[0001] 本发明涉及例如包含修饰多糖的复合体。

[0002] 免疫细胞，特别是巨噬细胞(肿瘤相关巨噬细胞，缩写为“TAM”)在癌症组织中的重要性已被指出是影响癌症恶性程度的一个因素。已知TAM具有免疫刺激性(M1)和免疫抑制性(M2)。M2 TAM通过减少对癌症的免疫攻击，促进癌症的恶性转化和生长。如果免疫抑制的M2 TAM可以转化为免疫刺激的M1 TAM，则可以增强对癌症的免疫攻击，并抑制癌症的恶性转化和生长。

[0003] CpG寡核苷酸能够刺激先天免疫受体，从而将M2 TAM转化为M1 TAM。还可以提高对其他免疫疗法(例如免疫检查点抑制剂)的敏感性。然而，CpG寡核苷酸在药物动力学和安全性方面存在全身给药(例如静脉给药)的问题。

[0004] 据报道，由于疏水化多糖，如胆甾醇基普鲁兰多糖，可以自组装形成纳米凝胶，具有高度生物相容性，用作蛋白质载体，并具有抑制所含蛋白质降解和聚集的能力，因此它们与蛋白质形成复合体，用作抗原载体(NPL 1)。此外，已经发现胆固醇基普鲁兰多糖以肿瘤内TAM选择性方式积累(NPL 2)，并且可用作TAM选择性递送系统。

[0005] 引文列表

[0006] 专利文献

[0007] NPL 1：Muraoka,D.等人,ACS Nano,8(9),9209‑9218,2014

[0008] NPL 2：Muraoka D.等人,J Clin Invest.129(3):1278‑1294,2019。

[0038] 在本说明书中，术语“包括”和“包含”包括“包括”、“包含”、“基本上由...组成”和“由...组成”的概念。

[0039] 1.复合体

[0040] 在一个实施方式中，本发明涉及包含含有具有甾醇骨架的疏水基团A的修饰CpG寡核苷酸和含有疏水基团B的修饰多糖的复合体(在本说明书中，也称为“本发明的复合体”)。下文将对此进行描述。

[0041] 修饰CpG寡核苷酸是通过修饰CpG寡核苷酸获得的化合物，并且没有特别限制，只要其包含具有甾醇骨架的疏水基团A作为修饰基团即可。

[0042] 形成修饰CpG寡核苷酸的CpG寡核苷酸(即，修饰前的CpG寡核苷酸)没有特别限制，只要它是含有未甲基化胞嘧啶‑鸟嘌呤二核苷酸(5'‑CpG‑3')基序(CpG基序)的单链寡核苷酸即可。已知CpG寡核苷酸可用作疫苗佐剂，因为它们通过Toll样受体(TLR)诱导获得性免疫应答。CpG寡核苷酸可含有至少一个CpG基序，或可含有多个CpG基序。

[0043] 形成CpG寡核苷酸的核苷酸的数目没有特别限制，但例如为8至50个碱基，优选8至40个碱基，更优选8至30个碱基，甚至更优选10至25个碱基，还更优选15至25个碱基，并且特别优选18至25个碱基。

[0044] 基于序列、二级结构、对人外周血单核细胞(PBMC)的影响等，CpG寡核苷酸被分类为A类(D型)、B类(K型)、C类、P类和S类。其中优选作为CpG寡核苷酸的是A类CpG寡核苷酸、B类CpG寡核苷酸等。

[0045] CpG寡核苷酸中的核苷酸间连接可以是磷酸二酯连接或硫代磷酸酯连接。硫代磷酸酯连接可以提高核酸酶抗性。B类CpG寡核苷酸通常具有硫代磷酸酯骨架的线性结构，并且通常不形成高阶结构。A类CpG寡核苷酸通常在中心具有磷酸二酯连接，两端的聚G基序形成称为“G‑四分体(G‑tetrad)”的高阶结构。

[0046] CpG寡核苷酸的具体实例如下。

[0047] A类：D35‑CpG、ODN1585、ODN2216、ODN2336等。

[0048] B类：K3‑CpG、ODNBW006、ODN D‑SL01、ODN1668、ODN1826、ODN2006(CpG7909、PF‑3512676)、ODN2007、ODN684等。

[0049] C类：ODN D‑SL03、ODN 2395、ODN M362等。

[0050] 其他示例包括CpG‑28、CpG‑685(GNKG‑168)、CpG‑ODN C274、KSK‑13(KSK‑CpG)、CpG ODN 10104(CpG‑10104)、CpG ODN‑1585、ODN‑5890、1018‑ISS、EMD‑121081(HYB‑2055、IMO‑2055)等。

[0051] 所使用的CpG寡核苷酸可以是市售产品或根据已知生产方法获得的产品。

[0052] 疏水基团A是具有甾醇骨架的疏水基团，在这方面没有特别限制。甾醇骨架是一种醇，其中羟基连接到式I所示的环戊基氢菲环上。式I中的符号A至D表示形成环戊基氢菲环的每个环。

[0053]

[0054] 在甾醇骨架中，环戊基氢菲环可以具有双键，羟基的键合位置不受限制。优选的是在C‑3位具有羟基并且在B环中具有双键的甾醇，或者在C‑3位置具有羟基并且具有饱和环的甾烷醇。疏水基团A的实例包括衍生自具有修饰甾醇骨架的化合物的基团，例如，成环碳被烃基(例如，C1‑20直链或支链烷基)取代。短语“衍生自”是指从中除去氢原子或官能团(如羟基)的化合物的基团。

[0055] 疏水基团A的实例包括胆固醇衍生基团、胆甾烷醇衍生基团、羊毛甾醇衍生基团、麦角固醇衍生基团、β‑谷甾醇衍生基团、菜油甾醇衍生基团、豆甾醇衍生基团和菜子甾醇衍生基团等。其中优选的是甾醇衍生基团，例如胆固醇衍生基团、胆甾烷醇衍生基团、羊毛甾醇衍生基团和麦角甾醇衍生基团；更优选胆固醇衍生基团。

[0056] 形成修饰CpG寡核苷酸的核苷酸的数目没有特别限制，但例如为8至50个碱基，优选8至40个碱基，更优选8至30个碱基，甚至更优选10至25个碱基，还更优选15至25个碱基，并且特别优选18至25个碱基。

[0057] 修饰CpG寡核苷酸中包含的疏水基团A的数量没有特别限制，例如为1至8个。该数优选为1至5个，更优选为1到3个，甚至更优选为1或2个，并且还甚至更优选为1个。此外，形成修饰CpG寡核苷酸的每20个核苷酸的疏水基团A的数量优选为1至8个，更优选为1至5个，甚至更优选为1至3个，还甚至更优选为1或2个，特别优选为1个。

[0058] 修饰CpG寡核苷酸中疏水基团A的连接位置没有特别限制，可以是末端部分(5’端或3’端)或非末端部分(例如，在碱基上)。连接位置优选为终端部分。

[0059] 疏水基团A可以直接或间接(例如通过接头)与CpG寡核苷酸连接。接头没有特别限制，实例包括其中几种乙二醇连接在一起的接头(例如，TEG接头和PEG接头)、烷基接头、dSpacer、炔基dSpacer和二丙基二硫TEG接头等。当存在接头时，形成接头主链的原子数(例如碳、氧、氮和硫原子)没有特别限制，但例如为1至30个，优选2至24个，更优选4至18个，甚至更优选8至15个。

[0060] 修饰CpG寡核苷酸可以通过或根据已知的修饰寡核苷酸的方法合成。

[0061] 修饰CpG寡核苷酸可以单独使用或两种或更多种组合使用。

[0062] 修饰多糖是通过对多糖进行修饰而获得的化合物，并且只要其含有疏水基团B作为修饰基团就没有特别限制。

[0063] 形成修饰多糖的多糖(即，修饰前的多糖)没有特别限制，只要其是糖残基糖苷连接的聚合物即可。形成多糖的糖残基的可用实例包括源自糖的残基，例如单糖(例如葡萄糖、甘露糖、半乳糖和岩藻糖)、二糖或寡糖。糖残基可以是1,2‑、1,3‑、1,4‑或1,6‑糖苷连接，其连接可以是α‑或β‑连接。此外，所述多糖可以是直链或支链的。优选的糖残基是葡萄糖残基。优选的多糖是例如天然存在或合成的普鲁兰多糖、葡聚糖、直链淀粉、支链淀粉、甘露聚糖等；优选普鲁兰多糖、甘露聚糖等；更优选普鲁兰多糖等。

[0064] 多糖的重均分子量没有特别限制，只要修饰多糖可以形成纳米凝胶，但例如为5000至2000000。多糖的重均分子量优选为10000至1000000，更优选为20000至500000，甚至更优选为40000至250000，并且还更优选为80000至125000。

[0065] 所用的多糖可以是市售产品或根据已知生产方法获得的产品。

[0066] 疏水基团B是具有疏水性的基团，并且没有特别限制，只要修饰多糖能够形成纳米凝胶即可。例如，疏水基团B优选为具有甾醇骨架的疏水基团、烃基等；特别优选具有甾醇骨架的疏水基团。

[0067] 具有甾醇骨架的疏水基团的解释与疏水基团A的解释相同。烃基的实例包括但不特别限于C8‑50(优选C10‑30，更优选C12‑20)链(优选直链)烃基(优选烷基)。

[0068] 修饰多糖的重均分子量没有特别限制，只要修饰多糖可以形成纳米凝胶，但例如为5000至2000000。修饰多糖的重均分子量优选为10000至1000000，更优选为20000至500000，甚至更优选为40000至250000，并且还更优选为80000至125000。

[0069] 修饰多糖中包含的疏水基团B的数量没有特别限制，只要修饰多糖可以形成纳米凝胶，但例如每100个形成多糖的糖残基的疏水基团B的数量为1至10个，优选1至5个。

[0070] 疏水基团B可以直接或间接地(例如通过接头)与多糖连接。

[0071] 修饰多糖优选为例如每100个形成多糖的糖残基含有1至10个(优选1至5个)糖单元的多糖，其伯羟基由式II：‑O‑(CH2)mCONH(CH2)nNH‑CO‑O‑R(II)表示，其中R是具有甾醇骨架或烃基的疏水基团，m是0或1，n是任何正整数。n优选为1至8。

[0072] 修饰多糖可以通过或根据已知方法(例如WO00/12564)合成。例如，可以使用以下1 1
方法。首先，使含C12‑50羟基的烃或甾醇与由式OCN‑R NCO(其中R 是C1‑50烃基)表示的二异氰酸酯化合物反应，以产生含异氰酸酯基的疏水化合物，其中一分子含C12‑50羟的烃或甾醇反应。然后，将所得的含异氰酸酯基的疏水化合物与多糖进一步反应，以制备含疏水基团的多糖，所述多糖含有C12‑50烃基或甾醇基团作为疏水基团。所得反应产物用酮溶剂纯化，由此可制备高纯度含疏水基团的多糖。

[0073] 修饰多糖可以单独使用或两种或更多种组合使用。

[0074] 本发明复合体中修饰CpG寡核苷酸和修饰多糖的比例没有特别限制。本发明的复合体每摩尔份的修饰CpG寡核苷酸含有例如0.1至10摩尔份、优选1至7摩尔份、更优选2至4摩尔份的量的修饰多糖。

[0075] 本发明的复合体可以是纳米凝胶颗粒。术语“纳米凝胶”是指具有水凝胶结构的聚合物凝胶纳米颗粒。术语“水凝胶”是指亲水性聚合物交联并用水溶胀形成的三维网络结构。在作为纳米凝胶颗粒的本发明复合体中，修饰多糖通过基于与疏水基团B的疏水相互作用形成的物理交联自组装，形成三维网络结构。当本发明的复合体是纳米凝胶颗粒时，修饰CpG寡核苷酸优选存在于纳米凝胶颗粒内。

[0076] 纳米凝胶颗粒的形状没有特别限制，但通常为球形。

[0077] 本发明的复合体的重均粒径例如为100nm以下，优选为10至100nm，更优选为15至70nm，甚至更优选为20至50nm。粒径可以通过动态光散射方法测量。

[0078] 本发明的复合体可以含有除修饰CpG寡核苷酸和修饰多糖以外的物质。其他物质的实例包括蛋白质、肽、核酸、糖、低分子量化合物、高分子量化合物和矿物质及其复合物。以修饰CpG寡核苷酸和修饰多糖的总含量为100质量份为基础，其他物质的含量为例如0至
10000质量份、0至1000质量份、0至500质量份、0至100质量份、0至50质量份、0至10质量份。

[0079] 本发明的复合体可以通过混合修饰CpG寡核苷酸溶液和修饰多糖溶液来制备。

[0080] 每个溶液都可以通过将修饰CpG寡核苷酸或修饰多糖溶解在溶剂中来制备。作为溶剂，例如，可以使用有机溶剂，例如水和DMSO。修饰多糖溶液通常可以通过使用水作为溶剂来制备。在这种情况下，优选使用缓冲溶液，例如PBS，代替水。修饰CpG寡核苷酸溶液可以通过根据其类型适当选择溶剂来制备。例如，A型CpG寡核苷酸通常可以通过使用水作为溶剂来制备，B型CpG寡核苷酸通常可以通过使用有机溶剂例如DMSO作为溶剂来制备。

[0081] 在通过混合修饰CpG寡核苷酸溶液和修饰多糖溶液获得的混合溶液中，修饰CpG寡核苷酸的浓度没有特别限制，但从纳米凝胶颗粒的形成效率的角度来看，例如为1至50μM，优选2至40μM，更优选5至30μM，甚至更优选8至25nM。

[0082] 修饰多糖在混合溶液中的浓度没有特别限制，但从纳米凝胶颗粒的形成效率的角度来看，修饰多糖的浓度例如为5至100μM，优选为5至80μM，更优选为8至50μM。

[0083] 混合溶液中修饰CpG寡核苷酸和修饰多糖的摩尔比没有特别限制。从纳米凝胶颗粒的形成效率的角度来看，每摩尔修饰CpG寡核苷酸，修饰多糖的量为例如0.1至4mol，优选0.2至3mol，更优选0.5至2.5mol，甚至更优选0.8至2.2mol。

[0084] 从纳米凝胶颗粒的形成效率的角度来看，优选对混合溶液进行超声处理，或者向混合溶液中添加变性剂，例如尿素、DMSO或表面活性剂，然后通过透析去除变性剂。就容易性而言，前一种方法更优选。后一种方法可以通过已知方法或根据已知方法进行。

[0085] 例如，可以通过向含有混合溶液的塑料管施加超声波并将其固定在超声浴槽中的水中来执行超声处理。超声处理条件没有特别限制，但例如为10至40℃(优选20至35℃)，10至50kHz(优选20至40kHz)，30至200W(优选70至150W)，以及2至30分钟(优选5至15分钟)。在本发明的一个实施方式中，优选首先对修饰多糖溶液进行超声处理(例如，2至30秒，优选5至15秒)，并且在与修饰CpG寡核苷酸混合之后，进一步进行超声处理，例如，2至30分钟，优选5至15分钟)。

[0086] 2.用途

[0087] 本发明的复合体含有修饰CpG寡核苷酸，因此可以表现出CpG寡核苷酸的各种作用(例如TLR刺激作用和基于此的各种作用(例如炎性细胞因子产生促进作用、I型干扰素产生促进作用等))。因此，本发明的化合物可以用作药物、试剂等的活性成分(在本说明书中也称为“本发明的药物”)，具体地用于基于TLR刺激的各种用途，更具体地用作例如免疫调节剂、抗癌剂、抗病毒剂、佐剂(例如疫苗佐剂)等的有效成分。

[0088] 本发明的药物没有特别限制，只要它包含本发明的复合体即可。如果需要，本发明的药物还可以含有其他成分。其他组分没有特别限制，只要它们是药学上可接受的组分。除了具有药理作用的组分之外，其他组分的实例包括添加剂。添加剂的实例包括碱(bases)、载体、溶剂、分散剂、乳化剂、缓冲剂、稳定剂、赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、增稠剂、保湿剂、着色剂、调味剂、螯合剂等。

[0089] 本发明的药物的使用模式没有特别限制，可以根据其类型使用合适的使用模式。本发明的药物可以例如在体外(例如，添加到培养细胞的培养基中)或体内(例如，施用到动物中)使用，这取决于其用途。

[0090] 本发明的药物的应用目的没有特别限制。哺乳动物的实例包括人类、猴子、小鼠、大鼠、狗、猫、兔子、猪、马、牛、绵羊、山羊、鹿等。此外，细胞的实例包括动物细胞等。细胞的类型也没有特别限制，实例包括血细胞、造血干细胞/祖细胞、配子(精子和卵子)、成纤维细胞、上皮细胞、血管内皮细胞、神经元、肝细胞、角质形成细胞、肌肉细胞、表皮细胞、内分泌细胞、ES细胞、iPS细胞、组织干细胞、癌症细胞等。

[0091] 当本发明的药物用作抗癌剂并用于癌症细胞时，目标癌症没有特别限制。实例包括白血病(包括慢性淋巴细胞白血病和急性淋巴细胞白血病)、淋巴瘤(包括非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、Berkit淋巴瘤、恶性淋巴瘤、弥漫性淋巴瘤和滤泡性淋巴瘤)、骨髓瘤(包括多发性骨髓瘤)、乳腺癌、结肠癌、肾癌症、胃癌、卵巢癌、胰腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌、食管癌、肝癌、头颈部鳞状上皮癌、皮肤癌、恶性黑色素瘤、泌尿道癌、前列腺癌、絨毛腺瘤(villous cancer)、咽癌、喉癌、卵泡膜瘤、男性生殖细胞瘤、子宫内膜增生、子宫内膜异位症、胚胎瘤、纤维肉瘤、卡波西肉瘤、血管瘤、海绵状血管瘤、血管母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、星形细胞瘤、神经纤维瘤、少突胶质瘤、成神经管细胞瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤、横纹肌肉瘤、成神经管细胞瘤、骨原性肉瘤、平滑肌肉瘤、甲状腺肌瘤、肾母细胞瘤等。

[0092] 本发明的药物可以具有任何剂型，并且实例包括口服剂型，例如片剂(包括口腔崩解片、咀嚼片、发泡片、含片(troches)、软糖(jelly drops)等)、丸剂、颗粒、细微颗粒、粉末、硬胶囊、软胶囊、干糖浆、液体(包括可饮用制剂、悬浮液和糖浆)和果冻；和肠外剂型，如可注射制剂(例如，滴注(静脉滴注等)、静脉注射、肌肉注射、皮下注射和皮内注射)、外用制剂(例如软膏、膏药和洗剂)、栓剂、吸入剂、滴眼液、眼膏、滴鼻液、滴耳液和脂质体制剂。

[0093] 本发明药物的给药途径没有特别限制，只要获得期望的效果即可。实例包括肠内给药，例如口服、管饲和灌肠给药；胃肠外给药，如静脉内、动脉内、肌肉内、心内、皮下、皮内和腹腔内给药；等等。

[0094] 本发明的药物中活性成分的含量根据使用模式、施用对象、施用对象的状态等而变化，并且不受限制。例如，活性成分的含量为0.0001至100wt.％，优选0.001至50wt.％。

[0095] 本发明的药物在向动物施用时的剂量没有特别限制，只要它是表达药物效果的有效量。在口服给药的情况下，活性成分的重量通常为每天0.1至1000mg/kg体重，优选为每天0.5至500mg/kg体重。在肠胃外给药的情况下，活性成分的重量为每天0.01至100mg/kg体重，优选每天0.05至50mg/kg体重。上述剂量可根据年龄、病理状况、症状等适当增加或减少。

[0096] 实施例

[0097] 以下基于实施例详细描述本发明；然而，本发明不限于这些实施例。

[0098] 试验例1.CHP纳米凝胶与Chol‑CpG(K3)的复合试验

[0099] 试验例1‑1.CHP的制备

[0100] 根据先前报道的文献(Macromolecules 1993,23,3062‑3068)，胆固醇修饰的普鲁兰多糖(CHP)是通过向重均分子量为450000的普鲁兰多糖中引入每100个单糖1.2个胆固醇来生产的。

[0101] 试验例1‑2.Chol‑CpG(K3)的制备

[0102] 胆固醇修饰的K3 CpG(Chol‑CpG(K3))是由Gene Design Inc.定制合成的，其中胆固醇通过三甘醇接头与K3 CpG寡核苷酸(SEQ ID NO 1:5’‑atcgactctcgagcgttctc，所有核苷酸之间的连接均为硫代磷酸酯连接)的5'端相连。

[0103] 试验例1‑3.CHP纳米凝胶溶液的制备

[0104] 将CHP加入PBS至0至20μM，并通过在25℃下用搅拌器搅拌15小时溶解。然后，使用探针型超声波发生装置间歇地施加超声波6分钟。将该溶液在25℃，20000g条件下离心30分钟后，通过0.22μm的过滤器对上清液进行过滤消毒。在实施例中，CHP溶液以这种方式制备，与溶剂类型无关。CHP纳米凝胶的重均分子量以摩尔浓度计为450000。

[0105] 试验例1‑4.Chol‑CpG(K3)溶液的制备

[0106] 将DMSO添加到定制合成的Chol‑CpG(K3)至400μM，并通过搅拌溶解。

[0107] 试验例1‑5.CHP纳米凝胶与Chol‑CpG(K3)的复合

[0108] 将CHP纳米凝胶溶液(试验例1‑3)用PBS稀释至0‑20μM的浓度，并将76μL CHP纳米凝胶溶液置于塑料管中。将管直接固定在充满水的超声浴槽中的超声震荡器上方，并在25至30℃、28kHz、100W的水温下开始超声照射。5至10秒后，使用微量移液管将400μM的Chol‑CpG(K3)/DMSO溶液(4.0μL)添加到CHP纳米凝胶溶液中。添加后，继续超声照射10分钟，将所得溶液用作Chol‑CpG(K3)/CHP纳米凝胶复合体样品用于进一步分析。

[0109] 试验例1‑6.复合体的HPLC分析

[0110] 作为试验例1‑5中制备的Chol‑CpG(K3)/CHP纳米凝胶复合体样品的复合评估，进行尺寸排阻色谱(SEC)。条件如下。柱：G3000SWXL(Tosoh Corporation)，7.8mm x 150mm，检测器：UV(260nm)，柱检测温度：35℃，注射量：20μL，流速：0.5mL/min，洗脱液：PBS(pH：7.4)。使用PBS作为洗脱液，在260nm处检测洗脱液，这是对作为核酸佐剂的CpG特异的吸收波长。

[0111] Chol‑CpG(K3)：20μM和CHP纳米凝胶：20μM的结果(色谱图)如图1所示。在单独的CHP纳米凝胶(20μM)的色谱图(蓝线)中，仅在约6分钟时检测到由于纳米凝胶的光散射而产生的小峰。此外，在单独的Chol‑CpG(K3)(20μM)的色谱图(红线)中，在约10分钟时检测到源自Chol‑CpG(K3)的大单峰。另一方面，在CHP纳米凝胶和Chol‑CpG(K3)的终浓度为20μM(绿线)的条件下复合的样品的色谱图中，在约6分钟(即纳米凝胶的洗脱时间)检测到大的单峰，而在约10分钟(即Chol‑CpG(K3)的洗脱时间)仅观察到小的峰。在复合体样品中约6分钟出现大的单峰表明纳米凝胶和Chol‑CpG(K3)形成复合体。这也可以通过Chol‑CpG(K3)单峰的显著降低来证实，这应该在大约10分钟时检测到。

[0112] 图2显示了在0至40μM范围内改变CHP纳米凝胶的终浓度，同时将Chol‑CpG(K3)的终浓度设置为20μM(复合化率)的结果。分析了在约10分钟时未与纳米凝胶复合的源自Chol‑CpG(K3)的峰的面积，并绘制了与纳米凝胶的复合化率。在复合过程中，随着CHP纳米凝胶浓度的增加，非复合的Chol‑CpG(K3)衍生峰降低。在CHP纳米凝胶浓度为40μM且与Chol‑CpG(K3)的摩尔比为2:1的纳米凝胶下，复合化率几乎为100％，并且在1:1的摩尔比下复合化率约为95％。

[0113] 试验例1‑7.复合体物理特性的评估(DLS)

[0114] 对于在试验例1‑5中用Chol‑CpG(K3)：20μM和CHP纳米凝胶：20μm制备的复合体，使用动态光散射(DLS)仪器测量通过累积量分析获得的平均粒径。将复合体样品和单独的CHP纳米凝胶(终浓度：20μM)置于DLS测量池中，并置于DLS仪器(Zetasizer Nano ZS，由Malvern生产)中进行测量。结果如表1和图3所示。

[0115] 表1

[0116]

[0117] 单独的CHP纳米凝胶(终浓度：20μM)中的平均粒径为约33nm，复合体样品中的平均粒径为约39nm。复合体样品的粒径比单独的CHP纳米凝胶的粒径大几个nm；然而，没有检测到由于聚集体形成导致的粒径显著增加。

[0118] 试验例1‑8.复合体物理特性的评估(TEM)

[0119] 用透射电子显微镜(TEM)观察在试验例1‑5中用Chol‑CpG(K3)：20μM和CHP纳米凝胶：20μm制备的复合体。将10μL的复合体样品浇铸在弹性碳支撑膜上用于TEM观察，并静置10分钟，然后用滤纸吸收液体。接着，将10μL磷钨酸水溶液浇铸在支撑膜上并静置1分钟以染色。然后，用滤纸吸收染色溶液，接着在减压下干燥过夜，并进行TEM观察。

[0120] 结果如图4所示。作为TEM观察的结果(载玻片11的下部)，观察到约20至30nm的圆形结构。TEM观察和上述DLS证实，通过复合操作获得的Chol‑CpG(K3)/CHP纳米凝胶复合体没有形成聚集体，并且保持与单独的CHP纳米凝胶相同的粒径。

[0121] 试验例2.CHP纳米凝胶与Chol‑CpG(D35)的复合试验

[0122] 试验例2‑1.Chol‑CpG(D35)的制备

[0123] 胆固醇修饰D35 CpG(Chol‑CpG(D35))由Gene Design Inc.定制合成，其中胆固醇通过三甘醇接头与D35 CpG寡核苷酸(SEQ ID NO2:5’‑g^gtgcatcgatgcagggg^g^g；^代表硫代磷酸酯连接，其他连接是磷酸二酯连接)的5’端连接。

[0124] 试验例2‑2.Chol‑CpG(D35)溶液的制备

[0125] 将无菌蒸馏水添加到定制合成的Chol‑CpG(D35)至200μM，并通过搅拌溶解，然后在90℃加热5分钟并冷却至室温。

[0126] 试验例2‑3.CHP纳米凝胶与Chol‑CpG(D35)的复合

[0127] 将CHP纳米凝胶溶液(试验例1‑3)用无菌蒸馏水稀释至0至20mg/mL的浓度，并将72μL CHP纳米胶体溶液置于塑料管中。将管直接固定在充满水的超声浴槽中的超声震荡器上方，并在28kHz，100W下开始超声照射。5至10秒后，使用微量移液管将200μM的Chol‑CpG(D35)/水溶液(8.0μL)添加到CHP纳米凝胶溶液中。添加后，施加超声波5分钟，然后加入8.8μL 10x PBS，并继续超声照射5分钟。将所得溶液用作Chol‑CpG(D35)/CHP纳米凝胶复合体样品用于进一步分析。

[0128] 试验例2‑4.复合体的HPLC分析

[0129] 作为试验例2‑3中制备的Chol‑CpG(D35)/CHP纳米凝胶复合体样品的复合评估，以与试验例1‑6中相同的方式进行尺寸排阻色谱(SEC)。

[0130] 色谱图如图5所示。在单独的Chol‑CpG(D35)(20μM)的色谱图(绿线)中，在约8至15分钟时检测到来自Chol‑CpG(D35)的几个宽峰。Chol‑CpG(K3)在约10分钟时显示出尖锐的单峰，而Chol‑Cp G(D35)显示出几个宽峰，表明Chol‑CpG(D35)在PBS中形成多物种聚集体。另一方面，证实了在CHP纳米凝胶与Chol‑CpG(D35)的复合过程中，随着纳米凝胶的摩尔比从1.25:20增加到40:20(浅绿色线到深蓝色线)，在约6分钟时源自复合体的尖锐单峰的强度增加，而在约8至15分钟时源自Chol‑CpG(D35)的峰的强度降低。复合体样品中约6分钟时大单峰的增加表明纳米凝胶和Chol‑CpG(D35)形成复合体。这也可以通过Chol‑CpG(D35)峰的显著降低来证实，这应该在大约8至15分钟时检测到。

[0131] 复合化率如图6所示。分析了在约8至15分钟时未与纳米凝胶复合的源自Chol‑CpG(D35)的峰的面积，并绘制了与纳米凝胶的复合化率。随着复合过程中CHP纳米凝胶浓度的增加，源自非复合Chol‑CpG(D35)的峰减少。在CHP纳米凝胶浓度为40μM且与Chol‑CpG(D35)的摩尔比为2:1的纳米凝胶下，复合化率几乎为100％，摩尔比为1:1时，复合化率约为90％。

[0132] 试验例2‑5.复合体物理特性的评估(DLS)

[0133] 对于在试验例2‑4中用Chol‑CpG(D35)：10μM和CHP纳米凝胶：10μM制备的复合体(终浓度：9μM)，以与试验例1‑7相同的方式使用动态光散射(DLS)仪器测量粒径。结果如表2所示。

[0134] 表2

[0135]

[0136] 结果表明，在单独的CHP纳米凝胶中为约33nm，在复合体样品中为约28nm。复合体样品的粒径与单独的CHP纳米凝胶的粒径相似。未检测到由于聚集体形成导致的粒径显著增加。

[0137] 试验例3.CpG/CHP纳米凝胶复合体与细胞的相互作用

[0138] 为了研究CHP纳米凝胶/Chol‑CpG复合体与细胞之间的相互作用，使用罗丹明修饰的CHP(CHP‑Rh)和在3’端用荧光素修饰的Chol‑CpG(5’‑chol、3’‑FAM CpG)制备复合体，并使用共聚焦激光扫描显微镜和流式细胞术评估与小鼠巨噬细胞样细胞(RAW 264.7)的相互作用。

[0139] 试验例3‑1.CHP‑Rh纳米凝胶/5'‑chol、3'‑FAM CpG复合体的制备

[0140] 在超声照射(28kHz，100W)下，将在90℃加热5分钟的10μL的5’‑chol，3’‑FAM CpG(K3和D35)/水(200μM)添加到90μL CHP‑Rh纳米凝胶/水(10mg/mL)中，并继续超声照射5分钟。此后，在施加超声波的同时加入10x PBS，并再进行5分钟的超声照射，以使用1xPBS作为溶剂制备复合体。

[0141] 试验例3‑2.用共聚焦激光扫描显微镜进行观察

[0142] 将190μL RAW 264.7悬浮液(培养基：DMEM+10％FBS)以5.0x105个细胞/mL接种在玻璃底皿中，并预培养过夜。培养后，添加10μLCHP‑Rh纳米凝胶/5'‑chol，3'‑FAM CpG(K3和D35)复合体溶液(纳米凝胶和CpG终浓度：1μM)，并在37℃的CO2培养箱中放置4小时。静置后，取出培养基，用PBS洗涤细胞，然后使用共聚焦激光扫描显微镜(LSM510 META，Zeiss生产)观察。

[0143] 结果如图7所示。在这两种复合体中，在细胞中观察到源自纳米凝胶的Rh(红色)和Chol‑CpG的FAM(绿色)的荧光，并证实纳米凝胶和Chol‑CpG被并入RAW 264.7细胞中。此外，还观察到Rh和FAM荧光的亚细胞定位在许多区域都是一致的，这表明纳米凝胶和Chol‑CpG同时并入到细胞中，即以复合体形式并入。

[0144] 试验例3‑3.流式细胞术评估

[0145] 将450μL RAW 264.7悬浮液(培养基：DMEM+10％ FBS)以1.0x 106细胞/mL接种在12孔板中，并预培养过夜。培养后，加入50μLCHP‑Rh纳米凝胶/5'‑chol，3'‑FAM CpG(K3和D35)复合体溶液(终浓度：各1μM)，并在37℃的CO2培养箱中放置4小时。静置后，除去培养基，用PBS洗涤细胞。然后，通过胶原酶分离细胞以制备细胞悬浮液，然后通过流式细胞术分析。

[0146] 结果如图8所示。在加入CHP‑Rh纳米凝胶/5'‑chol，3'‑FAM CpG复合体的细胞中，Ch1的FAM荧光强度和Ch2的Rh荧光强度均增加。在CHP‑Rh纳米凝胶/5'‑chol，3'‑FAM CpG(K3)复合体中，几乎所有的细胞都在双阳性区域中，并且证实几乎所有细胞都并入了纳米凝胶和Chol‑CpG(K3)。此外，在CHP‑Rh纳米凝胶/5'‑chol，3'‑FAM CpG(D35)复合体中，在双阳性区域中检测到50％以上的细胞，表明CHP纳米凝胶/Chol‑CpG复合体可以以高频率并入到细胞中。

[0147] 试验例4.CpG活性评估

[0148] 将180μL RAW 264.7悬浮液(培养基：DMEM+10％ FBS)以2.5x 105个细胞/mL接种在96孔板中，并预培养过夜。培养后，将20μL的每个样品(表3)添加到每个孔中至表3所示的浓度，混合，并在CO2培养箱中培养2天。cGAMP被称为STING受体激动剂，作为阳性对照被纳入样品中。培养后，收集每个孔中的培养上清液，并用封闭缓冲液稀释5倍以提供ELISA样品。根据小鼠TNF‑αELISA试剂盒(Invitrogen生产)的方案测量培养上清液的TNF‑α浓度。

[0149] 表3

[0150]

[0151] 结果如图9所示。当加入CHP纳米凝胶/Chol‑CpG(K3)复合体时，TNF‑α浓度增加，并且该浓度高于加入相同浓度的CpG(K3)和Chol‑CpG(K3)时的浓度。结果表明，CHP纳米凝胶/Chol‑CpG(K3)复合体可以诱导细胞因子的产生，其水平等于或高于单独添加CpG(K3)时的水平。