[0001] 本发明涉及药物载体的制备，尤其涉及一种球状碳酸钙作为新型药物载体的制备方法及应用。

[0002] 药物载体在疾病的临床治疗过程中是药物释放体系的重要组成部分，也是影响药效的主要因素。传统的治疗手段只能起到负载药物到达病灶的功能，对于提高药物的靶向性、选择性、缓释性以及可控性，是当前临床治疗的关键问题。药物缓控释系统相较于游离药物给药治疗方式，具有一系列优点，它能够有效地控制药物释放速率、对正常细胞的毒副作用小、可以减少给药的剂量并降低给药的频率，从而提高药物的生物利用率，充分发挥药物疗效。因此近年来药物缓控释载体的关键是在药物缓控释系统中调控药物的释放速率。目前用于药物缓控释载体的材料按其来源分为：天然高分子材料、半合成高分子材料、合成高分子材料等。但以上材料存在着载药量和包封率低、复合体易水解、合成过程复杂及合成成本高等问题，限制了在药物载体领域中的应用。

[0003] 非活体生物合成的碳酸钙作为药物载体的报道较多，但载药量不高、稳定性不强。随着医学水平的飞速发展，发明一种成本低、载药量高、稳定性强的新型载药材料对疾病的临床治疗具有积极的意义。目前有研究微生物诱导合成的球霰石，由于其具有一定含量的有机质，吸附性和稳定性大大提升，但目前只探究其作为重金属离子吸附剂应用于环境重金属污染的处理中，未见作为药物载体的报导。

[0029] 下面结合实施例和附图，进一步阐明本发明。

[0030] 实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0031] 其中，鼠李糖乳杆菌、枯草芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌均在菌株库购买，鼠李糖乳杆菌为CCTCC DB 20082412；枯草芽孢杆菌为CCTCC AB 209260，贝莱斯芽孢杆菌为CGMCC No.1.12669。

[0032] 实施例1

[0033] 生物源球状碳酸钙的制备方法如下：

[0034] 1、种子液制备：

[0035] 鼠李糖乳杆菌种子培养基：培养采用MRS培养基(DeMan‑Rogosa‑Sharpe medium)，其组成为：蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母膏5g/L，葡萄糖5g/L，乙酸钠5g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，吐温80 1g/L，磷酸氢二钾2g/L，，七水硫酸镁0.2g/L，一水硫酸锰0.05g/L，碳酸钙20g/L，pH 6.8，115℃灭菌30min。接种2环乳杆菌到种子培养基(100/mL)，37℃静置培养
8
10h，菌液浓度约为8×10cfu/mL。

[0036] 枯草芽孢杆菌种子培养基：液体LB培养基，接种2环枯草芽孢杆菌到种子培养基8
(100mL)，37℃、180r/min摇瓶培养12h即可，菌液浓度约为8×10cfu/mL。

[0037] 贝莱斯芽孢杆菌种子培养基：液体LB培养基，接种2环贝莱斯芽孢杆菌置于种子培8
养基(100mL)，37℃、180r/min摇瓶培养12h即可，菌液浓度约为8×10cfu/mL。

[0038] 2、脱钙、脱蛋白及球状碳酸钙合成

[0039] 以中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)为实验材料，取中华绒螯蟹的蟹壳适量，清洗，烘干，粉碎至60目。

[0040] 脱钙处理：鼠李糖乳杆菌发酵培养基：去离子水为溶剂，葡萄糖10g/100mL，蟹壳粉5g/100mL L，115℃灭菌30min。以体积比4％的细菌接种量接入活化后的乳杆菌发酵培养基(100/250mL)，置于37℃，100r/min发酵2d。把反应后的发酵液离心处理(8000rpm，15分钟)，保留滤液(滤液A1)和滤渣A，向滤渣A中加入0.5mol/L的HCl溶液静置2h，添加量为每份蟹壳粉(5g)处理残渣添加5mL HCl溶液。此过程将去除未脱尽的碳酸钙，反应完成后，同上离心收集滤渣B和酸性废液B1备用。滤渣B用作下一步脱蛋白处理。

[0041] 脱蛋白处理：将由乳杆菌脱钙后的全部滤渣B按5g/100mL加入到枯草芽孢杆菌发酵培养基(以去离子水为溶剂，可溶性淀粉9.37g/L，蛋白胨10.85g/L，酵母膏1.67g/L，硫酸锰0.07g/L，硫酸亚铁0.07g/L，硫酸镁0.07g/L，Tween‑200.07g/L，磷酸二氢钠3.61g/L，磷酸氢二钾0.63g/L)中，115℃灭菌30min。接入体积比4％的枯草芽孢杆菌种子液，将培养基置于37℃，180r/min发酵2d。把反应后的发酵液离心处理(8000rpm，15分钟)，保留滤液(滤液C1)和滤渣C。以5g初始蟹壳粉为例，向滤渣C中加入1mol/L的NaOH溶液50mL，90℃水浴静置2h。此过程将去除未脱尽的蛋白质，反应完成后，同上离心收集滤渣D和碱性废液D1备用。

[0042] 球状碳酸钙合成：以初始5g蟹壳粉添加到鼠李糖乳杆菌发酵培养基为例，将上述滤液A1、B1、C1和D1全部混合，加入去离子水，定容至500mL，添加蛋白胨2.5g，酵母膏2.5g和NaCl 5g。调pH值至7.2左右，115℃灭菌30min。取活化好的贝莱斯芽孢杆菌种子液，以体积比2％的细菌接种，置于37℃，180r/min的摇床中震荡培养5d。培养结束后，将发酵液离心(8000r/min、15分钟)收集沉淀，去离子水洗涤后将收集获得的沉淀置于55℃的烘箱中烘干后研磨，即得球状碳酸钙。

[0043] 4、采用XRD、FTIR、SEM‑EDS、对上述制备所得沉淀物的结构及形貌进行鉴定。结合XRD及FTIR结果表明该沉淀物主要为球状碳酸钙及有机质结合形成的复合体(图1a和b)。SEM可观察到球状及少量无定型碳酸钙，可形成球状多孔迭层特征的聚集体(图1c、d和e)。

[0044] 实施例2

[0045] 生物源球状碳酸钙对药物盐酸阿霉素的负载特性：

[0046] 利用上述实施例1中制备的生物源球状碳酸钙用于负载带有正电荷的盐酸阿霉素(DOX)为例：按0.02g/30mL的吸附剂用量，将上述制备的生物源球状碳酸钙加入浓度为(20mg/30mL)的DOX溶液中，在25℃200r/min的摇床中负载36h。药物装载完成后，离心(8000r/min，15min)，收集沉淀和上清液，使用紫外‑可见光分光光度计测量上清液中DOX的吸光度。计算求得药物载体对抗生素的包封率(％)及药物载体的载药量(mg/g)如图2所示。采用Freundlich吸附模型分析其吸附数据，可求得该药物载体对抗生素的最大负载量Qmax(mg/g)为447.579mg/g，包封率可以到94％左右。

[0047] 生物源球状碳酸钙对DOX负载的Freundlich模型参数如表1所示。

[0048]

[0049]

[0050]

[0051] 式中：C为HCl溶液中DOX的浓度mg/L；C0为DOX的初始浓度，mg/L；Ce为吸附达到平衡时溶液中的DOX浓度，mg/L；V为吸附体系体积，L；M为吸附剂球霰石的添加量，g；R为药物包封率。Qe为吸附达到平衡时单位吸附剂球霰石吸附DOX的量，mg/g；Ce为吸附达到平衡时溶液中DOX的浓度，mg/L；Kf为Freundlich方程常数，mg/L；1/n为Freundlich吸附强度常数。

[0052] 表1生物源球状碳酸钙对DOX负载的Freundlich模型参数

[0053]

[0054] 由表1和图2，可以看出，本发明制备的药物载体具有较高的载药量和包封率，说明其表面吸附主要为多层表面吸附。

[0055] 此外，在药物浓度相同的条件下，本发明制备的球状碳酸钙添加量越高，其包封率和载药量明显降低，当添加按0.04g/30mL的吸附剂用量使用时，其负载量不到0.02g/30mL的吸附剂用量的一半，继续增加使用量会逐步降低，进一步证明本发明特定制备的球状碳酸钙的特殊性。

[0056] 实施例3

[0057] 生物源球状碳酸钙负载药物盐酸阿霉素的形貌结构特征：

[0058] 采用SEM‑EDS观察实施例2制备的球状碳酸钙负载DOX后的矿物复合体(即实施例2中收集得沉淀)表面粗糙，由于生物源球状碳酸钙表面呈现出的多孔结构吸附了大量的DOX(图3a)，且球状碳酸钙以其球形结构为基础在其表面附着DOX，同时球状碳酸钙中所含的有机质有助于球状碳酸钙对DOX的吸附(图3b‑d)。在球状碳酸钙矿物表面所富含的羟基、羧基等负电性有机官能团及介孔分布会吸附表面带正电的DOX，进而对DOX有卓越的载药能力。

[0059] 实施例4

[0060] 为了确保DOX药物己经装载在球状碳酸钙颗粒中，对实施例2制备的球状碳酸钙负载DOX沉淀干燥后获得的样品做了XRD、FTIR及TG‑DTG分析，来观察球状碳酸钙吸附DOX前后结构的变化。XRD分析结果表明，该矿物复合体颗粒保持了以球霰石型碳酸钙为主的晶型特征(图4a)，表明球状碳酸钙并未因装载了DOX而改变其晶型继而影响其稳定性。通过FTIR光谱分析(图4b)，可以明显观察到球霰石等碳酸钙的特征峰，同时该特征峰也同样出现在负载了DOX后的矿物复合体的红外光谱图中，此结果能够证明，抗生素在装载过程中依然能够保持稳定。综合上述结果可以推断球状碳酸钙已成功将DOX进行有效封装。

[0061] 实施例5

[0062] 生物源球球状碳酸钙作为药物载体在酸性条件下药物的释放特性：

[0063] 为了确认实验所制备的微米或纳米级尺寸的球状碳酸钙颗粒具有向肿瘤细胞(肿瘤细胞外pH值约为6)靶向递送药物的潜力，实验使用所制备的球状碳酸钙‑DOX矿物复合体颗粒(本发明实施例2中收集的沉淀并干燥)，在为期8天的时间内检测了在pH＝6的弱酸环境下的药物释放，如图5所示，在此环境下的药物释放显示出了延长型缓慢释放的行为，并且初始的药物释放量较低，在第6天即156h时，释放开始缓慢趋于平衡，主要原因是制备的球状碳酸钙‑DOX矿物复合体较稳定，耐酸性强，降低了BV的降解速率，使得DOX实现了缓慢释放。

[0064] 实施例6

[0065] 探究生物源球状碳酸钙与无机碳酸钙对盐酸阿霉素的载药量。

[0066] 按照上述实施例2中的方法将无机碳酸钙与生物球状碳酸钙(实施例1制备)分别负载盐酸阿霉素，并根据公式计算得两种药物载体对药物的载药量。无机碳酸钙对DOX的载药量为116mg/g，生物球状碳酸钙对DOX的载药量为447.579mg/g。其中，无机球霰石是引用的参考文献，具体制备方法参考Dou et al.,(2020)(Preparation of non‑spherical vaterite CaCO3 particles by flash nano precipitation technique for targeted and extended drug delivery)。

[0067] 此外，本发明中发现采用二次细菌处理后制备改良的液体培养基，最终利用贝莱斯芽孢杆菌诱导合成出球状碳酸钙有机复合体具有高效载药特性。而如果直接常规的化学方法，或者仅仅采用一次细菌处理，其负载性能明显不如本发明。

[0068] 对比例1

[0069] 蟹壳中碳酸钙的去除：在室温下取5g蟹壳粉(过60目筛)，用5mL 1.0mol/L的HCl溶液充分浸泡蟹壳，直至无气泡产生(约24h)，即可去除碳酸钙。过滤，保留滤液，滤渣用于下一步处理。

[0070] 蟹壳中蛋白质的去除：滤渣用去离子水洗涤、烘干。用50mL 2.0mol/L的NaOH处理滤渣，然后放置在水浴锅中，90℃反应4h，过滤去除碱液，再用去离子水洗涤滤渣，保留滤液。

[0071] 球状碳酸钙合成：合并上述两步得到滤液，加入去离子水定容到500mL，添加蛋白胨2.5g，酵母膏2.5g和NaCl 5g。按实施例1中的球状碳酸钙合成方法得到球状碳酸钙产物，再按实施例2的方法将得到产物负载盐酸阿霉素，其对DOX的载药量约为325mg/g。

[0072] 对比例2

[0073] 鼠李糖乳杆菌发酵培养基：去离子水为溶剂，葡萄糖100g/L，蟹壳粉50g/L，115℃灭菌30min。以体积比4％的细菌接种量接入活化后的乳杆菌发酵培养基(100/250mL)，置于37℃，100r/min发酵2d。把反应后的发酵液离心处理(8000rpm，15分钟)，保留滤液(滤液A2)和滤渣A2，向滤渣A中加入0.5mol/L的HCl溶液静置2h，添加量为每份蟹壳粉(5g)处理残渣添加5mL HCl溶液。此过程将去除未脱尽的碳酸钙，反应完成后，同上离心收集滤渣B2和酸性废液B2备用。

[0074] 碳酸钙合成：以初始5g蟹壳粉添加到鼠李糖乳杆菌发酵培养基为例，滤液A2和滤液B2混合后，添加去离子水定容到500mL，添加蛋白胨2.5g，酵母膏2.5g和NaCl 5g，调pH值至7.2左右，115℃灭菌30min。取活化好的贝莱斯芽孢杆菌种子液，以体积比2％的细菌接种，置于37℃，180r/min的摇床中震荡培养5d。培养结束后，将发酵液离心(8000r/min、15分钟)收集沉淀，去离子水洗涤后将收集获得的沉淀置于55℃的烘箱中烘干后研磨，无球状碳酸钙形成。再按实施例2的方法将得到产物负载盐酸阿霉素，其对DOX的载药量小于200mg/g。

[0075] 对比例3

[0076] 将蟹壳粉按50g/L加入到枯草芽孢杆菌发酵培养基(以去离子水为溶剂，可溶性淀粉9.37g/L，蛋白胨10.85g/L，酵母膏1.67g/L，硫酸锰0.07g/L，硫酸亚铁0.07g/L，硫酸镁0.07g/L，Tween‑20 0.07g/L，磷酸二氢钠3.61g/L，磷酸氢二钾0.63g/L)中，115℃灭菌
30min。接入体积比4％的枯草芽孢杆菌种子液，将培养基置于37℃，180r/min发酵2d。把反应后的发酵液离心处理(8000rpm，15分钟)，保留滤液(滤液C2)和滤渣C2。向滤渣C2中加入
1mol/L的NaOH溶液50mL，90℃水浴静置2h。此过程将去除未脱尽的蛋白质，反应完成后，同上离心收集滤渣D2和碱性废液D2备用。

[0077] 碳酸钙合成：以初始5g蟹壳粉添加到鼠李糖乳杆菌发酵培养基为例，滤液A2和滤液B2混合后，添加去离子水定容到500mL，添加蛋白胨2.5g，酵母膏2.5g和NaCl 5g，调pH值至7.2左右，115℃灭菌30min。取活化好的贝莱斯芽孢杆菌种子液，以体积比2％的细菌接种，置于37℃，180r/min的摇床中震荡培养5d。培养结束后，将发酵液离心(8000r/min、15分钟)收集沉淀，去离子水洗涤后将收集获得的沉淀置于55℃的烘箱中烘干后研磨，均为无定型碳酸钙生成。再按实施例2的方法将得到产物负载盐酸阿霉素，其对DOX的载药量小于150mg/g。

[0078] 上述实验说明本发明中两次细菌处理对后期合成生物球状碳酸钙负载盐酸阿霉素具有非常显著的影响，其效果明显优于化学处理或者单一的细菌处理，具有非常好的协同增效的效果，此外对比例1中采用的是高浓度的化学试剂处理，如采用低浓度的化学试剂处理(如实施例1)，其负载量会进一步降低。

[0079] 本发明制得的新型药物载体载药量大，稳定性高，可实现药物的缓慢释放，在作为药物载体方面具有广阔的应用前景。