[0001] 本发明涉及一种以蜡质型淀粉为原料制备耐热型淀粉纳米晶的方法，属于淀粉精加工领域。

[0002] 淀粉颗粒是由结晶区和无定形区域(非结晶区)交替排列形成的、类似于洋葱状的结构，也被称为生长环结构。淀粉纳米晶(Starch nanocrystals，简称SNCs)，则是通过对洋葱状的淀粉颗粒进行酸水解、酶解或物理处理，将淀粉的无定形区去除，所得到的剩余对酸具有抗性的纳米片层结晶部分；横向尺寸范围较广，从30nm到200nm不等，厚度通常为5‑10nm。SNCs较高的结晶度也赋予其良好的机械性能，同时具备了淀粉可再生、来源广泛、储量丰富、降解周期短、无毒害等特点。

[0003] 近年来，由于SNCs具有较大的比表面积、总表面能和含有大量活性羟基的高反应性表面，在作为药物载体、阻隔剂、颗粒稳定剂和纯化剂等方面也展现了巨大潜力。

[0004] 酸水解技术因其简单操作易控制，长期以来一直被用于SNCs的制备。淀粉颗粒是类似于洋葱的生长环结构，具有半结晶特性，其中相对疏松的无定形区(非结晶区)的主要成分是直链淀粉，结晶区的主要成分是支链淀粉，所以制备SNCs的原料一般选择蜡质型淀粉。

[0005] HCl和H2SO4都可用于水解淀粉制备SNCs；近年来，研究人员成功利用盐酸制备出了单晶片层，但存在处理时间长、产率低的缺陷。Angellier等利用响应面法优化了酸水解制备SNCs的方法：在40℃、100rpm下，用3.16M的稀H2SO4将浓度为14.69％的蜡质玉米淀粉水解5天，SNC的产率为15.7wt％，与HCl水解淀粉40天后获得的形状相同(盐酸水解淀粉产率只有0.5wt％)。H2SO4水解法得到的SNCs虽然产率得到了提高，但仍然处于较低的水平；SNCs表面的硫酸盐基团虽然有助于其在水溶液中的分散和稳定，但也降低了纳米晶的热稳定性。

[0038] 以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解实施例是为了更好地解释本发明，不用于限制本发明。

[0039] 1、淀粉结晶结构测定

[0040] 淀粉的结晶结构采用X‑射线衍射仪测定：取200mg淀粉置于100％湿度环境下平衡12h，随后利用D8衍射仪扫描淀粉样品。测定条件为：2θ范围4°‑40°；扫描速度4°/min加速电压45kV；电流40mA；样品结晶度的计算采用两相法：

[0041]

[0042] 其中，Ac为结晶域峰面积，Aa为无定形域峰面积。

[0043] 2、淀粉热稳定性测定

[0044] 淀粉纳米晶热稳定性采用差示扫描量热仪(DSC)测定，具体操作步骤如下：称取3.0mg淀粉纳米晶置于DSC坩埚中，随后以1：3的比例加入去离子水；密封坩埚，并在4℃冰箱中平衡12h，随后以空白坩埚作为对照样，利用DSC在20‑150℃范围内，以10℃/min的升温速率扫描样品。

[0045] 3、淀粉纳米晶得率测定

[0046] 将冻干淀粉纳米晶收集，并用精密天平法测定其重量，淀粉纳米晶得率计算如下：

[0047]

[0048] 其中，mn为淀粉纳米晶的重量(g)，ms为淀粉酸水解前的重量(g)。

[0049] 4、淀粉纳米晶粒径测定

[0050] 在实施例步骤(4)中，将调pH后的淀粉水解液稀释1000倍，随后利用纳米粒度仪测定淀粉纳米晶的粒径分布。

[0051] 本发明实施例中涉及淀粉蔗糖酶(amylosucrase，EC 2.4.1.4)、异淀粉酶(Isoamylase，EC 3.2.1.68)、普鲁兰酶(Pullulanase，EC 3.2.1.41)，其中淀粉蔗糖酶的酶活为300U/mL；异淀粉酶、普鲁兰酶为Megazyme公司商业酶，普鲁兰酶酶活为650U/mL，异淀粉酶酶活为200U/mL。

[0052] 实施例1

[0053] 一种耐热型淀粉纳米晶的制备方法，具体包括如下步骤：

[0054] (1)称取4.0g糯米淀粉(干基)，放入500mL烧杯中，加入160mL 50mmol/L Tris‑HCl(pH 7.0)缓冲溶液，并于沸水浴中搅拌加热30min；之后冷却至室温，加入40mL 1.0mol/L蔗糖溶液和100U淀粉蔗糖酶，在25℃水浴锅中以50rpm搅拌速度反应10min；反应结束后，将反应液置于沸水浴中加热10min灭酶；灭酶处理后将所得混合物置于4℃冰箱中回生处理24h，随后6000g离心15min；以去离子水洗涤沉淀2次，洗涤后的沉淀在‑45℃条件下冻干48h，所得冻干淀粉研磨过100目筛，得到淀粉蔗糖酶改性淀粉；

[0055] (2)称取2.0g(干基)步骤(1)制备的淀粉蔗糖酶改性淀粉分散于50mL 100mmol/L醋酸钠(pH 5.0)缓冲溶液中，并置于灭菌锅中，121℃热处理20min；冷却至40℃后，加入50U异淀粉酶，并以50rpm搅拌速度反应1h；待反应结束后，将反应液置于沸水浴中加热10min灭酶，所得反应液与150mL无水乙醇混合；以6000g离心处理混合物15min，获得淀粉沉淀；以去离子水洗涤沉淀2次，洗涤后的沉淀在‑45℃条件下冻干处理24h，得到冻干淀粉；

[0056] (3)称取5.0g步骤(2)制备的冻干淀粉，加水并调节淀粉溶液水分含量至20％(W/W)，随后将淀粉溶液密封，置于4℃冰箱中平衡处理12h；然后再置于100℃的烘箱中，热处理0.5h；待淀粉冷却至室温后，重复烘箱处理(100℃，0.5h)1次；之后再在40℃烘箱中烘干
24h，得烘干淀粉(酶改性‑湿热处理)；

[0057] (4)称取10.0g步骤(3)制备的烘干淀粉，分散于50mL 2.0mol/L H2SO4溶液中，形成混合物，随后将混合物置于25℃水浴锅中，并以100rpm搅拌速度反应2天；然后采用1.0mol/L氢氧化钠，将反应混合物的pH调节至6.0；之后将反应混合物于10000g离心处理15min，获得淀粉纳米晶沉淀，采用去离子水洗涤淀粉纳米晶沉淀2次，随后10000g离心处理15min，取沉淀，在‑45℃条件下冷冻干燥36h，即得耐热型淀粉纳米晶。

[0058] 实施例2

[0059] 一种耐热型淀粉纳米晶的制备方法，具体包括如下步骤：

[0060] (1)称取4.0g蜡质玉米淀粉(干基)，放入500mL烧杯中，加入140mL 50mmol/L Tris‑HCl(pH 7.0)缓冲溶液，并于沸水浴中搅拌加热30min；之后冷却至室温，加入60mL 1.0mol/L蔗糖溶液和250U淀粉蔗糖酶，在30℃水浴锅中以150rpm搅拌速度反应30min；反应结束后，将反应液置于沸水浴中加热10min灭酶；灭酶处理后将所得混合物置于4℃冰箱中回生处理36h，随后6000g离心15min；以去离子水洗涤沉淀2次，洗涤后的沉淀在‑45℃条件下冻干48h，所得冻干淀粉研磨过100目筛，得淀粉蔗糖酶改性淀粉；

[0061] (2)称取2.0g(干基)步骤(1)制备的淀粉蔗糖酶改性淀粉分散于150mL 100mmol/L醋酸钠(pH 5.0)缓冲溶液中，并置于灭菌锅中，121℃热处理20min；冷却至45℃后，加入75U异淀粉酶，并以150rpm搅拌速度反应3h；待反应结束后，将反应液置于沸水浴中加热15min灭酶，所得反应液与300mL无水乙醇混合；以6000g离心处理混合物15min，获得淀粉沉淀；以去离子水洗涤沉淀2次，洗涤后的沉淀在‑55℃条件下冻干处理36h，得到冻干淀粉；

[0062] (3)称取5.0g步骤(2)制备的冻干淀粉，加水并调节淀粉溶液水分含量至25％(W/W)，随后将淀粉溶液密封，置于4℃冰箱中平衡处理24h；然后再置于110℃的烘箱中，热处理1h；待淀粉冷却至室温后，重复烘箱处理(110℃，1h)1次；之后再在50℃烘箱中烘干24h，得烘干淀粉(酶改性‑湿热处理)；

[0063] (4)称取10.0g步骤(3)制备的烘干淀粉，分散于75mL3.0 mol/L H2SO4溶液中，形成混合物，随后将混合物置于35℃水浴锅中，并以100rpm搅拌速度反应4天；然后采用1.0mol/L氢氧化钠，将反应混合物的pH调节至7.0；之后将反应混合物于10000g离心处理15min，获得淀粉纳米晶沉淀，采用去离子水洗涤淀粉纳米晶沉淀2次，随后10000g离心处理15min，取沉淀，在‑55℃条件下冷冻干燥36h，即可得耐热型淀粉纳米晶。

[0064] 实施例3

[0065] 一种耐热型淀粉纳米晶的制备方法，具体包括如下步骤：

[0066] (1)称取4.0g蜡质马铃薯淀粉(干基)，放入500mL烧杯中，加入120mL 50mmol/LTris‑HCl(pH 7.0)缓冲溶液，并于沸水浴中搅拌加热35min；之后冷却至室温，加入80mL1.0mol/L蔗糖溶液和500U淀粉蔗糖酶，在35℃水浴锅中以300rpm搅拌速度反应60min；
反应结束后，将反应液置于沸水浴中加热30min灭酶；灭酶处理后将所得混合物置于4℃冰箱中回生处理48h，随后10000g离心30min；以去离子水洗涤沉淀3次，洗涤后的沉淀在‑45℃条件下冻干48h，所得冻干淀粉研磨过200目筛，得淀粉蔗糖酶改性淀粉；

[0067] (2)称取2.0g(干基)步骤(1)制备的淀粉蔗糖酶改性淀粉分散于200mL 100mmol/L醋酸钠(pH 5.0)缓冲溶液中，并置于灭菌锅中，121℃热处理40min；冷却至50℃后，加入100U普鲁兰酶，并以300rpm搅拌速度反应6h；待反应结束后，将反应液置于沸水浴中加热
20min灭酶，所得反应液与250mL无水乙醇混合；以10000g离心处理混合物30min，获得淀粉沉淀；以去离子水洗涤沉淀4次，洗涤后的沉淀在‑45℃条件下冻干处理48h，得冻干淀粉；

[0068] (3)称取5.0g步骤(2)制备的冻干淀粉，加水并调节淀粉溶液水分含量至35％(W/W)，随后将淀粉溶液密封，置于4℃冰箱中平衡处理36h；然后再置于120℃的烘箱中，热处理2h；待淀粉冷却至室温后，重复烘箱处理(120℃，2h)1次；之后再在60℃烘箱中烘干48h，得烘干淀粉(酶改性‑湿热处理)；

[0069] (4)称取10.0g步骤(3)制备的烘干淀粉，分散于100mL4.0 mol/L H2SO4溶液中，形成混合物，随后将混合物置于45℃水浴锅中，并以100rpm搅拌速度反应6天；然后采用1.0mol/L氢氧化钠，将反应混合物的pH调节至8.0；之后将反应混合物于12000g离心处理
30min，获得淀粉纳米晶沉淀，采用去离子水洗涤淀粉纳米晶沉淀4次，随后12000g离心处理
30min，取沉淀，在‑45℃条件下冷冻干燥48h，即得耐热型淀粉纳米晶。

[0070] 对比例1

[0071] 一种耐热型淀粉纳米晶的制备方法，所述方法包括如下：

[0072] 称取10.0g蜡质玉米淀粉，分散于75mL 3.0mol/L H2SO4溶液中，随后将混合物置于35℃水浴锅中，并以100rpm搅拌速度反应4天；然后采用1.0mol/L氢氧化钠，将反应混合物的pH调节至7.0；之后将反应混合物于10000g离心处理15min，获得淀粉纳米晶沉淀；采用去离子水洗涤淀粉纳米晶沉淀2次，随后10000g离心处理15min，所得样品在‑55℃条件下冷冻干燥36h，即得淀粉纳米晶。

[0073] 对比例2(与实施例2的区别是，省去了步骤(1)和步骤(2))

[0074] 一种耐热型淀粉纳米晶的制备方法，所述方法包括如下：

[0075] (1)称取5.0g蜡质玉米淀粉，加水并调节淀粉溶液水分含量至25％(W/W)，随后将蜡质玉米淀粉溶液密封，置于4℃冰箱中平衡处理24h；然后再置于110℃的烘箱中，热处理1h；待淀粉冷却至室温后，重复烘箱处理(110℃，1h)1次；之后再在50℃烘箱中烘干24h，得烘干淀粉；

[0076] (2)称取10.0g步骤(1)制备的烘干淀粉，分散于75mL 3.0mol/L H2SO4溶液中，随后将混合物置于35℃水浴锅中，并以100rpm搅拌速度反应4天；然后采用1.0mol/L氢氧化钠，将反应混合物的pH调节至7.0；之后将反应混合物于10000g离心处理15min，获得淀粉纳米晶沉淀；采用去离子水洗涤淀粉纳米晶沉淀2次，随后10000g离心处理15min，所得样品在‑55℃条件下冷冻干燥36h，即得耐热型淀粉纳米晶。

[0077] 对比例3(与实施例2的区别仅在于，省去了步骤(3)处理过程)

[0078] 一种耐热型淀粉纳米晶的制备方法，所述方法包括如下：

[0079] (1)称取4.0g蜡质玉米淀粉(干基)，放入500mL烧杯中，加入140mL 50mmol/L Tris‑HCl(pH 7.0)缓冲溶液，并于沸水浴中搅拌加热30min；之后冷却至室温，加入60mL 1.0mol/L蔗糖溶液；加入250U淀粉蔗糖酶，在30℃水浴锅中以150rpm搅拌速度反应30min；
反应结束后，将反应液置于沸水浴中加热10min灭酶；灭酶处理后将所得混合物置于4℃冰箱中回生处理36h，随后6000g离心15min；以去离子水洗涤沉淀2次，洗涤后的沉淀‑45℃条件下冻干48h，所得冻干淀粉研磨过100目筛，得淀粉蔗糖酶改性淀粉；

[0080] (2)称取2.0g(干基)步骤(1)制备的淀粉蔗糖酶改性淀粉分散于150mL 100mmol/L醋酸钠(pH 5.0)缓冲溶液中，并置于灭菌锅中，121℃热处理20min；冷却至45℃后，加入75U异淀粉酶，并以150rpm搅拌速度反应3h；待反应结束后，将反应液置于沸水浴中加热15min灭酶，所得反应液与300mL无水乙醇混合；以6000g离心处理混合物10min，获得淀粉沉淀；以去离子水洗涤沉淀2次，洗涤后的沉淀冻干处理36h，得到冻干淀粉；

[0081] (3)称取10.0g步骤(2)制备的冻干淀粉，分散于75mL 3.0mol/L H2SO4溶液中，随后将混合物置于35℃水浴锅中，并以100rpm搅拌速度反应4天；然后采用1.0mol/L氢氧化钠，将上述所得反应混合物的pH调节至7.0；之后将反应混合物于11000g离心处理20min，获得淀粉纳米晶沉淀；采用去离子水洗涤淀粉纳米晶沉淀3次，随后11000g离心处理20min，所得样品冷冻干燥36h，即得淀粉纳米晶。

[0082] 对比例4

[0083] 称取4.0g蜡质玉米淀粉(干基)，放入500mL烧杯中，加入140mL 50mmol/L Tris‑HCl(pH 7.0)缓冲溶液，并于沸水浴中搅拌加热30min；之后冷却至室温，加入60mL 1.0mol/L蔗糖溶液和250Uα‑淀粉酶，在30℃水浴锅中以150rpm搅拌速度反应30min；反应结束后，将反应液置于沸水浴中加热10min灭酶；灭酶处理后将所得混合物置于4℃冰箱中回生处理36h；由于α‑淀粉酶水解淀粉大分子，产生小分子糖或糊精，导致无法回生得到淀粉颗粒，故无法通过α‑淀粉酶改性修饰糯米淀粉从而制备淀粉纳米晶。

[0084] 结果测定

[0085] 1、对实施例1‑3和对比例1‑3中的各形态淀粉进行相对结晶度和糊化温度测定，结果如表1所示：

[0086] 表1.实施例1‑3和对比例1‑3中的各形态淀粉及淀粉纳米晶的相对结晶度和峰值糊化温度

[0087]

[0088]

[0089] 由表1和图2可知，蜡质型淀粉的相对结晶度为40.3％(糯米淀粉，实施例1)、42.1％(蜡质玉米淀粉，实施例2)、42.3％(蜡质马铃薯淀粉，实施例3)；经过酶法改性、湿热循环处理，淀粉的相对结晶度大幅度提高，从47.6％(实施例1)提高至60.8％(实施例3)，主要原因在于淀粉分子经过支链延长修饰、脱支处理后，线性淀粉链容易重结晶(支链延长程度越高或脱支程度越高，淀粉的结晶度越高)，且循环湿热处理促进了淀粉链在结晶层面的有序重排(对比例2)，导致改性淀粉的结晶度进一步增加。

[0090] 同时，由对比例4可知，淀粉蔗糖酶优异的转糖基特性是延长支链长度的关键，例如用常规的α‑淀粉酶无法实现淀粉支链延长，且容易导致淀粉水解，无法得到结构稳定的重结晶淀粉。此外，实施例1‑3中的淀粉纳米晶的相对结晶度为69.6％‑75.2％，对比例1‑3中淀粉纳米晶的相对结晶度为56.9％‑60.5％，显著高于实施例或对比例中原料的结晶度，说明酸处理主要水解淀粉的无定形区域，即按照本发明的方法可获得高结晶度的淀粉纳米晶。

[0091] 由图3可知，天然蜡质型淀粉原料的热稳定性相对较低，如实施例中的糯米淀粉、蜡质玉米淀粉、蜡质马铃薯淀粉的糊化温度为73.2℃、72.2℃、75.4℃，导致直接利用天然淀粉制备的纳米晶的热稳定性较低，如对比例1中酸处理蜡质玉米淀粉得到的淀粉纳米晶的糊化温度仅为66.3℃。湿热循环处理在一定程度上提高了淀粉原料的热稳定性，如对比例2中，蜡质玉米淀粉经过湿热循环处理后，其糊化温度略微提高至77.4℃，最终酸解得到的淀粉纳米晶的糊化温度也仅为72.3℃。由对比例3可知，蜡质玉米淀粉经过酶法修饰后(反应条件与实施例2相同)，其糊化温度快速提高至95.1℃，相应得到的淀粉纳米晶糊化温度可达90.8℃，这主要是因为分子结构层面的修饰(支链延长修饰及脱支处理)，提高了淀粉双螺旋结构的稳定性，即线性淀粉链越长，形成的双螺旋越长，导致其热解旋的温度越高。然而，淀粉链的重结晶受限于热力学定律，导致其结晶度较低，即对比例3中酶改性蜡质玉米淀粉的结晶度仅为38.7％。

[0092] 2、对实施例1～3和对比例1～3制备的淀粉纳米晶进行粒径测定

[0093] 结果如图4所示：实施例1‑3中淀粉纳米晶的平均粒径为85.5～215.3nm，而对比例1‑3中淀粉纳米晶的平均粒径为72.3～341.9nm。

[0094] 3、实施例1～3和对比例1～3制备的淀粉纳米晶得率

[0095] 表2.实施例1‑3和对比例1‑3中淀粉纳米晶得率

[0096]

[0097] 由表2数据可知，实施例1‑3淀粉纳米晶的得率为31.5％‑54.3，其中酶修饰或湿热循环处理程度越高，淀粉纳米晶的得率越高。然而，利用天然蜡质玉米淀粉为原料制备淀粉纳米晶的得率仅为9.7％(对比例1)。蜡质玉米淀粉经过循环湿热处理后，其淀粉纳米晶的得率也仅为11.5％(对比例2)。与原淀粉相比(对比例1)，利用酶改性蜡质米淀粉制备淀粉纳米晶的得率显著提高，但其增加幅度仍有限，这主要是酶改性淀粉的相对结晶度只有38.7％。

[0098] 综上，利用本发明方法制备的新淀粉纳米晶具有得率高、热稳定好等优点。