芳基”或“亚芳基”是指环中分别含有6个至14个碳原子的单价或二价单环、双环或三环芳族基团。常见的芳基包括C6‑C14芳基或亚芳基，例如C6‑C10芳基或亚芳基。芳基或亚芳基可包含一个或多个如本文所述的“取代基”。

[0142] 如本文所用，术语“杂环键”是指二价“亚杂环烷基”或二价“亚杂芳基”。

[0143] “杂环烷基”或“亚杂环烷基”分别是指单价或二价饱和或部分饱和的3元至7元单环或7元至10元双环系统，其由碳原子和一个至四个独立地选自由O、N和S组成的组的杂原
子组成，其中氮和硫杂原子可任选地被氧化，氮可任选地被季铵化，并且包括任何双环基
团，其中任何以上定义的环与苯环稠合，并且其中如果所得化合物是稳定的，则环可在碳或
氮原子上被取代。“杂环烷基”的非限制性示例包括吡咯烷基、四氢呋喃基、二氢呋喃基、四氢噻吩基、四氢噻喃基、异噁唑啉基、哌啶基、吗啉基、硫代吗啉基、噻噁烷基、哌嗪基、氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基、硫杂环丁烷基、高哌啶基、氧杂环庚烷基(oxepanyl)、硫杂环庚烷基(thiepanyl)、氮杂环庚烯基(oxazepinyl)、二氮杂环庚烯基(diazepinyl)、硫氮杂环庚
烯基(thiazepinyl)、1,2,3,6‑四氢吡啶基、2‑吡咯啉基、3‑吡咯啉基、二氢吲哚基、2H‑吡喃基、4H‑吡喃基、二氧杂环己烷基、1,3‑二氧杂环戊烷基、吡唑啉基、二硫杂环己烷基
(dithianyl)、二硫戊环基(dithiolanyl)、二氢吡喃基、二氢噻吩基、二氢呋喃基、二氢哒嗪基(例如，1,4‑二氢哒嗪基)、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、3‑氮杂双环[3.1.0]己基、3‑氮杂双环[4.1.0]庚基、3H‑吲哚基和喹嗪基；“亚杂环烷基”的非限制性示例包括呈其二价形式的上述基团。杂环烷基或亚杂环烷基可包含一个或多个如本文所述的“取代基”。

[0144] “杂芳基”或“亚杂芳基”是指分别具有5个至14个环原子(例如，5个至10个环原子)并且含有碳原子和1个、2个或3个氧、氮或硫杂原子的一价或二价芳族基团。“杂芳基”的非限制性示例包括喹啉基(包括8‑喹啉基)、异喹啉基、香豆素基(coumarinyl)(包括8‑香豆素基)、吡啶基、吡嗪基、吡唑基、嘧啶基、哒嗪基、呋喃基、吡咯基、噻吩基、噻唑基、异噻唑基、三唑基(例如，1,2,3‑三唑基)、四唑基、异噁唑基、噁唑基、咪唑基、吲哚基、异吲哚基、吲唑基、吲嗪基、酞嗪基、蝶啶基、嘌呤基、噁二唑基、噻二唑基、亚呋咱基(furazanylene)、哒嗪基、三嗪基、噌啉基(cinnolinyl)、苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并呋咱基、苯并噻吩基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、喹唑啉基、喹喔啉基、萘啶基和呋喃并吡啶基；“亚杂芳基”的非限制性示例包括呈其二价形式的上述基团。当杂芳基(或亚杂芳基)在环中含有氮原子时，这种氮原子可以呈N‑氧化物的形式，例如吡啶基N‑氧化物、吡嗪基N‑氧化物、嘧啶基N‑氧化物和哒嗪基N‑氧化物。杂芳基或亚杂芳基可包含一个或多个如本文所述的“取代基”。

[0145] 如本文所用，术语“硫基键”是指‑(S)n‑基团，其中n为1至10或1至6。优选地，n可以是1，从而形成“硫化物”键；n为2至10(例如，2至6)，从而形成“多硫化物”键。例如，n是2，从而形成“二硫化物”键。在一些实施方案中，硫原子可以任选地被氧化。特别地，硫基键可以是砜‑S(＝O)‑键或亚砜‑S(＝O)2‑键。

[0146] 如本文所用，术语“缩醛”是指‑OC(R)(R’)O‑基团，其中R和R’独立地为氢或如本文所述的“取代基”。

[0147] 如本文所用，术语“半缩醛胺醚”是指‑OC(R)(R’)NR”‑基团，其中R、R’和R”独立地为氢或如本文所述的“取代基”。

[0148] 如本文所用，术语“缩醛胺”是指‑NR(R’)(R”)NR”’‑基团，其中R、R’、R”和R”’独立地为氢或如本文所述的“取代基”。

[0149] 如本文所用，术语“亚胺”是指‑C(R)＝N‑基团，其中R是氢或如本文所述的“取代基”。

[0150] 如本文所用，术语“腙”是指‑C(R)＝N‑NR’‑基团，其中R和R’独立地为氢或如本文所述的“取代基”。

[0151] 如本文所用，术语“硼基键”是指‑(O)a‑B(OR)‑(O)b‑基团，其中R独立地为氢或如本文所述的“取代基”，并且其中a和b独立地为0或1。

[0152] 如本文所用，术语“硅基键”是指‑(O)a‑Si(R)(R’)‑(O)b‑基团，其中R和R’独立地为氢或如本文所述的“取代基”，并且其中a和b独立地为0或1。

[0153] 如本文所用，术语“磷基键”是指‑(O)a‑P(R)‑(O)b‑基团，其中R和R’独立地为氢或如本文所述的“取代基”，并且其中a和b独立地为0或1。

[0154] 如本文所用，术语“醛”是指‑C(＝O)H基团，其中该基团在与该基团的附接点处与碳原子附接。

[0155] 如本文所用，术语“酮”是指‑C(＝O)‑基团，其中该基团在与该基团的附接点处与两个其他碳原子附接。

[0156] 如本文所用，术语“羧酸”基团是指‑C(＝O)OH基团。

[0157] 如本文所用，术语“磺酰氟”是指‑S(＝O)2F基团。

[0158] 如本文所用，术语“重氮”是指‑C(＝N+＝N‑)‑基团。

[0159] 如本文所用，术语“肟”是指‑C(R)＝N‑OR’基团，其中R和R’独立地为氢或如本文所述的“取代基”。

[0160] 如本文所用，术语“肟基卤化物”是指‑C(X)＝N‑OR基团，其中R是氢或如本文所述的“取代基”，并且X是卤素。

[0161] 如本文所用，术语“氧化腈”是指‑C≡N+‑O‑基团。

[0162] 如本文所用，术语“硝酮”是指‑C(＝NR+‑O‑)‑基团，其中R是氢或本文所述的“取代基”。

[0163] 如本文所用，术语“取代基”是指诸如以下的基团：OR’、＝O、SR’、SOR’、SO2R’、NO2、NHR’、NR’R’、＝N‑R’、NHCOR’、N(COR’)2、NHSO2R’、NR’C(＝NR’)NR’R’、CN、卤素、COR’、COOR’、OCOR’、OCONHR’、OCONR’R’、CONHR’、CONR’R’、受保护的OH、受保护的氨基、受保护的SH、取代的或未取代的C1‑C12烷基、取代的或未取代的C2‑C12烯基、取代的或未取代的C2‑C12炔基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂环烷基和取代的或未取代的杂芳基，其中每个R’基团独立地选自由以下各项组成的组：氢、OH、NO2、NH2、SH、CN、卤素、COH、CO烷基、CO2H、取代的或未取代的C1‑C12烷基、取代的或未取代的C2‑C12烯基、取代的或未取代的C2‑C12炔基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂环烷基和取代的或未取代的杂芳基。当这些
基团本身被取代时，取代基可以选自上述列表。另外，当取代基上有多于一个R’基团时，每个R’可以相同或不同。

[0164] 在其他实施方案中，模板可通过金属配位键附接到固体载体。当使用金属配位键时，该键可以足够强，使得模板保持附接到固体载体。金属配位键可以可逆地形成，使得一
旦模板的拷贝已经在表面引物上延伸，则可以从固体载体上去除模板。

[0165] 如本文所用，术语“金属配位键”是指在金属部分和配体(例如本文所述的“金属配位基团”)之间形成的离子键和/或配位共价键。

[0166] 如本文所用，术语“金属配位基团”是指能够通过在配位基团和金属部分之间形成离子键和/或配位共价键而与金属部分配位的基团。金属配位基团的非限制性示例包括苯
二醇(例如，儿茶酚(catechol))或其衍生物；苯三醇(例如，棓醇(gallol))或其衍生物；氨
基酸，包括组氨酸(例如聚组氨酸，诸如His6标签)、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸或半胱氨酸；以及乙二胺四乙酸和其衍生物。

[0167] 可以调节金属配位基团与金属部分的比率。每个金属部分可以有一个、两个或三个配位基团。

[0168] 如本文所用，“金属部分”可以是适于形成离子键或与金属配位基团配位的任何金属部分。对于金属配位基团，金属部分与金属配位基团形成可逆的离子键和/或可逆的配位
共价键。合适的金属部分包括金属阳离子、金属氧化物、金属氢氧化物、金属碳化物、金属氮化物和/或金属纳米颗粒。

[0169] 特定的金属阳离子包括锂、钠、钾、铷、铯、铍、镁、钙、锶、钡、铬、锰、铁、钴、镍、铜、银、金、铂、钯、锌、镉、汞、铝、镓、铟、锡、铅和铋。特别优选的是镍。

[0170] 更特别地，合适的阳离子包括碱金属离子(例如，Li+锂离子、Na+钠离子，K+钾离子，+ + 2+ 2+ 2+ 2+Rb铷离子、Cs 铯离子)、碱土金属离子(例如，Be 铍离子、Mg 镁离子、Ca 钙离子，Sr 锶离
2+ 2+ 4+ 2+ 3+
子、Ba 钡离子)、过渡金属离子(例如，Ti 钛(II)离子、Ti 钛(IV)离子、V 钒(II)离子、V
4+ 5+ 2+ 3+ 6+
钒(III)离子、V 钒(IV)离子、V 钒(V)离子、Cr 铬(II)离子、Cr 铬(III)离子、Cr 铬(VI)
2+ 3+ 4+ 2+ 3+
离子、Mn 锰(II)离子、Mn 锰(III)离子、Mn 锰(IV)离子、Fe 铁(II)离子、Fe 铁(III)离
2+ 3+ 2+ 3+
子、Co 钴(II)离子、Co 钴(III)离子、Ni 镍(II)离子、Ni 镍(III)离子、Cu+铜(I)离子、
2+ + + 3+ 2+ 4+
Cu 铜(II)离子、Ag银离子、Au 金(I)离子、Au 金(III)离子、Pt 铂(II)离子、Pt 铂(IV)
2+ 4+ 2+ 2+ + 2+
离子、Pd 钯(II)离子、Pd 钯(IV)离子、Zn 锌离子、Cd 镉离子、Hg汞(I)离子、Hg 汞(II)
3+ 3+ + 3+
离子)、第III族金属离子(例如，Al 铝离子、Ga 镓离子、In铟(I)离子、In 铟(III)离子)、
2+ 4+ 2+ 4+
第IV族金属离子(例如，Sn 锡(II)离子、Sn 锡(IV)离子、Pb 铅(II)离子、Pb 铅(IV)离子)
3+ 5+ 2+
和/或第V族金属离子(例如，Bi 铋(III)离子、Bi 铋(V)离子)。特别优选的是Ni (II)离
子。

[0171] 金属部分可以呈金属盐的形式。合适的金属盐包括但不限于卤化物、腈、氢氧化物等。

[0172] 金属部分可以呈氧化物或纳米颗粒的形式。例如，可以使用氧化铁纳米颗粒。其他合适的氧化物或纳米颗粒包括氧化铁、氮化铁、碳化铁、铁金属颗粒、氧化镍、碳化镍、镍颗粒、氧化钛、钛金属颗粒、氮化钛、碳化钛、银金属颗粒和金金属颗粒。

[0173] 优选地，金属配位键是在镍和组氨酸之间形成的，诸如镍‑His6标签。固体载体可包含镍(例如，镍金属或镍离子)，并且可附接到生物分子上的组氨酸(例如，His6标签)部
分。另选地，固体载体可包含组氨酸(例如，His6标签)，并可附接到模板上的镍(例如，镍金属或镍离子)。

[0174] 在实施方案中，通过流动池表面上的化学相互作用将模板捕获在流动池的表面上。流动池可包括官能化聚合物涂层，其可用于实现化学捕获。官能化聚合物涂层可包括一
个或多个官能团，这些官能团选自取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取
代的环烯基(例如降冰片烯基、顺式或反式环辛烯基)、取代或未取代的环炔基(例如，环辛
炔基、二苯并环辛炔基、双环壬炔基)、叠氮基、取代或未取代的四嗪基、取代或未取代的肼基、取代或未取代的四唑基、醛、酮、羧酸、磺酰氟、重氮(例如，α‑重氮羰基)、取代或未取代的肟、肟基卤化物、氧化腈、硝酮、取代或未取代的氨基、取代或未取代的肼、硫醇或羟基。官能化聚合物涂层的一个示例是聚(N‑(5‑叠氮乙酰胺基戊基)丙烯酰胺‑共‑丙烯酰胺
(PAZAM)。

[0175] 在实施方案中，非核苷酸方法包括被配置为通过点击化学形成键的官能团。此类键可包括使用硫醇‑烯点击化学(例如，在硫醇和烯基反应性基团之间)、铜催化的叠氮化
物‑炔环加成(例如，在叠氮化物和炔基反应性基团之间)、应变促进的偶极环加成(例如，在叠氮化物、腈氧化物或硝酮与环烯基/环炔基反应性基团之间；腈氧化物可例如由肟和肟基
卤化物原位产生)、应变促进的狄尔斯‑阿尔德反应(例如，在四嗪和环烯基/环炔基反应性
基团之间)、烯烃‑四唑光点击反应(例如，在烯基和四唑反应性基团之间)和SuFEx点击化学
(例如，在磺酰氟和亲核试剂如羧酸、硫醇、羟基和氨基反应性基团之间)形成的键。示例性
点击化学方法显示于包含文库图8中，这些文库含有在P5端和P7端上的DBCO‑dNTP，其与存
在于流动池表面上(例如在PAZAM涂层内)的未使用的叠氮化物共价结合。

[0176] 作为进一步的示例，可以使用树突将捕获基序附接到文库。通过PX基序的树突辅助接种的示例示于图9中，其示出PX’‑树突文库，其可与接枝在纳米孔上的PX基序杂交。每个文库的大量PX’基序可以改善接种动力学和/或效率。

[0177] 接头

[0178] 可以在捕获部分和衔接子之间提供间隔子或接头。例如，可以在来自成簇序列(P5/P7)的捕获部分之间提供间隔子或接头。

[0179] 接头可以为具有式(CH2)n的含碳链，其中“n”为1至约1500，例如小于约1000，优选地小于100，例如2‑50，具体地讲5‑25。

[0180] 也可使用不仅由碳原子组成的接头。此类接头可包括聚乙二醇(PEG)。

[0181] 一种特定的接头是iSp9(间隔子9)，其是一种三甘醇间隔子，其可以掺入寡核苷酸的5’端或3’端或内部。

[0182] 可修饰主要由碳原子链和PEG形成的接头以便含有中断该链的官能团。此类基团的示例包括酮、酯、胺、酰胺、醚、硫醚、亚砜、砜。可单独地或与此类官能团的存在组合地采用烯烃、炔烃、芳香族或杂芳香族部分或环状脂肪族部分(例如环己基)。环己基或苯基环可
以例如通过其1‑位和4‑位连接到PEG或(CH2)n链。

[0183] 作为上述接头的另选方案，其主要基于任选地被不饱和碳原子或杂原子中断的饱和碳原子的直链，可设想基于核酸或单糖单元(例如右旋糖)的其他接头。其也在本公开的
范围内以利用肽作为接头。

[0184] 可使用多种其他接头。接头在多核苷酸随后旨在使用的条件下，例如在DNA扩增中使用的条件下应当是稳定的。连接还应使得其不被DNA聚合酶绕过，从而在复制捕获部分序
列(如果其是基于核苷酸的，诸如PX’序列)之前终止DNA聚合。这允许PX’保持单链并在所有时间都可用于杂交。

[0185] 核苷酸和非核苷酸捕获部分和接头的上述实施方案不旨在受到限制，并且仅提供可用于本公开的正交策略的示例。

[0186] 将捕获剂与成簇引物解耦导致对当前过程的许多改进。

[0187] 将捕获剂与成簇引物解耦使得模板文库能够作为双链DNA(dsDNA)接种。双链接种消除了对文库变性的需要，这改善了总体周转时间。

[0188] 使用dsDNA的能力具有图10A至图10B中所示的优点。为了避免疑问，尽管图10A至图10B示出PX作为正交捕获部分，如本文所定义的基于非核苷酸的方法同样实现相同的优
点。图10A至图10B证明了动力学建模，其最好地将PCR扩增文库接种描述为表面杂交和文库
在溶液中重新退火之间的竞争。图10A示出特定PCR扩增文库的单链接种需要变性文库保持
冷却并快速加载到流动池上以最小化不利地影响接种的再退火。储存较长时间的变性文库
可再退火，特别是在互补衔接子末端处。在标准方法中，重新退火的链不能与表面引物杂
交。除了降低总体接种效率之外，单链文库的时间依赖性稳定性可极大地影响接种稳健性
和再现性，这反过来可以影响测序质量。

[0189] 相反，将捕获剂与成簇引物解耦允许接种双链模板，这消除了竞争性再杂交，因为PX’基序的可用性不随温度和时间改变。这可以提高接种效率和再现性。这也会影响接种所
需的模板浓度。

[0190] 本公开克服接种效率和再现性的能力已在实施例1和图11中得到证实。可以看出，由于ss‑模板的再退火，ss‑文库显示出有效性的线性降低。非生产性模板再退火是温度依
赖性的和浓度依赖性的。其降低了接种效率并减慢了接种动力学。由于这些原因，变性文库
需要快速加载到流动池上以保持足够的单链，从而能够有效接种。文库加载的延迟不利地
影响最终占用率％和流动池产率。相反，dsDNA文库与时间和温度无关。

[0191] 正交dsDNA接种文库和解耦的捕获剂对种子和簇的能力在实施例2中证实并示出在图12和图13中。图12显示没有正交接种的传统ss‑文库具有高的成簇强度速率。相反，如
果在没有互补捕获剂的流动池上使用具有正交接种引物的ds‑文库，则没有观察到成簇强
度，这意味着没有模板捕获。然而，根据本公开的正交捕获策略显示了高成簇强度，从而证
实本公开能够实现捕获和成簇两者。

[0192] 这在图13A至图13C中概念性地示出。图13A示出了在标准流动池上捕获的变性正交文库，而不需要流动池表面上的正交捕获剂。图13B示出了ds‑文库不能在不具有对应正
交捕获剂的流动池上被捕获。图13C示出了ds‑文库可以在对应正交捕获剂的存在下被捕
获。尽管未示出，变性ss‑文库也可通过标准成簇引物在包含正交捕获剂的流动池上捕获。
因此，根据本公开的流动池可以与ss‑文库反相容(尽管考虑了由于引物密度导致的任何多
克隆性缺点)，并且根据本公开的ds‑文库可以变性并用于标准流动池中。

[0193] 本公开的另一个优点是，例如基于纳米孔尺寸、靶密度和所使用的检测系统(例如CMOS相比于光学系统)，可以调节成簇引物密度以获得期望的信号强度。另外，捕获剂密度
可以单独调节以获得最佳(单)克隆性。

[0194] 图14示出根据本公开制作的模板成簇的能力的示例。顶行示出了涉及模板捕获然后链合成的标准过程。然后可以发生对相邻引物的侵入，随后发生链置换。然后这些链可以
通过桥接到互补引物上而延伸，导致簇扩增和最终的第一次读取测序。根据来自本公开的
正交方法，在正交捕获部分上捕获文库模板作为ds‑模板。随后立即发生侵入和链置换。可
以注意到，不需要第一链合成步骤，因为模板已经是双链的。在置换后，原始模板链可桥接
到互补引物上。另外，可延伸置换的链。注意到模板链上的正交部分(在显示的示例中为PX
序列)在成簇期间不被复制。然后通过簇扩增延伸这些链并以常规方式测序。

[0195] 在实施例3和图15中评估了捕获剂表面密度和文库浓度之间的关系，其中可以看出可以优化捕获剂表面密度和/或文库浓度以使强度和％PF最大化。例如，可以看出，当使
用300pM文库时，具有39个捕获探针(PX)相对于在传统流动池中存在的显著更高的数目是
优化的。

[0196] 在本公开中，固体载体的离散区域旨在包含克隆簇，其然后被测序以确定在克隆簇内复制的插入DNA的序列。这个区域传统上可以是流动池上的纳米孔，但在替代实施方案
中可以是微珠或其他离散区域。

[0197] 在实施方案中，单个纳米孔(或其他离散区域)平均包含介于约1个至5000个捕获部分。在一个优选的实施方案中，每个单独的纳米孔(或其他离散区域)平均存在介于约1个
至2500个、1个至1000个、1个至625个、1个至500个、1个至300个、1个至200个、1个至156个、1个至100个、1个至80个、10个至80个、1个至60个、20个至60个、30个至50个、1个至50个，或约
35个至45个或约35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、43个或45个捕获部分。捕获部分通常以1:100至1:10的比率存在于成簇引物中。平均可以是平均值或中值。优
选地，平均是平均值。平均密度可以通过以下方式计算：将所有可用的引物荧光标记在引发
的流动池表面上，并且创建已知浓度与荧光之间的标准曲线，然后可以将单个纳米孔的荧
光与该标准曲线进行比较。

[0198] 在一个优选的实施方案中，以75pM接种文库，并且每个单独的纳米孔(或其他离散区域)平均存在介于约50个至5000个、50个至2500个、50个至1000个、50个至625个、50个至
500个、50个至300个、50个至200个、100个至180个、120个至170个、140个至170个或约150个至160个；或约150个、151个、152个、153个、154个、155个、156个、157个、158个、159个或160个捕获部分。

[0199] 在一个优选的实施方案中，以150pM接种文库，并且每个单独的纳米孔(或其他离散区域)平均存在介于约10个至5000个、10个至2500个、10个至1000个、10个至625个、10个
至500个、10个至300个、10个至200个、10个至200个、10个至150个或约10个至120个捕获部
分。

[0200] 在一个优选的实施方案中，以300pM接种文库，并且每个单独的纳米孔(或其他离散区域)平均存在介于约1个至5000个、1个至2500个、1个至1000个、1个至625个、1个至500
个、1个至300个、1个至200个、1个至156个、1个至100个、1个至80个、10个至80个、1个至60个、20个至60个、30个至50个、1个至50个或约35个至45个，或约35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、43个或45个捕获部分。

[0201] 本公开设想并涵盖其他文库浓度和捕获部分密度。

[0202] 将接种与成簇解耦还使得能够优化测序强度(基于较高的成簇引物密度)，同时维持可工作的克隆性。这在实施例4和图16中得到证实，其证实了C1强度的增加而％PF没有显
著降低。

[0203] 在实施方案中，单个纳米孔(或其他离散区域)平均包含介于10,000个和30,000个之间的成簇引物。在另一个实施方案中，单个纳米孔(或其他离散区域)平均包含高于5000
个、6000个、7000个、8000个、9000个、10,000个、11,000个、12,000个、13,000个、14,000个、
15,000个、16,000个、17,000个、18,000个、19,000 20,000个、25,000个、30,000个、35,000个、40,000个、45,000个或50,000个成簇引物。在一些情况下，单个纳米孔可包含多达100,
000个成簇引物。平均可以是平均值或中值。优选地，平均是平均值。可通过测量荧光强度并将其与标准曲线进行比较来计算平均密度。

[0204] 在实施方案中，单个纳米孔(或其他离散区域)上捕获部分:成簇引物的比率为约1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、
1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100、1:110、1:120、1:130、1:140、1:
150、1:160、1:170、1:180、1:190、1:200、1:220、1:240、1:260、1:280、1:300、1:320、1:340、
1:360、1:380、1:400、1:420、1:440、1:460、1:480或1:500或约1:1000或更大。优选的比率介于1:10和1:1000之间。

[0205] 在实施方案中，单个纳米孔(或其他离散区域)上捕获部分:成簇引物的比率为约1:>2、1:>3、1:>4、1:>5、1:>6、1:>7、1:>8、1:>9、1:>10、1:>15、1:>20、1:>25、1:>30、1:>35、
1:>40、1:>45、1:>50、1:>55、1:>60、1:>65、1:>70、1:>75、1:>80、1:>85、1:>90、1:>95、1:>
100、1:>110、1:>120、1:>130、1:>140、1:150、1:>160、1:>170、1:>180、1:>190、1:>200、1:>
220、1:>240、1:>260、1:>280、1:>300、1:>320、1:>340、1:>360、1:>380、1:>400、1:>420、1:>
440、1:>460、1:>480或约1:>500或更大。优选的比率包括1:>10。

[0206] 在实施例5和图17图至18中考虑并示出了温度对正交接种策略的接种时间的影响。可以看出，与标准方案相比，正交播种策略实现了相似的占用率水平。提高温度能够更
快地接种。

[0207] 在实施方案中，在约40℃至60℃，优选40℃或50℃的温度下进行接种。

[0208] 在实施方案中，在50℃下进行接种持续至少1分钟，优选5分钟和10分钟之间。

[0209] 在实施方案中，以介于50pM至2000pM之间的浓度接种文库。在实施方案中，以300pM的浓度接种文库。

[0210] 在实施方案中，成簇在介于35℃和60℃之间的温度下进行。在实施方案中，成簇在约38℃的温度下进行。

[0211] 在实施方案中，成簇进行至少10分钟，优选至少30分钟。

[0212] 图19至图22显示根据本公开的正交接种策略能够实现高信号强度而没有％PF的对应降低(由于多克隆性)。与标准接种/成簇(其中结果受到改变文库浓度和/或引物密度
的严重影响)和本公开(其中改变这些参数在很大程度上不影响结果)存在显著的对比。因
此，本公开允许文库浓度和簇密度两者的优化以适合分析的特定需要。

[0213] 此外，使用根据本公开的正交接种策略，错误率显著降低。150个循环后的总误差为1％，而在一些情况下在标准接种/成簇下为接近8％。错误率与信噪比相关联，这意味着
根据本公开的解耦策略具有更好的信噪比。这可能是由于簇中增加的克隆性(即多克隆性
降低)。更好的信噪比可以有利地允许更长的运行。这样，本公开允许在保持低错误率的同
时增加运行的数量。

[0214] 在本公开的实施方案中，在150个循环之后，平均错误率小于1.5％，优选小于1.2％，优选小于1％，优选小于0.5％，优选小于0.25％，优选小于0.1％，优选0.05％。在另一个实施方案中，在200个循环之后，平均错误率小于2％，优选地小于1.5％。优选小于1％，优选小于0.5％，优选小于0.25％，优选小于0.1％，优选0.05％。在另一个实施方案中，在
250个循环之后，平均错误率小于2.5％，优选小于2％，优选小于1.5％，优选小于1％，优选小于0.25％，优选小于0.1％。在另一个实施方案中，在300个循环之后，平均错误率小于
3％，优选小于2.5％，优选小于2％，优选小于1.5％，优选小于1％，优选小于0.5％，优选小于0.25％，优选小于0.1％。

[0215] 参照图23A至图23B描述本公开的正交接种策略的进一步应用。可供选择的流动池设计可通过使用两个垫来避免对成对端匝的需要，该两个垫含有其自身的一组独特引物和
互补线性化化学(一组用于读取1且一组用于读取2)。与这种配置相关的一个挑战是不能防
止在两个PAZAM垫上发生多个接种事件，这生成错误的成对读数。这可以从图23A看出。如果
单个模板接种到双垫表面上，则成簇将导致单克隆性。然而，如果两个模板接种到垫上，则
可能仍然导致真正的成对读数(第一个2种子示例)，但是一般而言，它们将可能不是成对读
数或错误的成对读数(第二个和第三个2种子示例)。正交接种的应用可以通过仅在一个垫
上提供捕获剂来最小化或克服这个问题。例如，这可以通过仅在一个垫上的选择性表面化
学来实现。这种方法可以通过将模板接种专门导向显示捕获基序的垫来消除错误的成对读
数。这在图23B中示出。为了避免疑问，尽管该图显示了PCR文库和PX核苷酸接种基序，相同
的原理可以更广泛地应用于任何文库或捕获剂(例如，非核苷酸结合模板接种)。

[0216] 在本公开的应用的又一个示例中，正交接种策略可用于替代的成簇方法中，这些方法从流动池中取消成簇，而是将文库复制到设计的颗粒上。在流动池上的一个罐中复制
多路复用样品的当前方法导致可能的交叉污染。从流动池取消成簇可以去除指数跳跃，因
为样品可以独立地成簇并且随后在流动池加载之前混合。分流池成簇还可简化流动池架构
设计。本公开允许颗粒具有用于文库附接的单个点，从而使得能够产生单克隆成簇颗粒。例
如，本公开通过提供与成簇寡核苷酸独特的杂交序列而使单克隆附接成为可能。其他非核
苷酸方法同样是可能的。

[0217] 实施例

[0218] 实施例1

[0219] 评估根据本公开的ds‑文库相比于ss‑文库的稳健性。结果示于图11中，其中该图比较了在35℃下不同分级时间后获得的第1碱基强度。将文库稀释在杂交缓冲液(HT1)中并
在35℃下温育介于0分钟和180分钟之间的特定时间，然后引入流动池中以供与接种引物杂
交。如果文库是单链的，则其缓慢地与自身再杂交，这防止接种发生并导致占用率和测序强
度降低。另选地，对于PX总是可获得的双链PX文库，不发生再杂交，因此强度不降低。

[0220] 实施例2

[0221] 如图13A至图13C中示意性所示，评估PX辅助的ds‑文库接种的能力。在图13A中，变性后将300pM的PX文库引入标准流动池(P5/P7接枝：1.1μM；PX接枝：0μM)。由于其变性并且文库上的P5/P7可用于接种，因此可检测成簇强度。在图13B中，将300pM的PX文库引入标准
流动池中而不变性(P5/P7接枝：1.1μM；PX接枝：0μM)。由于其未变性并且文库上的P5/P7不可用于接种，因此不能检测到成簇强度。在图13C中，将300pM的PX文库引入正交杂交流动池
中而不变性(P5/P7接枝：1.1μM；PX接枝：0.07μM)。尽管其未变性，FC‑PX的存在允许文库接种和成簇，并且可检测到成簇强度。成簇强度结果示于图12中。

[0222] 实施例3

[0223] 通过用300pM的PX文库接种不同组的条件并成簇60分钟以测量占用率、强度和％PF来评估捕获剂表面密度和文库浓度之间的关系。PX输入浓度从0.3nM滴定至0.3μM，而P5/
P7接枝输入保持恒定在1.1μM。如通过荧光去杂交测定所测量，PX输入滴定导致PX基序的数
目从每孔平均约2条至2500条链变化，而P5/P7输入导致每个纳米孔约10000个P5/P7。

[0224] 从图15中可以看出，每个纳米孔的PX的最佳数目随着文库浓度的增加而降低。例如，对于75pM接种浓度，每个纳米孔625个PX导致最大％PF和C1强度，而以300pM接种仅需要
每个纳米孔39个PX就能达到类似的性能。利用正交杂交使％PF最大化所必需的PX基序的低
数目证实了使用本公开的正交接种策略的更有效接种方法。

[0225] 实施例4

[0226] 进行实验以证实正交接种可允许通过在较高成簇引物(P5/P7)接枝密度下工作而不影响克隆性来改善测序强度。从0.37μM至9.9μM进行P5/P7接枝滴定，同时用5nM的PX共接枝每个泳道(每个纳米孔39个pX)。通过保持每个纳米孔的PX数目恒定，图16示出C1强度通
过增加P5/P7密度而增加，而不显著影响克隆性(在9.9μM P5/P7下，％PF>70％)。

[0227] 实施例5

[0228] 通过向流动池中引入300pM的PX文库并在从流动池中洗涤任何未结合的文库之前温育不同量的时间来评估温度对正交接种策略的接种时间的影响。然后测量给定培养时间
的占用率。结果示出于图17至图18中。

[0229] 在第一个实验中，对于标准引物方法(用于接种/成簇的10,000个P5/P7)和正交方法(用于接种的300个PX/用于成簇的10,000个P5/P7)在40℃下进行。P5/P7输入：1.1μM；PX：
0μM、0.025μM；文库：PhiX；浓度：300pM；ExAmp：RAS6T；测量：在第1次碱基掺入后用Scope3获得的占用率。使用正交接种方法，每个纳米孔300个PX进行接种，在短时间接种后导致类似
的高水平占用率。

[0230] 重复该实验，但将正交接种方法的温度增加至50℃。P5/P7输入：1.1μM；PX：0μM、0.025μM；文库：PhiX；浓度：300pM；ExAmp：RAS6T；测量：在第1次碱基掺入后用Scope3获得的占用率。显示杂交速率在较高温度下提高，从而更快达到最大占用率。

[0231] 实施例6

[0232] 进行进一步的实验以证实簇信号强度相比于克隆性的改善。将利用正交接种策略的流动池与标准接种和成簇方案进行比较。评估了两种不同的P5/P7接枝浓度：1.1μM和更
高的6.6μM。预期在标准条件下的较高浓度会增强信号强度，但产生克隆性问题。图19示出
了系统的信号强度。

[0233] 图20示出了当文库和引物输入浓度都变化时所占用孔的％PF。这个度量提供了克隆性的最佳表示。可以看出，使用本公开的解耦接种方法，随着成簇引物的增加，克隆性没
有显著差异。换句话讲，成簇引物表面密度(例如P5/P7表面密度)不影响根据本公开的解耦
接种策略的克隆性。相反，在标准接种/成簇方案下，当引物密度增加时以及文库浓度是否
增加时，％PF都明显降低。

[0234] 图21集中于具有6.6μM输入的更高引物密度并示出了相比于文库浓度的占用％和总％PF。可以看出，使用每个纳米孔具有低数目的捕获(PX)位点的正交接种策略能够最小
化在纳米孔中捕获的链的数目。在低文库浓度下可以看到几乎100％的克隆性。随着文库浓
度的增加，占用率和总％PF增加。

[0235] 相反，使用具有6.6μM的高引物密度的非正交标准接种/成簇方法，所有浓度的占用率都是饱和的。流动池上的引物数目意味着占用率甚至不随文库浓度按比例变化。然而，
随着文库浓度增加，％PF降低。这是由于增加了纳米孔内的多克隆性。

[0236] 图22使用根据本公开的解耦策略调查错误率。使用解耦的接种方法，在低或更高的成簇引物密度下错误率没有差异。由于增加文库浓度，错误率也没有变化。在150个循环
之后，总误差被限制到最大约1％。相反，在标准方法下，存在更高的错误率，其随着引物密度和文库浓度的增加而增加。在高文库浓度和高引物密度下，错误率接近8％。

[0237] 还生成了进一步的数据，从而比较了正交与标准接种/簇生成。这些结果示出在下面的表1和表2中，并且证实了用正交杂交观察到的改善的克隆性，其导致对于在纳米孔内
的优势簇的更好的信噪比，并且进而导致更好的碱基调用能力(更低的错误率)和对定相/
预先定相的更好的抗性。

[0238]

[0239] 表1‑正交，300个PX

[0240]

[0241] 表2‑标准接种/成簇

[0242] 总之，本公开涉及正交捕获部分的用途，其将模板捕获与成簇解耦。这种解耦产生了许多优点。可控制流动池设计以优化模板捕获以确保克隆性，但也可优化成簇密度以使
信号最大化。由于最大化每个纳米孔仅接种一个模板的可能性的能力，这导致了提高的％
PF。由于最大化成簇引物的能力，这也导致信号强度的提高。另外，本公开导致降低的错误
率并由此改善信噪比。这实现了更长的运行，这又提供了系统优点。本公开可作为dsDNA文
库接种。这消除了使文库变性的需求，并且避免了关于再杂交和文库变性的问题。因此，在
整个过程中去除了步骤，并且可以通过避免文库变性的风险来提高可靠性。本公开还改善
了双衬垫技术和分流池成簇的可能性。

[0243] 序列表

[0244] SEQ ID NO:1：P5序列

[0245] AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC

[0246] SEQ ID NO:2：P7序列

[0247] CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT

[0248] SEQ ID NO:3P5'序列(与P5互补)

[0249] GTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT

[0250] SEQ ID NO:4P7'序列(与P7互补)

[0251] ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG

[0252] SEQ ID NO:5PX’‑P5：

[0253] 5’CCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCT/iSp9/AATGATACGGCGACCACCGA 3’

[0254] SEQ ID NO:6PX’‑P7：

[0255] 5’CCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCT/iSp9/CAAGCAGAAGACGGCATAC 3’SEQ ID NO:7PX基底序列：5’AGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGG/iSp9/U‑炔3’SEQ ID NO:8PX

[0256] AGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGG

[0257] SEQ ID NO:9cPX(PX')

[0258] CCTCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCT

[0259] SEQ ID NO:10PA

[0260] GCTGGCACGTCCGAACGCTTCGTTAATCCGTTGAG SEQ ID NO:11cPA(PA')

[0261] CTCAACGGATTAACGAAGCGTTCGGACGTGCCAGC

[0262] SEQ ID NO:12PB

[0263] CGTCGTCTGCCATGGCGCTTCGGTGGATATGAACT SEQ ID NO:13cPB(PB')

[0264] AGTTCATATCCACCGAAGCGCCATGGCAGACGACG

[0265] SEQ ID NO:14PC

[0266] ACGGCCGCTAATATCAACGCGTCGAATCCGCAACT

[0267] SEQ ID NO:15cPV(PC')

[0268] AGTTGCGGATTCGACGCGTTGATATTAGCGGCCGT SEQ ID NO:16PD

[0269] GCCGCGTTACGTTAGCCGGACTATTCGATGCAGC

[0270] SEQ ID NO:17 cPD(PD')

[0271] GCTGCATCGAATAGTCCGGCTAACGTAACGCGGC