具体技术细节
[0004] 本发明旨在至少部分地克服现有技术中存在的上述和/或其他潜在的问题：提供一种灵敏度高、特异性好，常温条件下就能够用于样品中痕量核酸的快速可视化检测的基于PER‑Cas12a的核酸检测试剂盒。
[0005] 本发明的工作原理如图1所示，首先利用待测靶标分子激活Toehold介导的链置换反应，并释放出一条可以触发引物交换反应(PER)的引物单链DNA(P)，然后利用PER技术对待测靶标分子进行第一次信号放大，其放大结果是产生可延伸的串联体单链DNA，而每个串联体能够被crRNA序列识别，并激活Cas12a效应蛋白的附属切割活性。当反应体系中含有FAM/BHQ1或FAM/Biotin标记的ssDNA报告分子时，激活的Cas12a效应蛋白切割ssDNA报告分子，再一次进行信号放大，利用荧光检测仪或试纸条层析显色方法可实现样品中的核酸(DNA或RNA)的可视化检测。
[0006] 本发明提供一种基于PER‑Cas12a的核酸检测试剂盒，包括以下组分：可识别靶标序列的DNA纳米器件；催化发夹；CRISPR/Cas12a检测反应体系。
[0007] 所述可识别靶标序列的DNA纳米器件如图2所示，由核酸靶标序列特异性引物寡核苷酸序列(P)与其互补寡核苷酸序列(T*+P*)通过退火处理制备而成，其中T*作用在于提供一段用于启动链置换反应的支点链(Toehold)，碱基数量优选为8bp；P*作用在于提供引物结合的一段互补寡核苷酸序列，碱基数量优选为9bp。
[0008] 所述的DNA纳米器件上含有一段被封闭的特异性引物寡核苷酸序列(P)，该序列与P*互补，优选碱基数为9bp。待测靶标序列与引物互补寡核苷酸序列(T*+P*)结合，通过DNA链置换反应将引物(P)从DNA纳米器件中释放出来。
[0009] 所述催化发夹具有如图3所示的结构，包括茎、环和一个引物结合位点的垂悬部分(P*)，其中茎部分的5’端含有一段靶标序列(A)及其寡核苷酸特异性互补的序列(A*)，碱基数量可为20bp至25bp其中之一。PER反应后所合成可延伸串联体单链DNA含有多个P+A重复结构，该结构序列可被crRNA识别并激活Cas12a效应蛋白的核酸酶活性。
[0010] 所述催化发夹3’端碱基采用Inverted dT或“‑TTTTTTT‑”修饰，所述催化发夹茎‑环交接区的2个碱基进行甲基化修饰。
[0011] 本发明所述的CRISPR/Cas12a检测反应体系包括Cas12a、crRNA、DNA报告分子、Mg2+、Bst置换聚合酶、dNTPs。
[0012] 本发明基于Toehold介导的链置换反应，利用DNA高特异性和可预测的Watson‑Crick碱基配的特性，在恒温条件下能够使双链和单链之间进行动态重组，形成更稳定的新双链并且释放出一条单链DNA。基于Toehold介导的链置换反应形成的单链DNA作为引物，在链置换聚合酶的作用下触发引物交换反应，由PER扩增后合成一条可延伸的串联体单链DNA，如图4所示。
[0013] 所述可延伸的串联体单链DNA的特征在于，同一条单链DNA上具有多区域重复序列，大小均为20bp，在向导RNA(crRNA)作用下可激活Cas12a效应蛋白的核酸酶活性。
[0014] 本发明另一目的提供一种基于CRISPR/Cas12a系统的高灵敏度与放大检测信号的方法，当反应体系中含有FAM/BHQ1标记的ssDNA报告分子时，激活的Cas12a效应蛋白切割单链DNA报告分子，利用荧光检测仪可实现样品中的核酸可视化检测。
[0015] 本发明的有益效果是：引物交换反应(Primer Exchange Reaction，PER)是一种恒温核酸扩增方法，通过一个短的引物序列(与催化发夹的短悬垂结构序列互补)，在DNA置换酶的作用下，引物被拓展了一段催化发夹序列，随后被置换出去，而重获自由的催化发夹再进入下一轮级联进程，或是捕获新引物，或是捕获已被延长过的引物。通过一系列的延伸和置换反应，PER可恒温、可编程的形式原位自主合成具有重复序列的长单链DNA，仅需要催化发夹和引物即可执行特异性且快速的信号扩增。本发明基于PER的恒温核酸扩增技术的扩增效应及其合成单链DNA的特性，并结合CRISPR/Cas12a系统构建一种新型、高扩增效率且检测信号联级放大的PER‑Cas12a试剂盒，其灵敏度高、特异性好，常温条件下就能够用于样品中痕量核酸的快速可视化检测。
[0016] 本发明的技术方案设计简单、方便快捷，仅提供待测靶标分子DNA序列，根据序列设计一条具有引物特征的寡核苷酸单链，碱基数量可为7bp至12bp其中之一，便可触发整个检测系统。
[0017] 本发明通过CRISPR/Cas12a系统在保守区域中筛选crRNA时，只要确定并优选一条通用的crRNA，即可激发Cas12a识别PER反应产生的串联体序列，不需要借助计算机软件分析以寻找保守序列中出现频率相对较低的Cas12a蛋白识别结构5’‑TTTV‑3’PAM(V表示A/G/C)。
法律保护范围
涉及权利要求数量7：其中独权1项，从权-1项
1.一种基于PER‑Cas12a的核酸检测试剂盒，其特征在于，包括以下组分：
可识别靶标序列的DNA纳米器件；催化发夹；CRISPR/Cas12a检测反应体系。
2.根据权利要求1所述的基于PER‑Cas12a的核酸检测试剂盒，其特征在于，所述的CRISPR/Cas12a检测反应体系包括Cas12a、crRNA、DNA报告分子、Mg2+、Bst置换聚合酶、dNTPs。
3.根据权利要求2所述的基于PER‑Cas12a的核酸检测试剂盒，其特征在于，所述DNA报告分子为FAM/BHQ1或者FAM/Biotin标记的ssDNA报告分子。
4.根据权利要求3所述的基于PER‑Cas12a的核酸检测试剂盒，其特征在于，由核酸靶标序列特异性引物寡核苷酸序列（P）与其互补寡核苷酸序列（T*+P*）通过退火处理制备而成，其中T*作用在于提供一段用于启动链置换反应的支点链（Toehold），碱基数量优选为8bp；
P*作用在于提供引物结合的一段互补寡核苷酸序列，碱基数量优选为9bp。
5.根据权利要求4所述的基于PER‑Cas12a的核酸检测试剂盒，其特征在于，所述的DNA纳米器件上含有一段被封闭的特异性引物寡核苷酸序列（P），该序列与P*互补，优选碱基数为9bp；待测靶标序列与引物互补寡核苷酸序列（T*+P*）结合，通过DNA链置换反应将引物（P）从DNA纳米器件中释放出来。
6.根据权利要求5所述的基于PER‑Cas12a的核酸检测试剂盒，其特征在于，所述催化发夹包括茎、环和一个引物结合位点的垂悬部分（P*），其中茎部分的5’端含有一段靶标序列（A）及其寡核苷酸特异性互补的序列（A*)，碱基数量可为20bp至25bp其中之一；PER反应后所合成可延伸串联体单链DNA含有多个P+A重复结构，该结构序列可被crRNA识别并激活Cas12a效应蛋白的核酸酶活性。
7.根据权利要求1‑6任一项所述的基于PER‑Cas12a的核酸检测试剂盒，其特征在于，所述催化发夹3’端碱基采用Inverted dT或“‑TTTTTTT‑”修饰；所述催化发夹茎‑环交接区的2个碱基进行甲基化修饰。
