[0001] 本发明涉及作为SARS‑CoV‑2用疫苗的重组牛痘病毒等。

[0002] 由高致病性新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)引起的感染症(COVID‑19)的感染人数在2020年7月确认时全世界已经超过1600万人，日本则超过3万人，其中死亡人数在全世界已超过65万人，日本也达到了约1000人。

[0003] 另外，COVID‑19康复者中，约30％在病毒清除后免疫诱导并不充分(非专利文献1)，SARS‑CoV‑2的再感染风险令人担忧。另一方面，感冒冠状病毒感染所诱导的免疫在感染后的1、2年之类的较短时间内下降、消失，周期性地反复发生感染。因此认为，现状是多数人对SARS‑CoV‑2不具有免疫、感染过一次的患者也会在短时间内发生免疫下降、今后也会在全世界持续蔓延，需要开发能够强力地诱导免疫且能够长期维持免疫的COVID‑19预防疫苗(SARS‑CoV‑2用疫苗)。

[0004] 另外，持续蔓延可能引发SARS‑CoV‑2的基因变异，因此需要具有也能够应对与变异相伴随的抗原性变化的、广泛的交叉反应性的疫苗。进而，在2002年出现了SARS冠状病毒(CoV)后，短期内出现了MERS‑CoV、此次的SARS‑CoV‑2等能感染人的新型CoV，今后也许还会出现未知的CoV。因此，对多种CoV显示防御效果的泛CoV感染症预防疫苗的开发也是重要的课题。

[0005] 现有技术文献

[0006] 非专利文献1：MedRxiv，2020(Fan  Wu et al.，Neutralizing antibody responses to SARS‑CoV‑2in a COVID‑19recovered patient cohort and their implications.，medRxiv preprint doi：

[0007] https：//doi.org/10.1101/2020.03.30.20047365.)

[0063] 以下对本发明进行详细说明。本发明的范围不受这些说明限定，除了以下的例示以外，也可以在不损害本发明主旨的范围内适当变更而实施。需要说明的是，本说明书包括作为本申请的优先权基础的日本特愿2020‑130717号说明书(令和2年(2020年)7月31日申请)、日本特愿2020‑215454号说明书(令和2年(2020年)12月24日申请)、及日本特愿2021‑078781号说明书(令和3年(2021年)5月6日申请)的全部内容。本说明书中引用的全部出版物、例如现有技术文献及公开公报、专利公报等专利文献均作为参考而整合于本说明书。

[0064] 1.本发明的概要

[0065] 目的在于，开发作为针对新型冠状病毒感染症(COVID‑19)的预防疫苗的、向驯化天花疫苗即牛痘病毒并高度减毒而成的DIs株中导入SARS‑CoV‑2来源的基因的基因重组活疫苗并早期实用化。通过将牛痘病毒用作母体，可期待诱导出如下免疫：接种疫苗后能够在短期内强力地诱导针对SARS‑CoV‑2的免疫，所赋予的免疫能够长期持续，并且也具有能够应对抗原变异的广泛交叉反应性。

[0066] 作为COVID‑19预防疫苗(SARS‑CoV‑2用疫苗)的候选，本发明人：1)根据作为SARS疫苗的实际成绩(图1、图3)建立了表达刺突蛋白(S蛋白)的基因重组疫苗(抗体诱导及T细胞诱导型)，所述刺突蛋白在病毒粒子表面露出且在向细胞的吸附和感染中很重要；2)表达非结构蛋白基因区(ORF1b)的基因重组疫苗(T细胞诱导型)，所述非结构蛋白基因区是冠状病毒基因组上基因序列同源性最高的区域(Zhou et al.，Nature.2020Mar；579(7798)：270‑273))(图2)，编码病毒复制所需的蛋白。

[0067] 以往建立并进行了评价的表达SARS‑CoV的S蛋白的重组疫苗能够在接种后1周内诱导中和抗体，防御SARS‑CoV对小鼠的攻击感染(Fumihiko Yasui et al.，J Immunol，181：6337‑6348(2008))(图1)。另外，对于接种了天花疫苗的兔子，能够与对未致敏兔子接种时同等地诱导SARS‑CoV特异性免疫(Masahiro Kitabatake et al.，Vaccine，25：630‑
637(2007))(图3)。因此认为，即使对于属于COVID‑19重症化风险组的、有天花疫苗接种史的老年阶层而言，重组牛痘病毒也有效。而且，为了确保更高的安全性，本发明人们还开发了使用国立预防卫生研究所多贺谷勇博士等在鸡成纤维细胞(CEF)中驯化开发的、在多种正常哺乳动物细胞中无增殖性的高度减毒的牛痘病毒DIs株(Isamu Tagaya et al.，Nature，192：381‑382，1961)作为母体的重组疫苗。使用DIs株的SARS‑S疫苗也能够防御SARS‑CoV感染(Koji Ishii et al.，Virology，351(2)：368‑380，2006)。另外，本发明人们还进行了DIs母体的表达H5亚型及H7型血凝素(HA)蛋白基因的重组禽流感疫苗(rDIs‑H5 HA及rDIs‑H7 HA)的开发，已证实：在疫苗接种后1周这样的短时间内发挥发病防御效果；一次所赋予的免疫在小鼠模型中显示出可称为终生免疫的长期免疫持续效果。基于这些发现，进行了可表达SARS‑CoV‑2病毒结构蛋白基因及非结构蛋白基因的重组牛痘病毒(牛痘疫苗)的制作(图4、5)。

[0068] 2.重组牛痘病毒的制作

[0069] 作为SARS‑CoV‑2的编码蛋白的所有基因、编码外壳蛋白区域的基因、及编码复制相关的非结构蛋白区域的基因的信息，具体而言SARS‑CoV‑2病毒株：hCoV‑19/Japan/AI/I‑004/2020的基因序列信息(序列号9)在NCBI网站(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)中以GenBank登录号：LC521925进行了登录。

[0070] 因此，本发明的重组牛痘病毒所含的基因、即包含SARS‑CoV‑2的非结构蛋白区域或结构蛋白区域的基因可通过常规基因工程学方法得到。例如，可以使用通常作为基因工程学方法使用的、利用DNA合成装置的核酸合成法。另外可以使用：在分离或合成作为模板的基因序列后对各基因设计特异性的引物、并且利用PCR装置扩增该基因序列的PCR法；或者，利用克隆载体的基因扩增法。上述方法可以由本领域技术人员按照“Molecular cloning 4th Edt.Cold Spring Harbor Laboratory Press(2012)”等来进行。得到的PCR产物的纯化可以使用公知的方法。

[0071] 本发明中，将SARS‑CoV‑2的全部基因区域中的编码非结构蛋白区域或结构蛋白区域的基因DNA用于重组牛痘病毒的制作。该非结构蛋白区域为包含ORF1a、ORF1b、ORF3a、ORF6、ORF7a、ORF7b、ORF8、及ORF10区域的区域，本发明中优选选择并使用例如ORF1b区域。另外，该结构蛋白区域为包含刺突(S)、包膜(E)、膜(M，integral membrane)、及核衣壳(N)区域的区域，本发明中例如优选选择并使用刺突(S)蛋白区域。

[0072] 本发明中，将编码来自SARS‑CoV‑2的非结构蛋白区域中的ORF1b区域的碱基序列DNA示于序列号1，将编码来自SARS‑CoV‑2的结构蛋白区域中的S蛋白区域的碱基序列DNA示于序列号5。进而，将编码上述ORF1b区域的碱基序列DNA的变异型DNA(为了提高在重组牛痘病毒中的基因表达效率，在编码ORF1b区域的碱基序列DNA中将第6位的碱基置换为其它碱基而成的DNA)示于序列号3，将编码上述S蛋白区域的碱基序列DNA的变异型DNA(为了提高在重组牛痘病毒中的基因表达效率，在编码S蛋白区域的碱基序列DNA中将第8位的碱基置换为其它碱基而成的DNA)示于序列号7。但是，除了由序列号1、3、5及7所示的碱基序列构成的DNA以外，以下的DNA也可以用于本发明。

[0073] 与由序列号1所示的碱基序列的互补碱基序列构成的DNA具有80％以上、90％以上、95％以上、98％以上或99％以上的同一性(同源性)、并且编码SARS‑CoV‑2来源的非结构蛋白的DNA(ORF1b区域的变异型DNA)。

[0074] 与由序列号3所示的碱基序列的互补碱基序列构成的DNA具有80％以上、90％以上、95％以上、98％以上或99％以上的同一性(同源性)、并且编码SARS‑CoV‑2来源的非结构蛋白的DNA(在ORF1b区域中加入了前述碱基置换变异的区域的变异型DNA)。

[0075] 与由序列号5所示的碱基序列的互补碱基序列构成的DNA具有80％以上、90％以上、95％以上、98％以上或99％以上的同一性(同源性)、且编码SARS‑CoV‑2来源的结构蛋白的DNA(S蛋白区域的变异型DNA)。

[0076] 与由序列号7所示的碱基序列的互补碱基序列构成的DNA具有80％以上、90％以上、95％以上、98％以上或99％以上的同一性(同源性)、且编码SARS‑CoV‑2来源的结构蛋白的DNA(在S蛋白区域中加入了前述碱基置换变异的区域的变异型DNA)。

[0077] 与由序列号1所示的碱基序列的互补碱基序列构成的DNA在严谨条件下杂交、且编码SARS‑CoV‑2来源的非结构蛋白的DNA(ORF1b区域的变异型DNA)。

[0078] 与由序列号3所示的碱基序列的互补碱基序列构成的DNA在严谨条件下杂交、且编码SARS‑CoV‑2来源的非结构蛋白的DNA(在ORF1b区域中加入了前述碱基置换变异的区域的变异型DNA)。

[0079] 与由序列号5所示的碱基序列的互补碱基序列构成的DNA在严谨条件下杂交、且编码SARS‑CoV‑2来源的结构蛋白的DNA(S蛋白区域的变异型DNA)。

[0080] 与由序列号7所示的碱基序列的互补碱基序列构成的DNA在严谨条件下杂交、且编码SARS‑CoV‑2来源的结构蛋白的DNA(在S蛋白区域中加入了前述碱基置换变异的区域的变异型DNA)。

[0081] 在此，“编码SARS‑CoV‑2来源的非结构蛋白”是指：编码当病毒增殖时细胞中所产生的蛋白。另外，上述编码非结构蛋白的基因除了包括全长序列以外，还包括其的部分序列。

[0082] 另外，“编码SARS‑CoV‑2来源的结构蛋白”是指：编码构成病毒外壳的蛋白。另外，上述编码结构蛋白的基因除了包括全长序列以外，还包括其的部分序列。

[0083] 上述变异型DNA可以通过化学合成而得到，或者以序列号1、3、5或7所示的碱基序列所构成的DNA或其片段为探针并利用菌落杂交、噬斑杂交、DNA印迹等公知的杂交法由cDNA文库及基因组文库得到。另外，作为上述杂交中的严谨条件，可列举例如0.1×SSC～10×SSC、0.1％～1.0％SDS及20℃～80℃的条件，更详细而言，可列举在37℃～56℃下进行30分钟以上的预杂交后在0.1×SSC、0.1％SDS中在室温下进行1～3次10～20分钟的洗涤的条件。关于杂交法的详细步骤，可以参考“Molecular cloning 4th Edt.Cold Spring Harbor Laboratory Press(2012)”等。

[0084] 本发明的重组牛痘病毒的制作中没有特别限定，可以采用公知的任意的方法，例如，首先将编码SARS‑CoV‑2的非结构蛋白区域(ORF1b区域等)、结构蛋白区域(S蛋白区域等)的碱基序列DNA插入期望的表达载体(质粒)(例如DIs株同源重组载体(质粒)(Koji Ishii et al.Virology 2006))。然后将该质粒载体转染至期望的牛痘病毒株(例如弱毒牛痘病毒DIs株)感染细胞，在牛痘病毒的基因组内引起同源重组，可以制作表达SARS‑CoV‑2的非结构蛋白或结构蛋白的期望区域的重组牛痘病毒。作为该表达载体，没有特别限定，可以使用例如具有DIs株同源基因序列区域的pSMART(注册商标)载体等，本发明的重组牛痘病毒所含的表达启动子可以使用以往用于牛痘病毒基因表达的各种表达启动子(例如mH5启动子等)。

[0085] 需要说明的是，上述的弱毒牛痘病毒DIs株是由作为天花疫苗的大连株(DIE)通过1日鸡胚传代法建立的宿主范围基因缺损体，经过了高度减毒，仅能够在鸡胚成纤维(Chick Embryo Fibroblast，CEF)细胞中增殖，由国立预防卫生研究所(现国立感染症研究所)的多贺谷勇博士开发(Tagaya etal.Nature，192：381‑382，1961)。由于大范围的基因缺损而无法在小鼠、豚鼠、兔子、人等几乎所有哺乳动物细胞中增殖。因此，即使万一被接种到免疫缺陷、免疫抑制患者体内也能够确保安全性。

[0086] 对于所制作的重组牛痘病毒，可以以病毒基因组为模板并利用对SARS‑CoV‑2的非结构蛋白区域基因或结构蛋白区域基因特异性的引物进行PCR，来确认期望的非结构蛋白区域或结构蛋白区域的基因导入。

[0087] 另外，对于期望的非结构蛋白或结构蛋白的表达，可以以感染所制作的重组牛痘病毒后的动物细胞为样品通过免疫印迹法来进行确认。需要说明的是，免疫印迹法中的抗体可以使用例如特异性识别期望的非结构蛋白区域或结构蛋白区域的市售抗体、从用SARS‑CoV‑2多肽进行免疫而制作的抗血清中利用蛋白G来纯化IgG而得者。

[0088] 本发明的重组牛痘病毒的温度稳定性高，例如即使在室温下(没有限定，包括10～40℃的范围，通常优选10～20℃。)也能保持作为SARS‑CoV‑2用疫苗的稳定性。因此，该牛痘病毒、后述的药物组合物等的保存及运输时的温度可以为冷藏的温度，也可以为室温，实用性、便利性优异。

[0089] 3.新型冠状病毒感染症(COVID‑19)的预防或治疗用的药物组合物

[0090] 本发明提供包含上述重组牛痘病毒的药物组合物，更具体而言，提供作为新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)感染症(COVID‑19)的预防药及治疗药的药物组合物。

[0091] 本发明的药物组合物可以通过所有公知的方法导入生物体，例如肌肉注射、腹腔内注射、皮内或皮下注射等注射；或从鼻腔、口腔或肺吸入；经口给予。进而，也可以将本发明的药物组合物所含的重组牛痘病毒与现有的抗病毒药(例如干扰素)组合使用。组合使用的方式没有特别限定，可以将本发明的重组牛痘病毒和现有的抗病毒药同时给药，也可以通过在给予一者之后，经过一定时间后给予另一者的方法而导入生物体。

[0092] 另外，本发明的药物组合物可以与赋形剂、增量剂、结合剂、润滑剂等公知的药学上可接受的载体、缓冲剂、等渗剂、螯合剂、着色剂、保存剂、香料、风味剂、甜味剂等混合。

[0093] 本发明的药物组合物可以根据片剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、丸剂、液体剂、糖浆剂等经口给药剂、注射剂、外用剂、栓剂、滴眼剂、滴鼻剂等非经口给药剂等形态进行经口给药或非经口给药。优选例示出对皮内、肌肉、腹腔等的局部注射等。

[0094] 给药量可以根据有效成分的种类、给药途径、给药对象、患者的年龄、体重、性别、症状等条件适当选择，以重组牛痘病毒的一天给药量计，经口的情况下为1000～1000000000PFU(plaque forming  units，嗜斑形成单位)左右、优选为100000～
100000000PFU左右，非经口的情况下为100～1000000000PFU(plaque forming units)左右、优选为1000～100000000PFU左右。病毒可以1天给药1次，也可以分为数次来给药。

[0095] 本发明的重组牛痘病毒可用于COVID‑19的预防用途、或作为治疗用疫苗来使用，优选预先测定作为疫苗的抗体效价或细胞免疫活性。

[0096] 例如，针对本发明的重组牛痘病毒或作为母株的DIs株的抗体效价可以如下得到：将这些病毒株接种于小鼠、兔子等，然后经时回收血清，测定血清对SARS‑CoV‑2蛋白的ELISA效价、LIPS(luciferase immunoprecipitation system，荧光素酶免疫沉淀系统)效价等，从而得到。由此可以确认接种个体中有无SARS‑CoV‑2的基因表达及免疫应答。接种了本发明的重组牛痘病毒的小鼠血清从接种1周后起可以观察到针对SARS‑CoV‑2蛋白的抗体效价的升高。

[0097] 另外，细胞免疫活性例如可以如下测定：将本发明的重组牛痘病毒或作为母株的DIs株接种于小鼠后，从经免疫的小鼠中分离脾细胞，通过FACS、ELISPOT试验来测定对SARS‑CoV‑2的非结构蛋白、结构蛋白特异性的CD4阳性及CD8阳性细胞是否被诱导、活化。例如，将来自用本发明的重组牛痘病毒免疫的BALB/c小鼠的脾细胞与表达非结构蛋白或结构蛋白的靶细胞共培养，由此可检测经抗原特异性活化的CD4及CD8阳性T细胞。

[0098] 本发明的重组牛痘病毒可诱导针对SARS‑CoV‑2的细胞免疫，特别是可表达SARS‑CoV‑2来源非结构蛋白(优选ORF1b)的重组牛痘病毒中该效果更显著。另外，本发明的重组牛痘病毒可诱导针对SARS‑CoV‑2的中和抗体，特别是可表达SARS‑CoV‑2来源结构蛋白(优选S蛋白)的重组牛痘病毒中该效果更显著。

[0099] 进而，本发明的重组牛痘病毒(SARS‑CoV‑2用疫苗)可成为不仅能应对该牛痘病毒原本直接针对的SARS‑CoV‑2、也能应对与SARS‑CoV‑2的变异相伴的抗原性变化的具有广泛交叉反应性的疫苗。即，对于本发明的作为SARS‑CoV‑2感染症的治疗药及预防药的药物组合物以及SARS‑CoV‑2用疫苗而言，作为SARS‑CoV‑2，也包括其碱基序列、氨基酸序列中具有置换、缺失、添加等任意的变异的所谓变异株。作为SARS‑CoV‑2变异株，可列举例如SUMS2(滋贺医科大学分离株)、QHN001(UK型变异株)、TY7‑501(巴西型变异株)、TY8‑612(南非型变异株)等。

[0100] 另外，本发明的重组牛痘病毒还可作为对于今后可能出现的未知的新型冠状病毒(CoV)也显示防御效果的泛CoV感染症预防疫苗来利用。

[0101] 以下列举实施例来更具体地说明本发明，但是本发明不受这些限定。

[0102] 实施例1

[0103] 1.方法

[0104] (1)SARS‑CoV‑2病毒结构蛋白基因及非结构蛋白基因重组牛痘疫苗的制作[0105] (i)基因重组中使用的SARS‑CoV‑2病毒株的选择

[0106] SARS‑CoV‑2病毒株：基于hCoV‑19/Japan/AI/I‑004/2020的基因序列信息(GenBank登录号：LC521925)(序列号9)合成了下述4种基因。

[0107] ·非结构蛋白1b(ORF1b)基因区nCoV‑Japan‑1b(8198bp)(序列号1)

[0108] ·非结构蛋白1b(ORF1b)基因区mnCoV‑Japan‑1b GND(8198bp)(序列号3)[0109] ·刺突蛋白基因区nCoV‑Japan‑S(3926bp)(序列号5)

[0110] ·刺突蛋白基因区mnCoV‑Japan‑S(3926bp)(序列号7)

[0111] 上述4种基因中，序列号1所示的基因为野生型的ORF1b基因，序列号5所示的基因为野生型的刺突蛋白基因。

[0112] 而序列号3及7所示的基因分别为基于序列号1及5所示的基因以在牛痘病毒中的基因表达效率提高的方式进行了优化的变异型基因。

[0113] 具体而言，序列号3所示的变异型基因是序列号1所示的碱基序列的第2445位、第2448位、第4998位、第5001位及第6000位的T(胸腺嘧啶)被置换为C(胞嘧啶)且第2539位的G(鸟嘌呤)被置换为A(丙氨酸)的基因(共6个位置发生了碱基置换)。

[0114] 另外，序列号7所示的变异型基因是序列号5所示的碱基序列的第99位、第102位、第2364位、第2367位、第3213位、第3216位、第3417位及第3420位的T(胸腺嘧啶)被置换为C(胞嘧啶)的基因(共8个位置发生了碱基置换)。

[0115] 本实施例中，将上述4种基因中的序列号3及7所示的基因用于重组牛痘病毒的建立。

[0116] (ii)将2种合成基因克隆到pSMART‑DIs‑L3载体内

[0117] 将2种合成基因(序列号3及7所示的基因)插入到DIs重组疫苗制作用的重组载体：pSMART‑DIs‑L3(序列号10)中(图6、7)。使用这些重组载体进行重组牛痘病毒(rDIs‑1b‑GND、rDIs‑S)的建立(图4)。“rDIs‑1b‑GND”为使用插入了序列号3所示的基因的载体(pSMART‑DIs‑L3‑mnCoV‑Japan‑1b GND‑GPTF)得到的重组牛痘病毒，有时也称为“rDIs‑mnCoV‑1b‑GND”。“rDIs‑S”为使用插入了序列号7所示的基因的载体(pSMART‑DIs‑L3‑mnCoV‑Japan‑S‑GPTF)得到的重组牛痘病毒，有时也称为“rDIs‑mnCoV‑S”。

[0118] (2)重组有SARS‑CoV‑2病毒非结构蛋白基因或结构蛋白基因的牛痘疫苗的评价[0119] (i)对ORF1b非结构蛋白基因重组DIs(rDIs‑1b‑GND)中所插入的基因序列进行确认后，通过实时检测PCR(Real‑Time Detection polymerase chain reaction，RTD‑PCR)法确认mRNA的表达(图8)，通过免疫印迹法确认ORF1b构成蛋白的表达(图11的B)。

[0120] 上述RTD‑PCR中使用的引物和探针、反应液组成、反应条件如下所述。

[0121] ＜引物和探针＞

[0122] 正向引物(HKU‑ORF1b‑nsp14F)：

[0123] 5’‑TGGGGYTTTACRGGTAACCT‑3’(序列号11)

[0124] 反向引物(HKU‑ORF1b‑nsp14R)：

[0125] 5’‑AACRCGCTTAACAAAGCACTC‑3’(序列号12)

[0126] 探针(HKU‑ORF1b‑nsp141P)：

[0127] 5’‑FAM‑TAGTTGTGATGCWATCATGACTAG‑TAMRA‑3’(序列号13)

[0128] <反应液组成>

[0129]

[0130] <反应条件>

[0131] [表1]

[0132]

[0133] (ii)对刺突蛋白基因区重组DIs(rDIs‑S)中插入的基因序列进行确认后，通过免疫印迹法确认了刺突蛋白的表达(图9、图11的A)。

[0134] 2.结果

[0135] (1)对ORF1b非结构蛋白基因重组DIs(rDIs‑1b‑GND)中插入的基因序列进行确认后，通过实时检测PCR(RTD‑PCR)法确认了mRNA的表达(图8)。在12个克隆的10个克隆中确认到良好的mRNA表达。另外，通过免疫印迹法确认了rDIs‑1b‑GND中的ORF1b构成蛋白的表达(图11的B)。

[0136] (2)对刺突蛋白基因区重组DIs(rDIs‑S)中插入的基因序列进行确认后，通过免疫印迹法确认了刺突蛋白的表达(图9、图11的A)。在9个克隆的9个克隆中确认到良好的刺突蛋白表达。

[0137] 3.考察

[0138] 针对SARS‑CoV‑2来源ORF1b非结构蛋白的疫苗(rDIs‑1b‑GND)能够成为能诱导细胞免疫的有效的预防疫苗。另外，针对SARS‑CoV‑2来源刺突蛋白的疫苗(rDIs‑S)能够成为能诱导中和抗体的有效的预防疫苗(图10)。

[0139] 实施例2

[0140] 将rDIs‑1b‑GND接种于表达人ACE2的转基因小鼠(hACE2表达Tg小鼠)，进行该小鼠中的SARS‑CoV‑2特异性T细胞应答分析。具体而言，如图12所示，将rDIs‑1b‑GND或DIs(对照)以3周间隔接种2次，于1周后进行SARS‑CoV‑2攻击感染，通过干扰素γELISpot试验来分析感染6天后的针对SARS‑CoV‑2的抗原特异性T细胞的活化。

[0141] 其结果是，在rDIs‑1b‑GND接种组中观察到SARS‑CoV‑2特异性的T细胞(ORF1b抗原(RdRp)特异性T细胞)的活化(产生干扰素γ)(图12)。

[0142] 实施例3

[0143] 使用食蟹猴评价rDIs‑S的有效性及安全性。具体而言，如图13所示，将rDIs‑S或DIs(对照)以3周间隔对食蟹猴进行2次皮内接种，于1周后进行SARS‑CoV‑2攻击感染，在感染7天后进行剖检。在以下(1)～(5)中说明各评价内容和其结果。

[0144] (1)测定了SARS‑CoV‑2感染后的体温变化。对照(DIs)组(虚线)中，在SARS‑CoV‑2感染起2天后观察到1度以上的体温上升，接种rDIs‑S的组(实线)中未观察到体温上升(图14)。

[0145] (2)测定了鼻腔·气道拭液中的感染性病毒量的经时变化。

[0146] 鼻腔拭液中的病毒量：DIs接种组中，直至感染7天后均检测到感染性病毒。接种rDIs‑S的组中，仅在感染1天后检测到，此后快速地清除了病毒。接种rDIs‑S的组中，4只中的1只在感染1天后也在检测限以下(图15的A)。

[0147] 气道拭液中的病毒量：DIs接种组中，4只中的1只直至感染7天后均检测到感染性病毒。接种rDIs‑S的组中，4只中的2只在感染1天后也为检测限以下，检测到的2只也为显著低的值(图15的B)。

[0148] (3)测定了SARS‑CoV‑2感染7天后的肺中病毒RNA量。DIs接种组中，4只的几乎所有肺叶中检测到高的病毒RNA量，接种rDIs‑S的组中，肺叶中的病毒RNA量几乎为检测限以下，显示了良好的清除效果(图16)。

[0149] (4)对SARS‑CoV‑2感染7天后的肺病理所见和病理评分进行了确认。DIs接种组中，观察到了伴有间质部肥大化的肺炎影响。另一方面，接种rDIs‑S的组中，几乎观察不到病变部分，表明能够减轻肺炎(图17)。

[0150] (5)对接种rDIs‑S的组中的中和抗体诱导效果(NT50滴度)进行了确认。接种rDIs‑S的组中，4只均检测到了中和抗体(0dpi)，观察到了由SARS‑CoV‑2攻击感染(7dpi)引起的抗体效价的迅速增大(图18)。

[0151] 实施例4

[0152] 使用表达人ACE2的转基因小鼠(hACE2表达Tg小鼠)及C57BL/6评价了rDIs‑S的有效性。在以下(1)及(2)中说明各评价内容和其结果。

[0153] (1)接种rDIs‑S的hACE2表达Tg小鼠中的SARS‑CoV‑2感染防御试验

[0154] 如图19所示，将rDIs‑S或DIs(对照)以3周间隔对hACE2表达Tg小鼠进行2次接种，于1周后进行SARS‑CoV‑2攻击感染实验。DIs接种个体伴有急剧的体重变化并死亡，接种rDIs‑S的个体几乎观察不到体重减少，显示100％的存活率(图19)。

[0155] (2)接种rDIs‑S的C57BL/6小鼠中的抗原特异性细胞杀伤性T细胞的体内活性评价[0156] 如图20所示，将rDIs‑S或DIs(对照)以3周间隔对C57BL/6小鼠进行2次接种，1周后将用SARS‑CoV‑2的S蛋白刺激后的脾细胞与未刺激脾细胞的1：1混合液经静脉导入该小鼠。次日采集脾，使用流式细胞术法分析细胞导入个体内的抗原刺激细胞的清除效果。DIs接种个体中不能清除S蛋白肽刺激细胞，而接种rDIs‑S的个体能够迅速清除源自S蛋白的肽刺激细胞(图20)。由此可确认，rDIs‑S诱导了SARS‑CoV‑2的S蛋白特异性细胞杀伤性T细胞。

[0157] 实施例5

[0158] 使用C57BL/6J小鼠评价了rDIs‑S的抗体诱导能力。在以下的(1)及(2)中说明各评价内容和其结果。

[0159] (1)如图21所示，将rDIs‑S或DIs(对照)以3周间隔对C57BL/6J小鼠进行2次接种，从接种前至4周后毎周进行采血。将血清被检体用稀释溶液(含有1％BSA、0.5％吐温20、2.5mM EDTA的PBS(‑)稀释100倍后，利用ELISA测定对SARS‑CoV‑2的S蛋白特异性的结合抗体(免疫球蛋白G；IgG)的产生。接种rDIs‑S的个体(n＝3)中，从接种rDIs‑S 1周起检测到S蛋白特异性抗体。进而，通过在首次接种起3周后追加接种rDIs‑S，1周后血清中所含的S蛋白特异性IgG量增加。

[0160] (2)使用上述(1)中所使用的同一血清被检体，通过噬斑减少中和试验法评价对SARS‑CoV‑2(TY/WK‑521：流行初期株)的中和抗体效价。具体而言，将血清用培养基稀释10倍后，进一步进行4倍阶梯稀释。分别将10倍、40倍、160倍、640倍、2560倍、10240倍稀释血清50μL和50PFU/50μL的病毒溶液混合，在37度下反应一小时。然后将阶梯稀释血清/病毒混合溶液(100μL)接种于对SARS‑CoV‑2感染具有敏感性的VeroE6/TMPRSS2细胞，吸附1小时。除去溶液，用培养基洗涤细胞后添加含有0.6％琼脂糖的培养基，培养48小时。48小时后，将由不含血清的被检体形成的噬斑数设为100％，计算通过添加血清而使噬斑数变为一半的血清稀释率的倒数，作为“50％中和滴度”。如图22所示，可知接种rDIs‑S的个体(n＝3)从接种rDIs‑S 1周后开始诱导中和抗体。另外，通过在首次接种起3周后进行追加接种，可增大中和抗体效价。

[0161] 实施例6

[0162] 使用实施例3中接种了(以3周间隔进行2次皮内接种)rDIs‑S的食蟹猴的血浆被检体，通过TCID50法测定对SARS‑CoV‑2的流行初期株(TY/WK‑521)及变异株(SUMS2：滋贺医科大学分离株、QHN001：UK型变异株、TY7‑501：巴西型变异株)的中和抗体效价。本实施例中使用首次接种rDIs‑S起3周后追加免疫时(图23的图片中第‑7天)、SARS‑CoV‑2攻击感染时(图23的图片中第0天)、及剖检时(图23的图片中第7天)所采集的血浆。如图23所示，可知通过2次接种疫苗，对于流行初期株及所有变异株均诱导了中和抗体。

[0163] 实施例7

[0164] 将rDIs‑S或DIs(对照)以3周间隔对hACE2表达Tg小鼠进行2次接种，在追加免疫起1周后，经气道感染100PFU的SARS‑CoV‑2南非型变异株(TY8‑612)。每天观测存活率，在感染起7天后进行剖检。如图24所示，DIs接种(对照)组中，4只中的2只死亡，而接种rDIs‑S的组的5只个体全部存活。对于该变异株(TY8‑612)，也确认了接种rDIs‑S所带来的发病防御效果。

[0165] 关联信息·论文

[0166] (1)Masahiro Kitabatake，Shingo Inoue，Fumihiko Yasui，Shoji Yokochi，Masaaki Arai，Kouichi Morita，Hisatoshi Shida，Minoru Kidokoro，Fukashi Murai，Mai Quynh Le，Kouji Matsushima and Michinori Kohara.SARS‑CoV spike protein recombinant vaccinia virus efficiently induces neutralizing antibodies in spite of pre‑immunization with vaccinia virus.Vaccine 25：630‑637(2007).[0167] (2)Fumihiko Yasui，Chieko Kai，Masahiro Kitabatake，Shingo Inoue，Misako Yoneda，Shoji Yokochi，Ryoichi Kase，Satoshi Sekiguchi，Kouichi Morita，Tsunekazu Hishima，Hidenori Suzuki，Katsuo Karamatsu，Yasuhiro Yasutomi，Hisatoshi Shida，Minoru Kidokoro，Kyosuke Mizuno，Kouji Matsushima，Michinori Kohara.Prior immunization with SARS‑CoV nucleocapsid protein causes severe pneumonia in mice infected with SARS‑CoV.J.Immunology 181(9)：6337‑48(2008).

[0168] (3)Jin‑Won Youn，Yu‑Wen Hu，Nancy Tricoche，Wolfram Pfahler，Mohamed Tarek Shata，Marlene Dreux，Francois‑Loic Cosset，Antonella Folgori，Dong‑Hun Lee，Betsy Brotman，and Alfred M.Prince.Evidence for Protectionagainst Chronic Hepatitis C Virus Infection in Chimpanzees by Immunizationwith Replicating Recombinant Vaccinia Virus.JOURNAL OF VIROLOGY，Nov.2008，82(21)：10896‑10905.doi：10.1128/JVI.01179‑08

[0169] (4)FRANCOIS HABERSETZER，GERALDINE HONNET，CHRISTINEBAIN，MARIANNE MAYNARD‑MUET，VINCENT LEROY，JEAN‑PIERREZARSKI，CYRILLE FERAY，THOMAS F.BAUMERT，JEAN‑PIERREBRONOWICKI，MICHEL DOFFOEL，CHRISTIAN TREPO，DELPHINEAGATHON，MYEW‑LING TOH，MARTINE BAUDIN，JEAN‑YVESBONNEFOY，JEAN‑MARC LIMACHER，and GENEVIEVE INCHAUSPE.APoxvirus Vaccine Is Safe，Induces T‑Cell Responses，and Decreases Viral Loadin Patients With Chronic Hepatitis C.GASTROENTEROLOGY 2011；141：890‑899.doi：10.1053/j.gastro.2011.06.009

[0170] (5).Satoshi Sekiguchi，Kiminori Kimura，Tomoko Chiyo，TakahiroOhtsuki，Yoshimi Tobita，Yuko Tokunaga，Fumihiko Yasui，KyokoTsukiyama‑Kohara，Takaji Wakita，Toshiyuki Tanaka，Masayuki Miyasaka，Kyosuke Mizuno，Yukiko Hayashi，Tsunekazu Hishima，Kouji Matsushima andMichinori Kohara.Immunization with a recombinant vaccinia virus that encodesnonstructural proteins of the hepatitis C virus suppresses viral protein levels inmouse liver.PLoS ONE 7(12)：e51656(2012).

[0171] (6)Takeshi Wada，Michinori Kohara and Yasuhiro Yasutomi.DNAvaccine expressing the non‑structural proteins of hepatitis C virus diminishes theexpression of HCV proteins in a mouse model.Vaccine 31(50)：5968‑74，doi：10.1016/j.vaccine.2013.10.037(2013).

[0172] (7)Takahiro Ohtsuki，Kiminori Kimura，Yuko Tokunaga，Kyoko Tsukiyama‑Kohara，Chise Tateno，Yukiko Hayashi，Tsunekazu Hishima，and Michinori Kohara.M2 macrophages play critical roles in progression of inflammatory liver disease in hepatitis C virus transgenic mice.J.Virology 2015Oct 14；90(1)：300‑7.doi：10.1128/JVI.02293‑15.

[0173] 产业上的可利用性

[0174] 本发明的作为COVID‑19预防疫苗(SARS‑CoV‑2用疫苗)的重组牛痘病毒、及使用其的药物组合物等强力诱导免疫且能够长期维持免疫，作为SARS‑CoV‑2用疫苗在COVID‑19感染症的预防或治疗中极为有用。另外，本发明的重组牛痘病毒在室温下也能够保持作为SARS‑CoV‑2用疫苗的稳定性，其保存及运输时的温度可以为冷藏也可以为室温，实用性优异。

[0175] 序列表自由文本

[0176] 序列号3：合成DNA

[0177] 序列号4：合成构建物

[0178] 序列号7：合成DNA

[0179] 序列号8：合成构建物

[0180] 序列号10：合成DNA

[0181] 序列号11：合成DNA

[0182] 序列号12：合成DNA

[0183] 序列号13：合成DNA。