技术领域
[0001] 本发明属于中药组合物应用技术领域，涉及一种胃疡安合剂及其质量评价方法。
相关背景技术
[0002] 胃溃疡是一种常见消化系统疾病，其典型症状包括节律性上腹部不适、恶心、呕吐以及食欲减退、反酸等。可并发出血、穿孔、幽门梗阻，甚至有癌变风险。由于胃溃疡病程持续时间长、难以彻底根治，且并发症较多，因此对于患者的日常工作学习常常会带来诸多不利影响。胃溃疡的病因是多因素的，其中较为常见的有幽门螺旋杆菌感染、不良饮食习惯、压力过大或其他不良刺激等；胃溃疡的发病机理主要为以胃酸与胃蛋白酶为主的攻击因子与胃黏膜防御机制之间失去平衡导致的。也就是说，当胃黏膜所受到的损伤因素水平大于胃黏膜的防御因素水平时，就较容易形成溃疡。因此，减轻胃部炎症反应，保护胃黏膜免受损伤是治疗胃溃疡的重要手段。
[0003] 近年来，通过众多研究者对中药复方及单味药在治疗胃溃疡方面展开的研究，越来越多的中药复方及单味药被证实在治疗及预防胃溃疡方面具有显著的疗效。中药制剂具有标本兼治，毒副作用小、疗效更稳定等优势。例如专利文献中，CN105456595A一种治疗胃溃疡的中药制剂及其制备方法和用途，治疗胃溃疡的中药制剂，由以下重量份的原料组成：榕树气根20‑30份、鸟不宿20‑30份、焦神曲10‑20份、天葵子10‑20份、法半夏8‑12份、柿霜5‑
10份、煅瓦楞子5‑10份、马蹄香1‑5份、素馨花1‑5份、钟乳石1‑5份、海螵蛸1‑3份；但是存在抑制率不高。
[0004] 目前，中药组合物中中药多样，活性成分复杂，这些活性成分之间可能存在协同或拮抗作用，影响复方产品的疗效和安全性；同时，这些活性成分受环境因素、生物因素、人为因素等多种因素的影响，可能发生变质、降解、氧化等变化，导致其含量和活性的波动，从而影响中药产品的质量一致性。传统的中药原料质量评价方法，通常是以某一种或几种主要活性成分的含量作为评价指标，忽略了中药原料中其他成分对其疗效和安全性的影响，因此不能全面反映中药原料的整体质量特征。同时，对于中药制剂来说，组方不同，君臣佐使配伍不同，导致复方中的活性成分不同，因此，采用现有的评价方法难以对复杂成分中药组合物的质量进行有效评价以及准确控制。
具体实施方式
[0060] 现结合附图以及实施例对本发明保护的技术方案进行详细的阐述。
[0061] 本发明胃疡安合剂以具有地域特色的中药朱砂七为主药，方药组成如下：该方以朱砂七、虎杖、白及、泽泻、蒲黄、白花蛇舌草、败酱草、二色补血草、地榆炭、甘草为原料制成的汤剂。本方以朱砂七、白及为君，止血中兼以活血凉血，止血以塞其流，活血凉血以澄其源，单用二色补血草补血以复其旧，三药并用，共奏活血止血补血之功；方中虎杖、败酱草、泽泻、白花蛇舌草清热以利湿，既能解溃烂之标，又能兼溃烂之本，地榆为佐，助君药增加止血之用，且血遇黑则止，地榆炒黑，增加止血之功，蒲黄生用，化瘀效佳，配以甘草调和诸药，达止血补血利湿之功，从而构成止补兼顾，化瘀不伤正，补血不留邪，以利为主，以补为辅，共奏清热利湿，活血补血之功。
[0062] 本发明中，各个原料按照以下质量份协同作用，朱砂七5～30份、虎杖5～28份、白及7～24份、蒲黄5～15份、泽泻3～26份、地榆炭1～15份、败酱草1～15份、白花蛇舌草1～12份、二色补血草1～12份以及甘草1～8份。
[0063] 优选地，朱砂七10份、虎杖10份、白及10份、蒲黄10份、泽泻10份、地榆炭10份、败酱草10份、白花蛇舌草10份、二色补血草10份以及甘草5份。
[0064] 实施例1
[0065] 本实施例提供的胃疡安合剂是由以下原料制备而成：朱砂七10g、虎杖10g、白及10g、蒲黄10g、泽泻10g、地榆炭10g、败酱草10g、白花蛇舌草10g、二色补血草10g以及甘草
5g。
[0066] 本实施例中，胃疡安合剂的制备工艺是：向上述原料中加水，加水质量是原料质量的12倍，煎煮两次，每次60min；滤过，取滤液在60℃下减压浓缩，直至滤液中原料的料液比为1：3；在6000r/min下离心20min后，取上清液得到浓缩药液；最后加入5g矫味剂和抑菌剂，混匀，得到胃疡安合剂。抑菌剂的加入量参照制剂通则中合剂的抑菌剂使用限度。矫味剂是质量浓度为10％的蔗糖，抑菌剂为质量浓度为0.15％的山梨酸钠，久置后为棕褐色澄明液体。
[0067] 本实施例提供的胃疡安合剂，在制备时，采用水提煎煮法，以合剂为优选剂型，并采用离心法进行除杂，保证制剂安全稳定；选取蔗糖作为矫味剂，改善制剂适口性，选取山梨酸钾为抑菌剂，防止微生物繁殖；制备而成的胃疡安合剂在保持原有汤剂用药特点的情况下，具有清热解毒、止血补血等功效，具有一定预防和治疗消化性胃溃疡的作用；且质量稳定，服用方便。
[0068] 进一步利用动物实验，采用灌胃无水乙醇建立小鼠胃溃疡模型，通过观察胃黏膜损伤形态可知，本实施例提供的胃疡安合剂能显著改善胃黏膜损伤情况，黏膜组织完整性得到显著改善，黏膜受损情况轻微；通过计算溃疡指数以及溃疡抑制率，胃疡安合剂对胃溃疡抑制率达到60.61％，最高可达到67.62％，抑制率较高。可见，胃疡安合剂能够有效的抑制由无水乙醇诱导的小鼠急性胃溃疡的发生，对胃溃疡具有很好的抑制作用，能用于胃溃疡的治疗中。
[0069] 实施例2
[0070] 本实施例主要是通过采用薄层色谱法对处方中主要药材朱砂七、虎杖、白及、蒲黄、泽泻进行定性鉴别；并通过建立高效液相色谱(HPLC)法对朱砂七、虎杖中的活性成分白藜芦醇苷、大黄素‑8‑O‑β‑D‑葡萄糖苷、大黄素；蒲黄中活性成分香蒲新苷、异鼠李素‑3‑O‑新橙皮苷、白及中的活性成分白及苷、甘草中活性成分甘草酸铵进行定量分析；最后参照胃疡安合剂的相对密度、pH值，对胃疡安合剂的质量进行评价控制。
[0071] 本实施例中涉及的胃疡安合剂均为实施例1制备得到的。
[0072] 一、仪器和药品
[0073] 在对胃疡安合剂进行质量评价时，采用的仪器和药品如表1所示。
[0074] 表1定性鉴别采用的仪器和药品
[0075]
[0076]
[0077] 二、本实施例提供一种胃疡安合剂的质量评价方法包括以下步骤。
[0078] 1、薄层色谱法(TLC)定性鉴别
[0079] 采用薄层色谱法对胃疡安合剂中的朱砂七、虎杖、白及、蒲黄和泽泻进行定性鉴别。
[0080] 1.1朱砂七和虎杖的定性鉴别
[0081] 1.1.1溶液配制
[0082] 取胃疡安合剂5mL制成供试品溶液。
[0083] 具体的，取胃疡安合剂5mL，使用旋转蒸发仪旋干，残渣用甲醇溶解于5mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，备用。
[0084] 按照供试品溶液的制备方法，取朱砂七、虎杖对照药材各1g，分别制成对照药材溶液。
[0085] 按照供试品溶液的制备方法，取不含朱砂七、虎杖的胃疡安合剂阴性药材5g制成阴性对照溶液。
[0086] 再取大黄素对照品，加甲醇制成每lmL含1mg的溶液，作为对照品溶液。
[0087] 1.1.2鉴别过程
[0088] 按照薄层色谱法，吸取上述四种溶液各10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷‑甲醇‑甲酸为展开剂，三氯甲烷‑甲醇‑甲酸的体积比为10:0.5:0.1；展开，取出，晾干，喷以20％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，分别置日光和波长为365nm的紫外光灯下检视，结果参见图1。
[0089] 1.1.3鉴别结果
[0090] 由于朱砂七、虎杖两味药材中主成分极为相似，因此制备双阴性样品进行薄层对照。从图1的TLC定性鉴别结果可知，在与对照药材与对照品相应位置上，日光与紫外灯下显相同橙黄色斑点；阴性无干扰，斑点分离度较好。
[0091] 1.2白及的定性鉴别
[0092] 1.2.1溶液配制
[0093] 取胃疡安合剂5mL，制成供试品溶液。取胃疡安合剂5mL，使用旋转蒸发仪旋干，残渣用甲醇溶解于5mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，备用。
[0094] 按照供试品溶液的制备方法，取白及对照药材5g制成对照溶液。
[0095] 按照供试品溶液的制备方法，取不含白及的胃疡安合剂阴性药材5g制成阴性对照溶液。
[0096] 1.2.2鉴别过程
[0097] 分别吸取上述溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷‑甲醇‑水为展开剂，三氯甲烷‑甲醇‑甲酸的体积比为6:0.5:0.05；展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热数分钟，放置30～60min，置波长为365nm的紫外光灯下检视；结果参见图2。
[0098] 1.2.3鉴别结果
[0099] 参见图2的TLC鉴别结果可知，在与对照药材色谱相应的位置上，日光与紫外灯下显相同颜色荧光斑点；阴性无干扰，斑点分离度较好。
[0100] 1.3蒲黄的定性鉴别
[0101] 1.3.1溶液配制
[0102] 取胃疡安合剂10mL，加水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次10mL，合并正丁醇液，蒸干，残渣加乙醇4mL使溶解，作为供试品溶液。
[0103] 按照供试品溶液的制备方法，称取不含蒲黄的胃疡安合剂阴性药材5g制成阴性对照溶液。
[0104] 另取异鼠李素‑3‑O‑新橙皮苷对照品、香蒲新苷对照品，加乙醇分别制成每1mL各含1mg的溶液，作为对照品溶液。
[0105] 1.3.2鉴别过程
[0106] 照薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各2μL，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以丙酮‑水为展开剂，丙酮和水的体积比为1:2；展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，置波长为365nm的紫外光灯下检视，结果如图3所示。
[0107] 1.3.3鉴别结果
[0108] 参见图3的TLC鉴别结果可知，在与对照药材色谱相应的位置上，紫外灯下显相同颜色荧光斑点；阴性无干扰，斑点分离度较好。
[0109] 1.4泽泻的定性鉴别
[0110] 1.4.1溶液配制
[0111] 取胃疡安合剂5mL，加70％乙醇20ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸至无醇味，通过HP20型大孔吸附树脂柱(内径为1cm，柱高为5cm，30％乙醇湿法装柱)，用30％乙醇15ml洗脱，弃去洗脱液，再用70％乙醇15ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇lml使溶解，作为供试品溶液。
[0112] 另取泽泻对照药材2g，同法制成对照药材溶液。
[0113] 取不含泽泻的胃疡安合剂药材1份(5g)，同法制成阴性对照溶液。
[0114] 再取23‑乙酰泽泻醇B对照品，加甲醇制成每lmL含1mg的溶液，作为对照品溶液。
[0115] 1.4.2鉴别过程
[0116] 照薄层色谱法试验，吸取上述溶液各10μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以二氯甲烷‑甲醇为展开剂，二氯甲烷和甲醇的体积比为15:1；展开，取出，晾干，喷以2％香草醛硫酸溶液‑乙醇混合溶液，香草醛硫酸溶液‑乙醇的体积比为1:9；105℃加热至斑点显色清晰，分别置日光和波长为365nm的紫外光灯下检视；结果如图4所示。
[0117] 1.4.3鉴别结果
[0118] 参见图4的TLC鉴别结果可知，在与对照药材色谱相应的位置上，日光显相同颜色斑点，紫外灯下显相同蓝紫色荧光斑点；阴性无干扰，斑点分离度较好。
[0119] 2、高效液相色谱(HPLC)法定量分析
[0120] 利用高效液相色谱法对胃疡安合剂中的朱砂七、虎杖、蒲黄、白及和甘草这五个原料中的活性成分进行定量分析。
[0121] 具体的，利用高效液相色谱法对朱砂七中的活性成分白藜芦醇苷、大黄素‑8‑O‑β‑D‑葡萄糖苷和大黄素，虎杖中的活性成分白藜芦醇苷、大黄素‑8‑O‑β‑D‑葡萄糖苷和大黄素，蒲黄中活性成分香蒲新苷和异鼠李素‑3‑O‑新橙皮苷，白及中的活性成分白及苷，以及甘草中活性成分甘草酸铵进行定量分析。
[0122] 2.1分别配制混合对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液。
[0123] 混合对照品溶液的配制方式是：精密称取大黄素、大黄素‑8‑O‑β‑D‑葡萄糖苷、白藜芦醇苷、香蒲新苷、异鼠李素‑3‑O‑新橙皮苷、白及苷、甘草酸铵对照品0.85mg、4.60mg、4.45mg、0.65mg、1.00mg、2.25mg、1.25mg置于棕色容量瓶中，加甲醇定容至10mL，制成大黄‑1 ‑1 ‑1
素0.085mg·mL 、大黄素‑8‑O‑β‑D‑葡萄糖苷0.46mg·mL 、白藜芦醇苷0.445mg·mL 、香‑1 ‑1 ‑1
蒲新苷0.065mg·mL 异鼠李素‑3‑O‑新橙皮苷0.1mg·mL 、白及苷0.225mg·mL 、甘草酸‑1
铵0.125mg·mL 的混合对照品溶液。
[0124] 供试品溶液的配制方式是：取胃疡安合剂10mL，使用旋转蒸发仪旋干，残渣用甲醇溶解于5mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，得到供试品溶液。
[0125] 阴性样品溶液的配制方式是：按胃疡安合剂中原料比，分别得到不含朱砂七、虎杖、白及、蒲黄、甘草的药液阴性样品；分别取得到的药液阴性样品，并按照供试品溶液的方法，分别得到阴性样品溶液。
[0126] 2.2高效液相色谱定量分析
[0127] 分别取上述供试品溶液、混合对照品溶液以及阴性样品溶液，在相同的色谱条件进行定量分析。
[0128] 2.2.1高效液相色谱法的色谱条件
[0129] 色谱柱为Inertsil ODS‑3，规格250mm×4.6mm，5μm；检测波长220nm；流速1.0mL·‑1min ，柱温30℃；流动相：A相为乙腈溶液，B相为0.1％磷酸水；进样量为10μL；梯度洗脱条件如表2。
[0130] 表2梯度洗脱条件
[0131]
[0132]
[0133] 从图5的高效液相色谱的结果可以看出，阴性无干扰。
[0134] 2.3线性关系考察
[0135] 精密吸取混合对照品溶液2mL、1.5mL、1mL、0.5mL、0.2mL，移入2mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度；按照上述色谱条件测定峰面积，以对照品质量浓度(X)与峰面积(Y)作标准曲线，得回归方程。线性回归方程及线性范围结果见表3。
[0136] 表3 7种指标成分的线性范围考察结果
[0137]
[0138] 从表3可以看出：指标成分的线性相关系数在0.99以上，线性关系良好。
[0139] 2.4精密度试验
[0140] 精密吸取混合对照品溶液10μL，连续重复进样6次，按色谱条件测定相应峰面积。
[0141] 香蒲新苷、白藜芦醇苷、异鼠李素‑3‑O‑新橙皮苷、白及苷、大黄素‑8‑O‑β‑D‑葡萄糖苷、甘草酸铵、大黄素峰面积的RSD值分别为2.03％、2.14％、2.18％、2.17％、2.33％、2.44％、2.43％。表明该高效液相色谱仪精密度良好。
[0142] 2.5重复性试验
[0143] 精密移取同一批药液2mL，取复方提取液10mL，使用旋转蒸发仪旋干，残渣用甲醇溶解于5mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，备用。平行6份，精密吸取10μL，注入液相色谱仪测定。
[0144] 香蒲新苷、白藜芦醇苷、异鼠李素‑3‑O‑新橙皮苷、白及苷、大黄素‑8‑O‑β‑D‑葡萄‑1 ‑1 ‑1糖苷、甘草酸铵、大黄素的平均含量分别为0.044mg·mL 、0.156mg·mL 、0.013mg·mL 、‑1 ‑1 ‑1 ‑1
0.225mg·mL 、0.153mg·mL 、0.094mg·mL 、0.017mg·mL ；RSD值分别为2.68％、
1.79％、0.61％、0.44％、1.48％、0.56％、1.88％，表明试验所建立的色谱测试条件重复性良好。
[0145] 2.6稳定性试验
[0146] 精密移取同一批药液样品分别在0h、3h、6h、9h、12h、24h，按上述色谱条件测定，记录峰面积。
[0147] 香蒲新苷、白藜芦醇苷、异鼠李素‑3‑O‑新橙皮苷、白及苷、大黄素‑8‑O‑β‑D‑葡萄糖苷、甘草酸铵、大黄素峰面积的RSD值分别为1.53％、1.50％、2.30％、2.56％、2.57％、2.26％、2.51％，表明本品24h内稳定性良好。
[0148] 2.7加样回收率试验
[0149] 取重复性试验项下的样品1mL，平行6份，精密加入大黄素、大黄素‑8‑O‑β‑D‑葡萄糖苷、白藜芦醇苷、香蒲新苷、异鼠李素‑3‑O‑新橙皮苷、白及苷、甘草酸铵对照品适量，加乙醇分别制成每1mL各含1mg的溶液，测定含量。结果见表4。
[0150] 表4加样回收率试验结果(n＝6)
[0151]
[0152]
[0153] 从表4可以看出，香蒲新苷、白藜芦醇苷、异鼠李素‑3‑O‑新橙皮苷、白及苷、大黄素‑8‑O‑β‑D‑葡萄糖苷、甘草酸铵、大黄素的平均回收率为：100.33％、100.13％、99.71％、99.91％、100.08％、100.43％、100.02％，RSD值分别为：0.53％、0.41％、0.75％、0.50％、
1.10％、0.64％、0.50％。
[0154] 2.8耐用性试验
[0155] 考察不同色谱柱Inertsil ODS‑3色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)和Thermo BDS Hypersil C18色谱柱(5μm，4.6mm×150mm)保留时间与峰面积。
[0156] Inertsil ODS‑3色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)和Thermo BDS Hypersil C18色谱柱(5μm，4.6mm×150mm)，组分均达到较理想分离度，方法耐用性良好。
[0157] 2.9样品含量测定
[0158] 精密吸取8批合剂溶液样品(批号分别为220301、220401、220501、220601、220701、220801、220901和221001)各10mL，使用旋转蒸发仪旋干，残渣用甲醇溶解于5mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，备用。按规定色谱条件测定，计算各个成分的含量，结果如表5所示。
[0159] 表5 8批样品含量测定结果(单位mg·mL‑1)
[0160]
[0161] 8批样品中香蒲新苷、白藜芦醇苷、异鼠李素‑3‑O‑新橙皮苷、白及苷、大黄素‑8‑O‑‑1 ‑1β‑D‑葡萄糖苷、甘草酸铵、大黄素的平均含量分别为：0.052mg·mL 、0.17mg·mL 、‑1 ‑1 ‑1 ‑1 ‑1
0.018mg·mL 、0.223mg·mL 、0.183mg·mL 、0.115mg·mL 、0.012mg·mL 。
[0162] 2.3相对密度和pH值
[0163] 结合胃疡安合剂的相对密度、pH值、步骤1)所得到的定性鉴别结果以及步骤2)所获取得到的定量分析结果对胃疡安合剂的质量进行评价。
[0164] 2.3.1相对密度
[0165] 照相对密度测定法(中国药典2020版四部0601)对3批样品(批号分别为220301、220401、220501)进行测定。3批次样品相对密度检查结果见表6。
[0166] 表6相对密度检查结果(n＝3)
[0167]批号 220301 220401 220501
相对密度 1.11±0.14 1.08±0.17 1.10±0.16
[0168] 2.3.2pH值
[0169] 照pH值测定法(中国药典2020版四部0631)对3批样品((批号分别为220301、220401、220501)测定，3批次样品相对密度结果见表7。
[0170] 表7pH值测定结果
[0171] 批号 220301 220401 220501pH值 5.05±0.07 4.92±0.04 4.96±0.06
[0172] 2.3.3对胃疡安合剂外观、澄明度、气味进行检查，为棕褐色澄清液体，味苦微甜。
[0173] 综上所述，对胃疡安合剂中君药朱砂七、白及与主要药材虎杖、蒲黄、甘草中指标性成分：白藜芦醇苷、大黄素‑8‑O‑β‑D‑葡萄糖苷、大黄素、香蒲新苷、异鼠李素‑3‑O‑新橙皮苷、白及苷、甘草酸铵利用HPLC进行定量分析，液相谱图基线较为平稳，分离度较好。参照2020版《中国药典(四部)》胃疡安合剂相关检查，胃疡安合剂批次合剂样品进行相对密度以及pH值的检测结果符合药典标准。可见，本发明通过建立薄层色谱以及HPLC含量测定方法，能实现对胃疡安合剂有效、精准的质量评价与质量控制。
