技术领域
[0001] 本发明涉及微生物领域，特别是涉及一株对绿脓杆菌具有高裂解率的噬菌体BD815的分离及应用。
相关背景技术
[0002] 绿脓杆菌，又称铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，是一种革兰氏阴性菌，也是引起医院获得性感染的主要病原体之一(Jangra V，et al.Microbes Infect，2022，24(4)：104950.)。绿脓杆菌可感染免疫力低下个体的多个部位，包括烧伤或创伤部位、尿路、角膜、胃肠道等，引起尿路感染、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、囊性纤维化、癌症、脓毒症和呼吸机相关肺炎(VAP，包括covid‑19)等疾病(Jurado‑Martin I，et al.Int J Mol Sci，2021，22(6)；Cendra M，et al.Biotechnol Adv，2021，49：107734；Rossi E，et al.Nat Rev Microbiol，2021，19(5)：331‑342.)。绿脓杆菌是一种多药耐药(MDR)条件致病菌，可对氨基糖苷类、喹诺酮类和β‑内酰胺类等抗生素产生耐药性(Hancock RE，et al.Drug Resist Updat，2000，3(4)：247‑255.)，临床上高度抵抗包括青霉素、头孢菌素、阿曲南通、头孢唑林‑他唑巴坦等抗生素的治疗(Paterson DL，et al.Clin Microbiol Rev，2005，18(4)：
657‑686.；Rawat D，et al.J Glob Infect Dis，2010，2(3)：263‑274；Poirel L，et al.Antimicrob Agents Chemother，2019，63(1).)。抑制和破坏耐药菌的研究具有重要意义。
[0003] 噬菌体疗法是通过噬菌体裂解细菌治疗病原菌感染的治疗手段。相对于抗生素，噬菌体不会发展出继发性耐药，常与细菌宿主共同进化，继而延缓抗药性细菌的发展(Koskella B，et al.Annu Rev Virol，2022，9(1)：57‑78.)。革兰氏阴性细菌耐药性主要是由于细胞膜的低抗生素通透性(Poole K，et al.Curr Pharm Biotechnol，2002，3(2)：77‑98.)，噬菌体与抗生素联合用药可以提高对生物膜的渗透、增强抑制细菌的能力等(Gu LC，et al.MBio，2020，11(4)；Tagliaferri TL，et al.Front Cell Infect Microbiol，2019，
9：22.)。研究表明噬菌体疗法是破坏绿脓杆菌生物膜的有效方法之一(Chegini Z，et al.Ann Clin Microbiol Antimicrob，2020，19(1)：45.)，可用于对抗对绿脓杆菌的高耐药性。同时目前发现噬菌体的种类及数量仍较少，是限制相关研究及广泛应用的重要因素，故需进一步丰富噬菌体库应对高耐药性问题。
具体实施方式
[0020] 下面结合实施例对本发明的技术方案进行描述。所选用的实施例仅是本发明的一部分，而非全部，对本发明不构成限制。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0021] 实施例1噬菌体分离纯化
[0022] 将0.1g绿脓杆菌CGMCC 1.10274冻干粉于1mL LB培养基缓冲液溶解，采用平板划线法培养，挑取单独菌落于LB培养基中培养三代，得到活性及稳定性良好的菌悬浮液。
[0023] 从北京市房山区的自然环境中收集了约5mL污水样本。加入100mL处于对数生长期的绿脓杆菌LB培养基悬浮液，于37℃、150r/min条件下孵育24h。使用0.22μm的微孔膜过滤悬浮液，得到无菌的噬菌体原液，于4℃保存。采用spot‑test方法鉴定获得的噬菌体悬浮液。在培养皿中放置一层固体培养基，并在上层放置含有细菌溶液和噬菌体稀释液的半固体培养基，于37℃培养6‑8h，观察是否出现噬菌斑。若平板上出现清晰透亮的噬菌斑，则表明从上述操作中分离出绿脓杆菌噬菌体，否则需重新采集分离。结果见图1。
[0024] 选择形状规则的噬菌斑点，并添加到绿脓杆菌的悬浮液中，在37℃、150r/min条件下孵育12h，通过0.22μm微孔膜过滤得到噬菌体悬浮液。重复上述操作3次，获得纯化的噬菌体悬浮液。该噬菌体BD815已存入中国通用微生物培养收集中心(CGMCC)，编号为CGMCC No.45873。
[0025] 实施例2噬菌体形态观察
[0026] BD815于30000r/min条件下离心2h，沉淀物在超纯水中重悬。将10μL噬菌体悬液置于碳支持膜(Formvar/Carbon Film)上，静置10min。用滤纸吸收多余的液体，滴一滴醋酸铀(pH4.5，1％w/v)到网格表面，晾置90s后，用滤纸吸干并晾置3h。最后，利用JEM‑1400Plus透射电镜观察BD815在120kV加速电压下的形态，并采用iTEM和KeenView软成像系统进行成像，结果见图2。噬菌体外表形态具有正多面体头部和长无收缩性的尾鞘，头部长66.9±1.5nm，头部宽45.8±1.5nm，长尾长159.8±1.9nm。根据国际病毒分类学组织(ICTV)病毒分类报告，可初步将该株噬菌体归类为长尾噬菌体科。
[0027] 实施例3噬菌体鉴定
[0028] 使用Solarbio DNA病毒基因组提取试剂盒提取噬菌体BD815的基因组，进行全基因组测序。使用Megahit软件(v1.1.2)处理数据，并使用BWA(v0.7.17)软件计算读取数据的利用率。使用blastp(v2.9.0+)软件将基因组中每个ORF对应的蛋白序列与COG数据库对应的蛋白序列进行比较，结果见图3。筛选e＜1e5的比较结果，获得噬菌体基因的功能信息。在NCBI数据库中对全基因组序列进行比较，利用MEGA 10.2.6构建系统发育树，结果见图4。
[0029] 实施例4最佳感染复数测定
[0030] 将绿脓杆菌培养至对数生长期，调节菌液浓度至3.4×108CFU/mL并进行梯度稀4
释。调节噬菌体溶液浓度为3.4×10 PFU/mL。将噬菌体BD815悬液与上述梯度稀释的细菌悬液按感染复数(MOI)(BD815浓度/细菌浓度)为0.0001、0.001、0.01、0.1、1、10的比例混合，于37℃、150r/min下孵育12h，采用双层平板法测定不同感染复数的噬菌体效价，结果见图
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5。最佳感染复数为0.001，效价可达3.46×10 PFU/mL。
[0031] 实施例5一步生长曲线绘制
[0032] 选择最佳感染复数0.001，将对数生长期的绿脓杆菌(终浓度1.2×108CFU/mL)与噬菌体BD815悬液混合，悬浮液在37℃、150r/min下孵育10min。将悬浮液在12000r/min条件下离心5min，弃上清。沉淀重悬于LB培养基中并分别于0、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100和110min各收集500μL，使用0.22μm微孔膜过滤后，采用双层板法测定滤液中的噬菌体效价，绘制噬菌体的一步生长曲线，结果见图6。噬菌体的潜伏期为0‑5min，爆发期为5‑
90min。
[0033] 实施例6噬菌体稳定性实验
[0034] 制备12个噬菌体BD815悬液，并将其pH值分别调整为1‑12，于37℃孵育2h，采用双层板法测定噬菌体效价。制备6个噬菌体BD815悬液，分别在30、40、50、60、70和80℃的水浴中孵育1h。孵育后，采用双层板法测定噬菌体效价。结果见图7、图8，噬菌体最适温度范围在30‑60℃之间，60℃以后随着温度的升高和时间的延长，噬菌体的活性明显降低。噬菌体最适pH为7‑10，随着pH值的升高或降低，噬菌体的效价均有所降低。
[0035] 实施例7噬菌体体外杀菌活性试验
[0036] 将绿脓杆菌培养至对数生长期，细菌溶液浓度为1.2×108CFU/mL。将噬菌体BD815悬液与上述细菌培养基按不同MOI值混合，于不同时间点检测OD600以反应噬菌体的体外裂解能力，结果如图9。以不同MOI值的噬菌体接种后，MOI为10和1的菌液的OD600值于120min显著下降，MOI为0.1、0.01和0.001的菌液OD600值出现先上升后下降的趋势，MOI为0.0001的菌液和未添加噬菌体的菌液的OD600值表现出持续上升趋势，但MOI为0.0001的菌液上升明显较对照组缓慢。实验结果表明，噬菌体可有效抑制宿主菌的生长。
[0037] 实施例8常规试验稀释度试验RTD(Routine test dilution)
[0038] 于平板上滴加处于生长对数期的宿主菌(约100μL)并晾干，后在斑点上分别滴加9 8 7 6 5 4
不同稀释度的噬菌体液(10 PFU/mL、10PFU/mL、10PFU/mL、10 PFU/mL、10PFU/mL、10PFU/
3 2
mL、10PFU/mL、10PFU/mL、10PFU/mL)并晾干，于37℃培养16‑24h。滴加区域内宿主菌无法连片生长则为CL浓度，即可以完全性裂解环境中宿主菌的浓度。结果如图10，BD815的RTD值为
7 ‑8
效价10PFU/mL(10 稀释度)。
[0039] 上述说明使本领域专业技术人员能够使用或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
