[0001] 本发明属于分子生物学技术领域，尤其是基因测序，具体涉及一种可先捕获后测序的芯片及其测序方法。

[0002] 随着基因测序技术的发展，下一代测序技术(Next Generat ion Sequenc i ng，NGS)的应用在临床实践中越来越广泛，如肿瘤的靶向治疗与耐药监测，遗传疾病的筛查与诊断，急危重症领域的病原诊断等诸多方面。发展至今，NGS主要有mNGS和tNGS两种技术路线。mNGS是对样本中所有核酸序列进行测序，覆盖广，缺点是会测到大量除目标序列外的序列，造成数据浪费的同时也会结果判断造成负面影响。tNGS是对样本中目标序列进行捕获后再进行测序，靶标明确，可以去除非目标序列对测序的影响，大幅降低成本。

[0003] 目前被广泛使用的tNGS路线有多重PCR和杂交探针捕获。多重PCR局限于引物可能会相互结合，PCR产物之间会互相竞争资源，能同时捕获的靶标数量有限。杂交探针可以同时对大量不同靶标进行捕获，但是杂交探针容易捕获含有部分靶标序列的片段，且试剂成本和操作复杂度要远高于多重PCR。因此，亟需开发一种操作简单且降低成本的测序方法。

[0032] 下面结合具体实施方式对本发明中做进一步的阐述：

[0033] 便于更好地理解本发明，但并不限定本发明，下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

[0034] 实施例1

[0035] 本发明的一种测序芯片，组成如附图1所示，两张玻璃片组合成一张芯片，芯片内部上下表面，按一定的密度种上捕获文库的探针。如附图2所示，玻璃表面种有P5序列和带有杂交捕获目标的P7’序列。P5序列主要用于捕获富集后的文库桥式扩增。P7’序列上连有一段杂交捕获的特异序列(最后一碱基3’端为‑OH)，用于杂交捕获特定目标序列。P7’序列和特异捕获序列间通过一段EcoR1酶切位点连接，该位点被用于文库桥式扩增前去除特异捕获序列。

[0036] 实施例2

[0037] 本发明的另一目的就是为上述芯片提供一种测序方法，测序流程如附图3。

[0038] 与常规文库不同的是本发明文库P7’序列的3’端连有一段EcoR1酶切位点，在上机前，利用一段环化引物对单链文库进行环化处理，具体如附图4。环化处理是芯片上进行捕获并富集的目标序列的关键。环化文库后的文库进入芯片，若文库上有能够与捕获探针互补配对的序列，就会被捕获探针捕获，经滚环扩增在P7’上形成一条含有n个目标序列拷贝的长链，具体如附图5。加入酶切探针1、酶切探针2和EcoR1酶，酶切探针与长链结合，形成EcoR1酶切位点，酶切释放n个独立的含有目标序列文库和去除P7’上的捕获探针，含有目标序列的文库重新与芯片上的P5序列杂交，进行桥式扩增后，可对目标序列进行常规的测序，具体如附图6。对应的P5、P7、环化引物、酶切探针1和酶切探针2序列见表1。

[0039] 表1.P5、P7、环化引物、酶切探针1和酶切探针2序列

[0040]

[0041]

[0042] 按质量比，以人工合成Sp i ke：human DNA＝0.01:99.99的比例制备一份模拟DNA样本(Sp i ke序列见表2)。模拟样本为测试对象，分别用mNGS、多重PCR‑tNGS、探针捕获‑tNGS和本发明的方法建库上机(多重PCR引物、捕获探针和本发明捕获探针序列见表3)，测序使用75bp读长，每种方法重复三次，在相似的数据量下(如附图7)，分析Sp i ke RPM和Sp i ke每个碱基的测序深度。如附图8，本发明的Sp i ke RPM要明显高于其他三种方法。如附图9，本发明的方法对Sp i ke的覆盖度、均一度和测序深度均要优于其他三种。

[0043] 表2.Sp i ke序列

[0044]

[0045] 表3.多重PCR引物、捕获探针和本发明捕获探针序列

[0046]

[0047]

[0048]

[0049] 上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所述领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

[0050] 虽然已经通过示例对本发明的一些特定实施例进行了详细说明，但是本领域的技术人员应该理解，以上示例仅是为了进行说明，而不是为了限制本发明的范围。本领域的技术人员还应理解，可以对实施例进行多种修改而不脱离本发明的范围和精神。本发明的范围由所附权利要求来限定。