技术领域
[0001] 本发明涉及核酸检测技术领域，具体讲是一种基于PER‑Cas12a的核酸检测试剂盒。
相关背景技术
[0002] 核酸是由核苷酸聚合成的生物大分子，是遗传信息的载体，其结构变化对生物体产生重大影响，与多种疾病的起因相关。随着基因组学和分子病理学的发展，越来越多与疾病发生发展相关的核酸被发现，并证实核酸可作为一类有效的生物标志物应用于疾病的分子诊断。传统的核酸检测方法主要有Southern杂交、Northern杂交、基因芯片技术、实时荧光定量PCR(QT‑qPCR)和高通量测序等。然而Northern杂交技术耗时长、操作繁琐、样品需要量大且灵敏度低；基因芯片和高通量技术虽然有高通量的优势，但是样本需要预处理、灵敏度低且成本高；qPCR技术具有较高的灵敏度和实用性，但对引物的设计要求高且需要特殊的检测仪器。因此，开发一种用于核酸检测的灵敏度高、简单快速、检测限低的试剂盒，成为临床医学分子诊断的迫切需要。
[0003] Cas12a是一种可在crRNA引导下与靶标DNA序列结合并切割基因组DNA的效应蛋白，当特异性结合和切割目标dsDNA后，能够产生具有非特异性切割单链DNA的活性。结合等温扩增技术，利用Cas12a的非特异性切割活性可实现了单分子级别的核酸检测。该系统CRISPR/Cas12a，在单核苷酸多态性分析、癌症筛查、细菌和病毒感染检测以及耐药性筛查等方面有广泛的应用潜力。CRISPR/Cas12a系统包括一个靶标序列识别的向导RNA(crRNA)和一个Cas12a效应蛋白，在靶标序列识别时，Cas12a与crRNA以及靶标DNA形成三元复合体，Cas12a效应蛋白的核酸酶活性被激活，然后不加区分的切割旁边的单链DNA(ssDNA)。通过引入标记有荧光团和猝灭剂或荧光团和生物素的单链DNA报告分子，可以用荧光检测器或侧向流试纸条检测切割结果。由于Cas12a的靶标及底物均为DNA，稳定性较强，该系统对实验操作环境要求低，可应用于现场疾病与病源微生物的核酸快速检测。同时由于Cas12a被靶标特异性激活后，能够非特异性地切割单链报告分子，该步骤具有信号放大作用，因而该技术相较于传统核酸检测技术具有更高的灵敏度。虽然CRISPR/Cas12a系统可以实现对核酸分子的快速灵敏检测，但Cas12a核酸酶的激活需要crRNA对靶标序列的特异性识别，因而选择合适的crRNA是实现该系统高灵敏检测的关键。然而crRNA的设计需要借助计算机软件分析并依据Cas12a蛋白识别基因组中出现频率相对较低的5’‑TTTV‑3’PAM(V表示A/G/C)，特别是当必须在保守序列区域设计crRNA时，难以找到合适的靶标序列，从而限制了该系统的广泛应用。
具体实施方式
[0024] 下面用具体实施例对本发明做进一步详细说明，但本发明不仅局限于以下具体实施例。
[0025] 实施例1
[0026] 本实施例以A组轮状病毒VP6基因为例，提供所述待测靶标核酸的特异引物寡核苷酸序列，其序列为SEQ ID NO1：5’‑TGCATGATAATTTAATGGG‑3’。
[0027] A组轮状病毒特异引物的适体，其部分序列与引物互补，且3’端含有一段未杂交结构域(Toehold，一般含有5‑10个碱基)作为链置换反应的支点链，优选8个碱基，其核苷酸序列为SEQ ID NO2：
[0028] 5’‑CCCATTAAATTATCATGCATTGGTTGA‑3’(划线部分为Toehold)。当所述实例中的A组轮状病毒特异性靶序列存在时，靶序列为SEQ ID NO3：5’‑TTAAATAGATCTCAACCAATGCATGATAATTTAATGGGAACCATGTGGCT‑3’，Toehold激发一个快速的链置换反应，最终靶标和Toehold链形成完全互补的双链，并且释放出引物序列SEQ ID NO1。
[0029] 所述催化发夹RV‑HP的核苷酸序列如SEQ ID NO4：5’‑GGAGTATTGCGGAGGATTTAATGGGGmGmGCCTTTTGGCCmCmCCCATT AAATCCTCCGCAATACTCCCCCATTAAA/InvdT/‑3’，其中Gm与Cm均为甲基化修饰碱基；InvdT为反向dT。
[0030] 所述引物SEQ ID NO1与催化发夹SEQ ID NO4结合触发PER反应，PER扩增后合成的产物序列特征如：5’‑TGCATGATAA‑
[0031] (TTTAATGGGGGAGTATTGCGGAGGA)n‑TTTAATGGG‑3’，n为正整数，在crRNA引导作用下，能够特异性地激活Cas12a效应蛋白的核酸酶活性，从而导致FAM/BHQ1标记的ssDNA报告分子被切割，利用荧光检测仪可实现样品中的核酸的可视化检测。
[0032] 所述crRNA序列由构建crRNA体外转录载体并用T7转录试剂盒进行体外转录和纯化获得，为SEQ ID NO 5：5’‑UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUCCUCCGCAAUACUCCCCCA‑3’。
[0033] 所述DNA报告分子设计、化学合成并HPLC纯化，实施例中选用的FAM/BHQ1标记的ssDNA报告分子，其序列特征如SEQ ID NO 6：5’‑FAM‑TTATTATT‑BHQ1‑3’，用于荧光信号检测和蓝光激发可视化检测；
[0034] 或者其序列特征如SEQ ID NO 7：5’‑FAM‑TTATTATT‑Bio‑3’，用于试纸条层析显色可视化检测。
[0035] CRISPR/Cas12a信号检测体系在靶标DNA存在时，Cas12a与crRNA以及靶标DNA形成三元复合体，同时该复合体产生trans切割的活性并切割FAM/BHQ1标记的ssDNA报告分子。
[0036] 实施例2
[0037] 本实施例以A组轮状病毒为例制备检测试剂盒：
[0038] 1、利用NCBI BLAST对NCBI数据库中记录的A组轮状病毒VP6基因的序列进行比对分析，筛选不同亚型内同源保守序列作为病毒特异性靶标，并用于检测组分设计与制备。
[0039] (1)依据A组轮状病毒VP6基因序列设计本实施例中可选用的轮状病毒特异引物寡核苷酸序列，其序列特征如SEQ ID NO1。
[0040] (2)依据A组轮状病毒VP6基因序列设计本实施例中可选用的轮状病毒特异引物互补寡核苷酸序列，其特征如SEQ ID NO2；所述轮状病毒特异引物互补寡核苷酸序列3’端含有一段未杂交结构域作为链置换反应的支点链(Toehold)。
[0041] (3)依据A组轮状病毒VP6基因序列设计本实施例中可选用的催化发夹序列，其序列特征如SEQ ID NO 4；
[0042] 进一步，所述引物与催化型发夹结合触发原位级联引物交换反应，在crRNA引导作用下可激活Cas12a效应蛋白的内切核酸酶活性，从而导致FAM/BHQ1标记的ssDNA报告分子被切割，利用荧光检测仪可实现样品中的核酸的可视化检测。
[0043] (4)依据A组轮状病毒VP6基因序列设计本实施例中CRISPR/Cas12a信号检测体系。
[0044] 本发明所述Cas12a效应蛋白源自Lachnospiraceae bacterium ND2006的依赖于RNA介导的Cas12a内切核酸酶(LbCas12a)，该蛋白与crRNA结合形成复合物，与互补单链DNA或者双链DNA的结合释放出强大的非特异性ssDNA反式切割活性；
[0045] 所述crRNA序列由构建crRNA体外转录载体并用T7转录试剂盒进行体外转录和纯化获得，其序列特征如SEQ ID NO 5；
[0046] 所述DNA报告分子设计、化学合成并HPLC纯化，实施例中选用的FAM/BHQ1标记的ssDNA报告分子，其序列特征如SEQ ID NO 6：5’‑FAM‑TTATTATT‑BHQ1‑3’，用于荧光信号检测和蓝光激发可视化检测。
[0047] 本发明所述的CRISPR/Cas12a信号检测体系在靶标DNA存在时，Cas12a与crRNA以及靶标DNA形成三元复合体，同时该复合体产生trans切割的活性并切割FAM/BHQ1标记的ssDNA报告分子。
[0048] 2、制备A组轮状病毒VP6基因序列的识别DNA纳米器件
[0049] 设计并化学合成所述VP6基因特异性引物的核苷酸序列以及含有Toehold支点链的核苷酸序列，所述引物序列与含有支点链序列的3’端互补，结构特征如图2所示。所述的核苷酸序列溶解于杂交缓冲液(10mM Tris‑Hcl,50mM NaCl,10mM MgCl2,pH＝7.4)制备成10μM的溶液后，再将10μM引物核苷酸与10μM含有Toehold支点链的核苷酸等体积混合，并置于95℃水浴箱中变性5分钟，然后以每秒下降0.1℃的速度将温度逐步降至25℃，使其充分杂交形成DNA纳米器件。
[0050] 3、DNA催化发夹制备
[0051] 设计并化学合成所述的催化发夹核苷酸序列，该催化型发夹结构特征如图3所示。所述的催化发夹核苷酸溶解于退火缓冲液(10mM Tris‑Hcl,50mM NaCl,1mM EDTA,pH＝
7.5)制备成10μM的溶液，并置于95℃水浴箱中变性5分钟，然后以每秒下降0.1℃的速度将温度逐步降至25℃，使其形成稳定的发夹结构。
[0052] 表1检测体系中各组分配比
[0053]组分 加样体积(μL) 反应浓度
灭菌蒸馏水 27 /
10×PBS buffer 5 1×
100mM MgSO4 5 10mM
10mM dNTPs 2.5 0.5mM
Bst(8U/uL) 4 0.64U/μL
催化发夹HP(10μM) 1 0.2μM
DNA纳米器件(10μM) 2 0.4μM
待测靶标序列 1 /
Cas12a(20μM) 0.5 0.2μM
crRNA(20μM) 1 0.4μM
DNA报告分子(10μM) 1 0.2μM
总体积(μL) 50 /
[0054] 4、靶标核酸序列的检测步骤
[0055] 按本实施例各组分的配比表1所述比例，配置反应体系，主要组分包含催化发夹、2+
DNA纳米器件、Cas12a、crRNA、FAM/BHQ1标记的ssDNA报告分子、Mg 、Bst置换聚合酶、dNTPs，在50μL的1×PBS缓冲液中加入上述组分，并加入待测靶标核酸单链DNA后，将反应体系混合液置于恒温条件下，优选温度为37℃，反应优选时间为30分钟，采用荧光信号检测仪采集信号。每个10秒采用荧光信号检测仪采集一次荧光信号，反应持续15分钟，之后在80℃下加热
10min，终止反应，结果如图5所示。
[0056] 实施例3
[0057] 本发明以A组轮状病毒为例描述该方法的操作步骤：
[0058] 1、利用NCBI BLAST对NCBI数据库中记录的A组轮状病毒VP6基因的序列进行比对分析，筛选不同亚型内同源保守序列作为病毒特异性靶标，并用于检测组分设计与制备。
[0059] (1)依据A组轮状病毒VP6基因序列设计本实施例中可选用的轮状病毒特异引物寡核苷酸序列，其序列特征如SEQ ID NO1。
[0060] (2)依据A组轮状病毒VP6基因序列设计本实施例中可选用的轮状病毒特异引物的互补寡核苷酸序列，其特征如SEQ ID NO2；所述引物互补寡核苷酸序列3’端含有一段未杂交结构域作为链置换反应的支点链(Toehold)，优选8个碱基。
[0061] (3)依据A组轮状病毒VP6基因序列设计本实施例中可选用的催化型发夹序列，其序列特征如SEQ ID NO 4；
[0062] 进一步，所述引物与催化型发夹结合触发原位级联引物交换反应，在crRNA引导作用下可激活Cas12a效应蛋白的内切核酸酶活性，从而导致FAM/Biotin标记的ssDNA报告分子被切割，利用试纸条层析显色方法可实现样品中的核酸的可视化检测。
[0063] (4)依据A组轮状病毒VP6基因序列设计本实施例中CRISPR/Cas12a信号检测体系。
[0064] 本发明所述Cas12a效应蛋白源自Lachnospiraceae bacterium ND2006的依赖于RNA介导的Cas12a内切核酸酶(LbCas12a)，该蛋白与crRNA结合形成复合物，与互补单链DNA或者双链DNA的结合释放出强大的非特异性ssDNA反式切割活性；
[0065] 所述crRNA序列由构建crRNA体外转录载体并用T7转录试剂盒进行体外转录和纯化获得，序列特征如SEQ ID NO 5；
[0066] 所述DNA报告分子设计、化学合成并HPLC纯化，实施例中选用FAM/Biotin标记的ssDNA报告分子,其序列特征如SEQ ID NO 7：5’‑FAM‑TTATTATT‑Bio‑3’，用于试纸条层析显色的可视化检测。
[0067] 本发明所述的CRISPR/Cas12a信号检测体系在靶标DNA存在时，Cas12a与crRNA以及靶标DNA形成三元复合体，同时该复合体产生trans切割的活性并切割FAM/Biotin标记的ssDNA报告分子。
[0068] 2、制备A组轮状病毒VP6基因序列的识别DNA纳米器件
[0069] 设计并化学合成所述VP6基因特异性引物的核苷酸序列以及含有Toehold支点链的核苷酸序列，所述引物序列与含有支点链序列的3’端互补，结构特征如图2所示。所述的核苷酸序列溶解于杂交缓冲液(10mM Tris‑Hcl,50mM NaCl,10mM MgCl2,pH＝7.4)制备成10μM的溶液后，再将10μM引物核苷酸与10μM含有Toehold支点链的核苷酸等体积混合，并置于95℃水浴箱中变性5分钟，然后以每秒下降0.1℃的速度将温度逐步降至25℃，使其充分杂交形成DNA纳米器件。
[0070] 3、DNA催化发夹制备
[0071] 设计并化学合成所述的催化发夹核苷酸序列，该催化型发夹结构特征如图3所示。所述的催化发夹核苷酸溶解于退火缓冲液(10mM Tris‑Hcl,50mM NaCl,1mM EDTA,pH＝
7.5)制备成10μM的溶液，并置于95℃水浴箱中变性5分钟，然后以每秒下降0.1℃的速度将温度逐步降至25℃，使其形成稳定的发夹结构。
[0072] 4、靶标核酸序列的检测步骤
[0073] 按本发明各组分的配比表1所述比例，配置反应体系，主要组分包含催化发夹、DNA2+
纳米器件、Cas12a、crRNA、FAM/Biotin标记的ssDNA报告分子、Mg 、Bst置换聚合酶、dNTPs，在50μL的1×PBS缓冲液中加入上述组分，并加入待测靶标核酸单链DNA后，将反应体系混合液置于恒温条件下，优选温度为37℃，反应优选时间为30分钟，产物加入50μL样本稀释液，于室温下层析2min，肉眼进行结果判读，如图6所示，NTC为阴性，PC为阳性，阳性在T线显色，阴性样本在检测线处不显色。
[0074] 以上仅是本发明的特征实施范例，对本发明保护范围不构成任何限制。凡采用同等交换或者等效替换而形成的技术方案，均落在本发明权利保护范围之内。
