技术领域
[0001] 本发明涉及新的血中滞留型药物载体。
相关背景技术
[0002] 近年来，聚肌胞等合成双链RNA和利用RNA干扰(RNAi)的短干扰RNA(short interfering RNA，siRNA)、微小RNA(microRNA，miRNA)、短发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)、反义DNA、反义RNA等核酸药物受到注目，进行着大量的研究。该核酸药物单独在人体内、即使例如从静脉进行全身给药也难以移行至患部组织，因此必须采用一定的办法来给药，例如使核酸药物包含于适当的载体后再给药或对患部组织进行局部给药等。
[0003] 作为用于使核酸药物移行至患部组织的药物载体，可以例举LIPOFECTIN(注册商标)、LIPOFECTAMINE 2000(注册商标)、OLIGOFECTAMINE(注册商标)等阳离子性脂质体，含有2-O-(2-二乙基氨基乙基)氨基甲酰基-1，3-O-二油酰基甘油(以下称为“化合物A”)和磷脂作为必需构成成分的阳离子性脂质体(以下称为“化合物A脂质体”)等(参照例如专利文献1)。并且，这些阳离子性脂质体存在例如从静脉进行全身给药时容易积聚于肝脏和脾脏的倾向，因此期待使核酸药物包含于其中作为肝癌或肝炎的治疗剂应用。实际上，例如有报道称化合物A脂质体和聚肌胞等合成双链RNA的复合物对于肝癌或肝炎的治疗有效(参照例如专利文献2、专利文献3、非专利文献1、非专利文献2)。
[0004] 然而，这些阳离子性脂质体作为用于使核酸药物积聚于肝脏等的载体有用，但并不足以作为滞留于血中并使核酸药物移行至肝脏和脾脏以外的组织(例如肺、肾脏、胰脏、心脏)的载体。
[0005] 有报道称，通过用聚乙二醇修饰构成脂质体的脂质，向网状内皮系统的摄取得到抑制，因此血中的滞留性提高(参照例如非专利文献3)。
[0006] 然而，将经聚乙二醇修饰的脂质用作脂质体的构成成分的情况下，由于该脂质的含量提高，因而所含药物的药效变得难以发挥，因此重要的是添加可赋予血中滞留性的最低限度的量(参照例如专利文献4)。
[0007] 有报道称，使用经聚乙二醇修饰的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺用作脂质体的构成成分的情况下，相对于构成脂质体的所有脂质掺入4摩尔％左右时血中滞留性延长得最多(参照例如非专利文献3)。
[0008] 另一方面，也有报道记载了掺入10或15摩尔％左右的经聚乙二醇修饰的脂质时血中滞留性延长的例子(参照专利文献5～9)。根据该专利文献5～9的记载，根据用作脂质体的构成成分的经聚乙二醇修饰的脂质或阳离子性脂质的结构的不同，所获得的血中滞留性的延长效果和所含药物的药效发挥程度有所不同。
[0009] 专利文献1：WO 94/19314A1
[0010] 专利文献2：WO 99/20283A1
[0011] 专利文献3：WO 99/48531A1
[0012] 专利文献4：WO 2005/051351A2
[0013] 专利文献5：WO 2006/074546A1
[0014] 专利文献6：WO 2006/007712A1
[0015] 专利文献7：WO 2005/120152A2
[0016] 专利文献8：CA 2271582A1
[0017] 专利文献9：US 2004/0166150A1
[0018] 非专利文献1：Kazuko Hirabayashi等，Cancer Reserch，1999，59卷，4325-4333页
[0019] 非专利文献2：Kazuko Hirabayashi等，Oncology Reserch，1999，11卷，497-504页
[0020] 非专利文献3：石田龙弘等，脂质体应用的新发展(リポソ一ム応用の新展開)，2005年6月，528-538页
[0021] 发明的揭示
[0022] 本发明的目的在于提供药物载体以及包含药物和该药物载体的医药组合物，所述药物载体是主要包含聚乙二醇修饰磷脂和化合物A的血中滞留型的药物载体，其特征在于在某一特定的浓度范围内包含该聚乙二醇修饰磷脂。
[0023] 本发明人反复认真研究后发现，包含具有某一特定结构的聚乙二醇修饰磷脂和化合物A作为必需构成成分的药物载体中，以相对于药物载体中的脂质的总重量为30～50重量％的高浓度添加聚乙二醇修饰磷脂的情况下，具有高血中滞留性，且在体内可发挥所含药物的药效，从而完成了本发明。
[0024] 作为本发明，可例举例如下述1和2中记载的发明。
[0025] 1.一种血中滞留型药物载体(以下称为“本发明载体”)，其特征在于，包含以下述通式(Ⅰ)表示的聚乙二醇修饰磷脂(以下简称“PEG修饰磷脂”)或其医药学上允许的盐：
[0026]
[0027] 和化合物A，且以所述通式(Ⅰ)表示的PEG修饰磷脂的含量相对于药物载体中的脂质的总重量在30～50重量％的范围内；式(Ⅰ)中，X表示以下的(Ⅱ)或(Ⅲ)，n表示30～150的整数，
[0028]
[0029] 式(Ⅱ)或(Ⅲ)中，R1表示碳数17～22的饱和直链脂肪酸残基。
[0030] 2.含有包含药物的本发明载体的医药组合物(以下称为“本发明组合物”)。
[0031] 作为R1涉及的碳数17～22的饱和直链脂肪酸残基，可例举例如硬脂酰基、花生四烯酰基、山萮酰基。其中，较好是碳数17～20的饱和直链脂肪酸残基，更好是硬脂酰基。
[0032] n为30～150的范围内的整数，较好是30～100的范围内的整数，更好是30～65的范围内的整数。
[0033] PEG修饰磷脂能够以游离的酸的形式直接使用，也可以通过公知的方法制成医学上允许的盐的形式后使用。
[0034] 作为该医学上允许的盐，无特别限定，可例举例如钠盐、钾盐。其中，特别好是钠盐。
[0035] 作为优选的PEG修饰磷脂，可例举例如1，3-二硬脂酰基甘油-2-磷脂酰-N-(甲氧基聚乙二醇琥珀酰)乙醇胺、N-(甲氧基聚乙二醇琥珀酰)二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺。
[0036] 附图的简单说明
[0037] 图1表示制造例3中合成的PEG修饰磷脂的质谱图。
[0038] 图2表示制造例12～15中使用的PEG修饰磷脂的质谱图。
[0039] 图3表示血浆中的滞留性的经时变化。纵轴表示分布率(剂量的百分比)，横轴表示给药后的时间(小时)。
[0040] 图4表示给药24小时后的血浆中的滞留性。纵轴表示分布率(剂量的百分比)，横轴表示使用的PEG修饰磷脂的含量(重量％)。
[0041] 图5表示给药24小时后的血浆中的滞留性。纵轴表示分布率(剂量的百分比)，横轴表示使用的PEG修饰磷脂的含量(重量％)。
[0042] 图6表示血浆中的滞留性。纵轴表示分布率(剂量的百分比)，横轴表示给与医药组合物后的时间(小时)。
[0043] 图7表示血浆中的滞留性。纵轴表示分布率(剂量的百分比)，横轴表示给与医药组合物后的时间(小时)。
[0044] 图8表示向肝脏的移行性。纵轴表示分布率(剂量的百分比)，横轴表示给与医药组合物后的时间(小时)。
[0045] 图9表示向脾脏的移行性。纵轴表示分布率(剂量的百分比)，横轴表示给与医药组合物后的时间(小时)。
[0046] 图10表示向肺的移行性。纵轴表示分布率(剂量的百分比)，横轴表示给与医药组合物后的时间(小时)。
[0047] 图11表示向肾脏的移行性。纵轴表示分布率(剂量的百分比)，横轴表示给与医药组合物后的时间(小时)。
[0048] 图12表示向癌周边部的移行性。纵轴表示药物载体的浓度(μg/g)，横轴表示给与医药组合物后的时间(小时)。
[0049] 图13表示向癌结节的移行性。纵轴表示药物载体的浓度(μg/g)，横轴表示给与医药组合物后的时间(小时)。
[0050] 图14表示向血浆的移行性。纵轴表示药物载体的浓度(μg/mL)，横轴表示给与医药组合物后的时间(小时)。
[0051] 图15表示抗肿瘤效果。纵轴表示肿瘤的体积(mm3)，横轴表示移植癌细胞后的时间(天)。
[0052] 图16表示连续给与本发明组合物时的抗肿瘤效果。纵轴表示存活率(％)，横轴表示移植癌细胞后的存活时间(天)。
[0053] 图17表示间断给与本发明组合物时的抗肿瘤效果。纵轴表示存活率(％)，横轴表示移植癌细胞后的存活时间(天)。
[0054] 图18表示抗肿瘤效果。纵轴表示存活率(％)，横轴表示移植癌细胞后的存活时间(天)。
[0055] 图19表示抗肿瘤效果。纵轴表示胰脏重量(g)。
[0056] 实施发明的最佳方式
[0057] Ⅰ.PEG修饰磷脂的制造方法
[0058] X为所述式(Ⅱ)的PEG修饰磷脂(Ⅰa)可以通过在适当的碱的存在下使以下述通式(1a)表示的胺衍生物与以下述通式(2)表示的PEG衍生物反应来制造。
[0059] 作为与以下述通式(2)表示的PEG衍生物反应时使用的溶剂，只要不参与反应即可，无特别限定，可例举例如二氯甲烷、二甲氧基乙烷或它们的混合液。作为碱，可例举例如三乙胺、吡啶或碳酸氢钠水溶液。反应温度较好是在0℃～50℃的范围内。此外，反应时间根据所用原料的种类、反应温度而不同，通常较好是在1～30小时的范围内。
[0060]
[0061] 式中，n、R1如前所述。
[0062] X为所述式(Ⅲ)的PEG修饰磷脂(Ⅰb)可以如下制造：通过常规方法将以下述2 3
通式(1b)表示的胺衍生物的氨基的保护基(R)、磷酸的保护基(R)脱保护后，在适当的碱的存在下使其与与以所述通式(2)表示的PEG衍生物反应。
[0063] R2、R3的脱保护可以两者同时进行或者分阶段进行。作为将R2脱保护的试剂，可例3
举例如三氟乙酸、乙酸、盐酸等酸。作为将R 脱保护的试剂，可例举例如吡啶-三乙胺-水
1 1 3 3
(3∶1∶1)的混合液、三乙胺的乙腈溶液、吡啶-2-甲醛肟与N，N，N，N-四甲基胍的
50％二 烷水溶液或者三氟乙酸、乙酸、盐酸等酸。
[0064] 作为与以所述通式(2)表示的PEG衍生物反应时使用的溶剂，只要不参与反应即可，无特别限定，可例举例如二氯甲烷、二甲氧基乙烷或它们的混合液。作为碱，可例举例如三乙胺、吡啶或碳酸氢钠水溶液。反应温度较好是在0℃～50℃的范围内。此外，反应时间根据所用原料的种类、反应温度而不同，通常较好是在1～30小时的范围内。
[0065]1 2
[0066] 式中，n、R 如前所述。R 表示氨基的保护基，作为该保护基，无特别限定，可例举3
例如叔丁氧基羰基、苄氧基羰基。R 表示磷酸的保护基，作为该保护基，无特别限定，可例举例如甲基、氰基乙基、叔丁基。
[0067] 以所述通式(1a)表示的胺衍生物可以使用以下述通式(3)表示的磷脂酰胆碱、以下述通式(4)表示的氨基乙醇和磷脂酶D按照文献记载的方法(J.Am.Chem.Soc.，1993年，115，10487-10491页)制造。
[0068]
[0069] 式中，R1如前所述。
[0070] 以所述通式(1b)表示的胺衍生物可以如下制造：使以下述通式(5)表示的亚磷酰胺(amidite)化合物在适当的活化剂的存在下与以下述通式(6)表示的氨基乙醇反应，再用适当的氧化剂氧化。
[0071] 作为活化剂，可例举例如四唑、5-苯基-1H-四唑。作为氧化剂，可例举例如碘溶液(0.1M碘/四氢呋喃∶吡啶∶水＝7∶1∶2)、过氧化氢叔丁基溶液。反应温度较好是在0℃～50℃的范围内。作为使用的溶剂，只要不参与反应即可，无特别限定，可例举例如乙腈、二氯甲烷。此外，反应时间根据所用原料的种类、反应温度而不同，通常较好是在1～30小时的范围内。
[0072]1 2 3 4
[0073] 式中，R、R、R 如前所述。R 表示烷基。作为该烷基，无特别限定，可例举例如甲基、乙基、正丙基、异丙基。
[0074] 以所述通式(5)表示的亚磷酰胺化合物可以通过在适当活化剂的存在下对以下述通式(7)表示的醇进行亚磷酰胺化来制造。
[0075] 作为活化剂，可例举例如二 异丙基铵四唑盐 (diisopropylammonium tetrazolide)、四唑、5-苯基-1H-四唑、二异丙基乙胺。作为亚磷酰胺化时使用的试剂，可例举例如双(N，N-二异丙基氨基)氰基乙基亚磷酸酯、2-氰基乙基-N，N-二异丙基氯代亚磷酰胺、叔丁基四异丙基亚磷酰胺(tert-butyl tetraisopropylphosphoroamidite)。作为使用的溶剂，只要不参与反应即可，无特别限定，可例举例如乙腈、二氯甲烷。反应温度较好是在0℃～50℃的范围内。此外，反应时间根据所用原料的种类、反应温度而不同，通常较好是在1～30小时的范围内。
[0076]
[0077] 式中，R1、R3、R4如前所述。
[0078] 以所述通式(7)表示的醇可以使用二羟丙酮的二聚体(8)按照文献记载的方法(例如，The Journal of Organic Chemistry，1970，35卷，2082-2083页)制造。作为缩合剂，可例举例如N，N’-二环己基碳二亚胺、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、1-羟基苯并三唑。作为还原剂，可例举例如硼氢化钠。
[0079]1
[0080] 式中，R 如前所述。
[0081] Ⅱ.本发明载体
[0082] 本发明载体以PEG修饰磷脂和化合物A为必需构成成分。具体来说，本发明载体可采用脂质体或脂肪乳剂等形态。作为脂质体的形态，可例举多层囊泡(multilamellar vesicle)、单层囊泡(unilamellar vesicle)。
[0083] 化合物A可以通过国际公开第94/19314号文本中记载的方法合成。
[0084] 本发明载体中的PEG修饰磷脂的掺入量相对于本发明载体中的脂质的总重量优选在30～50重量％的范围内，较好是在40～50重量％的范围内。
[0085] 本发明载体中的PEG修饰磷脂与化合物A的掺合比例为，相对于1重量份PEG修饰磷脂，化合物A优选在0.2～20重量份的范围内，较好是在0.5～10重量份的范围内，更好是在0.7～1.3重量份的范围内。
[0086] 除了作为必需构成成分的PEG修饰磷脂和化合物A以外，本发明载体中可以进一步加入磷脂。作为该磷脂，只要是医药学上允许的磷脂即可，无特别限定，可例举例如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、神经鞘磷脂、卵磷脂、二棕榈酰基磷脂酰胆碱、二硬脂酰基磷脂酰胆碱、二棕榈酰基磷脂酰甘油。这些磷脂可以使用一种或两种以上。其中，特别好是1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、磷脂酰胆碱、大豆卵磷脂。
[0087] 加入磷脂的情况下，本发明载体中的PEG修饰磷脂与磷脂的掺合比例为，相对于1重量份PEG修饰磷脂，磷脂优选在0.03～100重量份的范围内，较好是在0.05～20重量份的范围内，更好是在0.2～1.1重量份的范围内。
[0088] 除了作为必需构成成分的PEG修饰磷脂和化合物A以外，本发明载体中还可以添加胆固醇。加入胆固醇的情况下，本发明载体中的PEG修饰磷脂与胆固醇的掺合比例为，相对于1重量份PEG修饰磷脂，胆固醇优选在0.01～200重量份的范围内，较好是在0.02～100重量份的范围内。
[0089] 本发明载体的分散液例如可以如下制备：将PEG修饰磷脂和化合物A，或者PEG修饰磷脂、化合物A和磷脂，又或者PEG修饰磷脂、化合物A和胆固醇混合，通过常规方法使其在水溶液中分散。分散可适当采用超声波分散装置、乳化分散装置等装置。
[0090] Ⅲ.本发明组合物
[0091] 本发明组合物的包含药物的本发明载体的粒径无特别限定，例如优选在50～200nm的范围内，较好是在60～150nm的范围内。
[0092] 作为可用于本发明组合物的“药物”，可例举例如水溶性阴离子性化合物、抗肿瘤剂、抗病毒剂、抗生素。具体来说，可例举作为核酸化合物的单链或双链RNA、单链或双链DNA或低聚核酸，作为酸性糖的硫酸乙酰肝素和硫酸葡聚糖等，细胞因子类，cAMP、ATP和IP3等第二信使类，青霉素类和头孢菌素类，维生素C和视黄醇类等维生素类，以及干扰素(α、β、γ)、白细胞介素(IL-1、IL-2)、集落刺激因子(CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)、左旋咪唑、胃酶抑素(pestatin)、视黄酸、5-氟尿嘧啶(5-FU)、阿糖胞苷(Ara-C)、阿糖腺苷(Ara-A)、顺铂(CDDP)、环磷酰胺、叠氮胸苷(AZT)等其他具有酸性基团的已知的药物。
[0093] 作为合成双链RNA，可例举例如以下的药物。
[0094] 1.均聚物·均聚物复合物
[0095] 聚肌苷酸·聚胞苷酸、
[0096] 聚肌苷酸·聚(5-溴胞苷酸)、
[0097] 聚肌苷酸·聚(2-硫胞苷酸)、
[0098] 聚(7-脱氮肌苷酸)·聚胞苷酸、
[0099] 聚(7-脱氮肌苷酸)·聚(5-溴胞苷酸)、
[0100] 聚(2’-叠氮肌苷酸)·聚胞苷酸、
[0101] 聚肌苷酸·聚(胞苷-5’-硫代磷酸)。
[0102] 2.均聚物·共聚物复合物
[0103] 聚肌苷酸·聚(胞苷酸，尿苷酸)、
[0104] 聚肌苷酸·聚(胞苷酸，4-硫代尿苷酸)。
[0105] 3.合成核酸与聚阳离子的复合物
[0106] 聚肌苷酸·聚胞苷酸·聚-L-赖氨酸。
[0107] 4.其他
[0108] 聚肌苷酸·聚(1-乙烯基胞苷酸)。
[0109] 作为低聚核酸，可例举一分子内具有10～3000、较好是15～2000、更好是18～1000的范围内的核酸碱基的RNA、DNA及它们的化合物。例如，可例举siRNA、miRNA、shRNA、非编码RNA、反义DNA、反义RNA、DNA酶、核酶、适体。
[0110] 上述低聚核酸不限定于天然型，为了提高核酸酶耐受性等人体内的稳定性，可以对构成其核苷酸的糖或磷酸骨架等的至少一部分进行修饰。作为该修饰，可例举例如核糖的2’位的修饰、核糖的其他部分的修饰、磷酸骨架的修饰。作为核糖的2’位的修饰，可例举5 5 6 5 5 5 5
例如将核糖的2’位的羟基取代为H、OR、R、ROR、SH、SR、NH2、NHR、N(R)2、N3、CN、F、Cl、
5 6
Br、I的修饰。在这里，R 表示烷基或芳基。此外，R 表示亚烷基。
[0111] 作为R5的烷基，为直链状或分支链状，无特别限定，可例举例如碳数1～6的烷基。具体来说，可例举例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、叔戊基、正己基、异己基。该烷基可被取代，作为该取代基，可例举例如卤素、烷基、烷氧基、氰基、硝基，这些基团可取代有1～3个。作为该卤素，可例举氟、氯、溴、碘。作为该烷基，可例举与上述的烷基相同的基团。作为该烷氧基，为直链状或分支链状，无特别限定，可例举例如碳数1～6的烷氧基。具体来说，可例举甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、伸丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基、异戊氧基、正己氧基、异己氧基。其中，特别好是碳数1～3的烷氧基。
[0112] 作为R5的芳基，可例举例如碳数6～10的芳基。具体来说，可例举例如苯基、α-萘基、β-萘基。其中，特别好是苯基。
[0113] 作为R6的亚烷基，为直链状或分支链状，无特别限定，可例举例如碳数1～6的亚烷基。具体来说，可例举例如亚甲基、亚乙基、1，3-亚丙基、1，4-亚丁基、1，5-亚戊基、1，6-亚己基、2-乙基-1，3-亚甲基、1-甲基-1，4-亚丁基。
[0114] 作为核糖的其他部分的修饰，可例举例如使4’位硫代的修饰。作为磷酸骨架的修饰，可例举例如使其形成硫代磷酸酯体、二硫代磷酸酯体、烷基膦酸酯体或氨基磷酸酯体的修饰。
[0115] 本发明组合物中所含的本发明载体与药物的重量比(本发明载体/药物)根据药物的种类、本发明载体中的PEG修饰磷脂和化合物A的掺入量等而不同，优选在0.01～1000的范围内，较好是在10～300的范围内，更好是在100～200的范围内。另外，所含药物为低聚核酸的情况下，优选在0.01～100的范围内，较好是在1～50的范围内，更好是在5～30的范围内。
[0116] 除了上述的本发明载体和药物以外，本发明组合物中还可以任意地掺入医药学上允许的添加剂。作为该添加剂，可例举例如乳化助剂(例如碳数6～22的脂肪酸及其医药学上允许的盐、白蛋白、葡聚糖)、稳定剂(例如胆固醇、磷脂酸)、等渗剂(例如氯化钠、葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖)、pH调整剂(例如盐酸、硫酸、磷酸、乙酸、氢氧化钠、氢氧化钾、三乙醇胺)。这些添加剂可以使用一种或两种以上。
[0117] 本发明组合物可以通过在本发明载体的分散液中加入药物并适当搅拌来制备。此外，也可以在本发明载体的制造过程中添加药物来制备。上述的添加剂在分散前或分散后于适当的工序中添加。
[0118] 本发明组合物例如可以制成液剂或其冷冻干燥制剂。液剂的情况下，本发明组合物中所含的本发明载体的浓度优选在0.001～50w/v％的范围内，较好是在0.01～25w/v％的范围内，更好是在0.1～10w/v％的范围内。
[0119] 上述冷冻干燥制剂可以通过以常规方法对呈液剂形态的本发明组合物进行冷冻干燥处理来制备。例如，可以如下进行冷冻干燥：对呈液剂形态的本发明组合物进行适当的灭菌后，将规定量分注于管瓶中，以约-40～-20℃的条件进行约2小时左右的预冷冻，在约0～10℃于减压条件下进行一次干燥，再在约15～25℃于减压条件下进行二次干燥。接着，一般将管瓶内部以氮气置换并加塞，从而可获得本发明组合物的冷冻干燥制剂。
[0120] 本发明组合物的冷冻干燥制剂一般可以通过添加任意的适当的溶液(再溶解液)再溶解后使用。作为这样的再溶解液，可以例举注射用水、生理盐水和其他常规输注液。该再溶解液的液量根据用途等而不同，无特别限定，较好是冷冻干燥前的液量的0.5～2倍量或500mL以下。
[0121] 本发明组合物的适用疾病无特别限定，可例举例如癌症、病毒性疾病、炎症性疾病、代谢性疾病、神经疾病。
[0122] 本发明组合物的给药形态只要是医药学上允许的给药形态即可，无特别限定，可以根据治疗方法进行选择。例如，可例举静脉内给药、动脉内给药、口服给药、经肺给药、组织内给药、经皮肤给药、粘膜给药、直肠内给药、膀胱内给药、腹腔内给药、眼内给药、脑内给药、胸腔内给药。其中，特别好是静脉内给药、经皮肤给药、粘膜给药。此外，作为本发明组合物可采用的剂型，无特别限定，可例举例如各种注射剂、口服剂、点滴剂、吸入剂、滴眼剂、软膏剂、洗剂、栓剂。
[0123] 本发明组合物的作为药物的用量理想的是考虑药物的种类、剂型、年龄和体重等患者的状态、给药形态、疾病的性质和程度来调整，对于成人，以药物量计，一般在每天0.01mg～10g/人的范围内，较好是在每天0.1mg～5g/人的范围内。另外，本发明组合物所含的药物为低聚核酸的情况下，对于成人，以低聚核酸量计，一般在每天0.1mg～10g/人的范围内，较好是在每天1mg～5g/人的范围内。该数值有时也根据目标疾病的种类、给药形态、靶分子而不同。因此，有时在该范围以下足矣，或者有时反而需要该范围以上的用量。
此外，可以1天给药1次至数次，或者以1天至数天的间隔给药。
实施例
[0124] 以下，例举制造例、比较例和试验例，对本发明进行更详细的说明，但本发明并不局限于以下所示的范围内。
[0125] 制造例1 低聚RNA的合成
[0126] 具有序列编号1的碱基序列的低聚RNA、具有序列编号2的碱基序列的低聚RNA、具有序列编号3的碱基序列的低聚RNA和具有序列编号4的碱基序列的低聚RNA的合成使用核酸自动合成机(Expedite 8909：应用生物系统公司(Applied BioSystems，Inc.)制)通过文献(Nucleic Acid Research，1984，12卷，4539-4557页)中记载的亚磷酰胺法实施。
[0127] 使用浓氢氧化铵-乙醇(3/1)混合液使核酸自CPG断开，再在该溶液中使其于55℃反应18小时，从而对碱基部分的保护基进行脱保护。然后，使用1M氟化四丁基铵的四氢呋喃溶液，在室温下使其反应20小时，从而对2’位的硅烷基进行脱保护。用反相色谱法对所得的低聚RNA进行纯化。再用80％乙酸水溶液在室温下反应30分钟，从而对5’位的二甲氧基三苯甲基进行脱保护后，通过离子交换色谱法再次纯化。所得的具有序列编号
1的碱基序列的低聚RNA、具有序列编号2的碱基序列的低聚RNA、具有序列编号3的碱基序列的低聚RNA和具有序列编号4的碱基序列的低聚RNA的浓度依次分别为3.37mg/mL、
3.45mg/mL、10.00mg/mL、10.00mg/mL。
[0128] 还有，所得的低聚RNA通过毛细管电泳确认90％以上为全长物质。
[0129] 制造例2 以氚标记的低聚双链RNA的合成
[0130] 以氚标记的由具有序列编号1的碱基序列的低聚RNA和具有序列编号2的碱基序列的低聚RNA形成的低聚双链RNA通过使用体外转录T7试剂盒(invitro Transcription T7 Kit)(宝生物公司(Takara-Bio Co.，Ltd.)制)，掺入以氚标记的[25’8-3H]腺苷5’-三磷酸铵盐(安玛西亚生物科技公司(Amersham BioSciences，Inc.)制)来合成。
[0131] 然后，用苯酚/氯仿混合溶液除去蛋白质，再用G-25自旋柱(法玛西亚公司(Pharmacia，Inc.)制)除去未反应的单体。所得的低聚双链RNA的浓度为4.07mg/mL。此5
外，其比放射活性为5.3×10dpm/μg。
[0132] 还有，所得的低聚双链RNA通过15％聚丙烯酰胺电泳确认其链长为21个碱基对左右。
[0133] 制造例3 1，3-二硬脂酰基甘油-2-磷脂酰-N-(甲氧基聚乙二醇琥珀酰)乙醇胺的合成
[0134] 工序1 1，3-二硬脂酰基甘油的合成
[0135] 将3.0g二羟丙酮的二聚体、22.7g硬脂酸、16.8g 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、10.8g 4-二甲基氨基吡啶在100mL二氯甲烷中于室温搅拌一晚。向反应液中加入0.5L甲醇，滤取所生成的粉末，再用甲醇清洗后干燥。将6g该粉末悬浮于400mL四氢呋喃和20mL 10％乙酸水溶液的混合液中，在0℃逐次少量加入1.1g硼氢化钠。
在室温下搅拌6小时后，将反应液导入饱和碳酸氢钠水溶液，用乙酸乙酯进行萃取操作，干燥有机层后减压浓缩。将残渣用硅胶柱色谱法纯化，获得3.5g目标物。
[0136] 工序2 二异丙基胺四唑盐的合成
[0137] 将365mg的四唑溶解于8mL乙腈，滴加1.20g二异丙基胺。在室温下搅拌20分钟后，在减压条件下浓缩反应液，干燥而获得852mg目标物。
[0138] 工序3 1，3-二硬脂酰基甘油-2-O-(2-氰基乙基-N，N-二异丙基亚磷酰胺)的合成
[0139] 将1.39g上述工序1中得到的1，3-二硬脂酰基甘油悬浮于30mL乙腈和10mL二氯甲烷的混合液中，加入456mg上述工序2中得到的二异丙基胺四唑盐、1g双(N，N-二异丙基胺)氰基乙基亚磷酸盐，在40℃搅拌1.5小时。过滤反应液，浓缩滤液后用硅胶柱色谱法纯化残渣，获得800mg目标物。
[0140] 31P NMR(202MHz，CDCl3，δ)：152.283
[0141] 工序4 1，3-二硬脂酰基甘油-2-O-(2-氰基乙基-2-叔丁氧基羰基氨基乙基磷酸)的合成
[0142] 将700mg上述工序3中得到的1，3-二硬脂酰基甘油-2-O-(2-氰基乙基-N，N-二异丙基亚磷酰胺)、114mg N-(2-羟基乙基)氨基甲酸叔丁酯、119mg四唑与0.5g分子筛4A一起溶解于5mL乙腈和5mL二氯甲烷的混合液中，在室温下搅拌30分钟。向反应液中加入20mL的碘溶液(0.1M碘/四氢呋喃∶吡啶∶水＝7∶1∶2)，再在室温下搅拌20分钟。过滤反应液，向滤液中加入饱和硫代硫酸钠水溶液至碘的颜色消失后，用乙酸乙酯进行萃取操作。干燥有机层后，减压浓缩。将残渣用硅胶柱色谱法纯化，获得700mg目标物。
[0143] 31P NMR(202MHz，CDCl3，δ)：0.12453
[0144] MALDI-TOF质谱(m/z)＝923.564([M+Na]+)
[0145] 工序5 1，3-二硬脂酰基甘油-2-O-(2-氨基乙基磷酸)的合成
[0146] 向660mg上述工序4中得到的1，3-二硬脂酰基甘油-2-O-(2-氰基乙基-2-叔丁氧基羰基氨基乙基磷酸)中加入15mL吡啶-三乙胺-水(3∶1∶1)的混合液，在室温下搅拌2小时。将反应液在减压条件下浓缩后，用吡啶共沸3次。然后，再用二氯甲烷共沸3次。将残渣溶解于5mL二氯甲烷，在0℃加入5mL三氟乙酸，在室温下搅拌30分钟。将反应液在减压条件下浓缩后，用二氯甲烷共沸3次，获得目标物410mg。
[0147] 31P NMR(202MHz，CDCl3，δ)：-0.0833
[0148] 工序6 1，3-二硬脂酰基甘油-2-磷脂酰-N-(甲氧基聚乙二醇琥珀酰)乙醇胺的合成
[0149] 向400mg上述工序5中得到的1，3-二硬脂酰基甘油-2-O-(2-氨基乙基磷酸)、1.24g α-琥珀酰亚胺基氧基琥珀酰-ω-甲氧基-聚氧乙烯[SUNBRIGHT(注册商标)ME-020CS：日本油脂株式会社(日本油脂社)制]中加入40mL二甲氧基乙烷、40mL二氯甲烷、10mL饱和碳酸氢钠水溶液，在室温下搅拌一晚。向反应液中加水后用二氯甲烷进行3次萃取操作。干燥有机层后，减压浓缩。将残渣用硅胶柱色谱法纯化，获得950mg目标物。
[0150] 通过采用电喷雾离子化法的质谱仪测定了所得的目标物的分子量，结果如图1所示，所得的目标物在分子量2000～3800的范围内存在分布。
[0151] 制造例4 药物载体的分散液的制备
[0152] 将60mg化合物A、8mg制造例3中合成的PEG修饰磷脂和92mg 1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(日本油脂株式会社制，下同)在管瓶中溶解于2mL氯仿，向其中通入氮气，除去氯仿，在管瓶的壁面形成薄膜。将其进一步在减压条件下放置一晚后，加入1000mg麦芽糖(大塚制药株式会社(大塚製薬社)制)、4.0mL注射用水(大塚制药株式会社，下同)和81μL 1N盐酸，以漩涡搅拌器使薄膜分散。在4℃放置3小时后，用微探针进行10分钟的超声波处理，制成32mg/mL的药物载体的分散液。然后，用注射用水定容至5.0mL。
[0153] 制造例5 药物载体的分散液的制备
[0154] 使用60mg化合物A、16mg制造例3中合成的PEG修饰磷脂和84mg 1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱，与制造例4同样地制成药物载体的分散液。
[0155] 制造例6 药物载体的分散液的制备
[0156] 使用60mg化合物A、32mg制造例3中合成的PEG修饰磷脂和68mg 1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱，与制造例4同样地制成药物载体的分散液。
[0157] 制造例7 药物载体的分散液的制备
[0158] 使用60mg化合物A、48mg制造例3中合成的PEG修饰磷脂和52mg 1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱，与制造例4同样地制成药物载体的分散液。
[0159] 制造例8 药物载体的分散液的制备
[0160] 使用60mg化合物A、64mg制造例3中合成的PEG修饰磷脂和36mg 1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱，与制造例4同样地制成药物载体的分散液。
[0161] 制造例9 药物载体的分散液的制备
[0162] 使用60mg化合物A、80mg制造例3中合成的PEG修饰磷脂和20mg 1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱，与制造例4同样地制成药物载体的分散液。
[0163] 制造例10 药物载体的分散液的制备
[0164] 使用60mg化合物A、88mg制造例3中合成的PEG修饰磷脂和12mg 1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱，与制造例4同样地制成药物载体的分散液。
[0165] 制造例11 药物载体的分散液的制备
[0166] 使用60mg化合物A和100mg制造例3中合成的PEG修饰磷脂，与制造例4同样地制成药物载体的分散液。
[0167] 制造例12 药物载体的分散液的制备
[0168] 使用60mg化合物A、32mg N-(甲氧基聚乙二醇琥珀酰)二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺[SUNBRIGHT(注册商标)DSPE-020C：日本油脂株式会社制，下同](以下称为“化合物B”)和20mg 1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱，与制造例4同样地制成药物载体的分散液。
[0169] 还有，通过采用电喷雾离子化法的质谱仪测定了所用的化合物B的分子量，结果如图2所示，所用的化合物B在分子量2200～3600的范围内存在分布。
[0170] 制造例13 药物载体的分散液的制备
[0171] 使用60mg化合物A、48mg化合物B和52mg 1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱，与制造例4同样地制成药物载体的分散液。
[0172] 制造例14 药物载体的分散液的制备
[0173] 使用60mg化合物A、80mg化合物B和20mg 1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱，与制造例4同样地制成药物载体的分散液。
[0174] 制造例15 药物载体的分散液的制备
[0175] 使用60mg化合物A、88mg化合物B和12mg 1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱，与制造例4同样地制成药物载体的分散液。
[0176] 制造例16 药物载体的分散液的制备
[0177] 使用60mg化合物A、80mg制造例3中合成的PEG修饰磷脂和20mg卵黄卵磷脂(QP公司(QP Corporation)制，下同)，与制造例4同样地制成药物载体的分散液。
[0178] 制造例17 医药组合物的制备
[0179] (1)核酸溶液的制备
[0180] 将36μL制造例2中合成的以氚标记的低聚双链RNA、1.50mL制造例1中合成的具有序列编号1的碱基序列的低聚RNA、1.43mL制造例1中合成的具有序列编号2的碱基序列的低聚RNA和2.07mL注射用水混合，制成核酸溶液。
[0181] (2)医药组合物的制备
[0182] 向所有的上述(1)中制备的核酸溶液中添加5mL制造例4中制成的药物载体的分散液，进行5分钟的超声波处理。以5000rpm进行20分钟的离心分离后，用0.22μm的滤器进行过滤，从而制成1.0mg/mL的医药组合物。
[0183] (3)药物载体的平均粒径的测定
[0184] 医药组合物中的药物载体的平均粒径(体积平均)在用注射用水将上述(2)中制成的本发明组合物稀释至0.02mg/mL后测定。具体来说，使用粒径测定装置[Nicomp C380(注册商标)：粒径测定系统公司(Particle Sizing Systems，Inc.)制，下同]，折射率设为0.993，粘度设为1.333，测定时间设为5分钟，进行3次测定。其结果是，医药组合物中的药物载体的平均粒径为102.7nm。
[0185] 制造例18 医药组合物的制备
[0186] (1)核酸溶液的制备
[0187] 与制造例17的(1)同样地进行操作，制成核酸溶液。
[0188] (2)医药组合物的制备
[0189] 使用所有的上述(1)中制备的核酸溶液和5mL制造例5中制成的药物载体的分散液，与制造例17的(2)同样地制成1.0mg/mL的医药组合物。
[0190] 还有，医药组合物中的药物载体的平均粒径通过与制造例17的(3)同样的方法测定，结果为104.0nm。
[0191] 制造例19 医药组合物的制备
[0192] (1)核酸溶液的制备
[0193] 与制造例17的(1)同样地进行操作，制成核酸溶液。
[0194] (2)医药组合物的制备
[0195] 使用所有的上述(1)中制备的核酸溶液和5mL制造例6中制成的药物载体的分散液，与制造例17的(2)同样地制成1.0mg/mL的医药组合物。
[0196] 还有，医药组合物中的药物载体的平均粒径通过与制造例17的(3)同样的方法测定，结果为103.4nm。
[0197] 制造例20 医药组合物的制备
[0198] (1)核酸溶液的制备
[0199] 与制造例17的(1)同样地进行操作，制成核酸溶液。
[0200] (2)医药组合物的制备
[0201] 使用所有的上述(1)中制备的核酸溶液和5mL制造例7中制成的药物载体的分散液，与制造例17的(2)同样地制成1.0mg/mL的医药组合物。
[0202] 还有，医药组合物中的药物载体的平均粒径通过与制造例17的(3)同样的方法测定，结果为102.5nm。
[0203] 制造例21 医药组合物的制备
[0204] (1)核酸溶液的制备
[0205] 与制造例17的(1)同样地进行操作，制成核酸溶液。
[0206] (2)医药组合物的制备
[0207] 使用所有的上述(1)中制备的核酸溶液和5mL制造例8中制成的药物载体的分散液，与制造例17的(2)同样地制成1.0mg/mL的医药组合物。
[0208] 还有，医药组合物中的药物载体的平均粒径通过与制造例17的(3)同样的方法测定，结果为97.9nm。
[0209] 制造例22 医药组合物的制备
[0210] (1)核酸溶液的制备
[0211] 与制造例17的(1)同样地进行操作，制成核酸溶液。
[0212] (2)医药组合物的制备
[0213] 使用所有的上述(1)中制备的核酸溶液和5mL制造例9中制成的药物载体的分散液，与制造例17的(2)同样地制成1.0mg/mL的医药组合物。
[0214] 还有，医药组合物中的药物载体的平均粒径通过与制造例17的(3)同样的方法测定，结果为91.6nm。
[0215] 制造例23 医药组合物的制备
[0216] (1)核酸溶液的制备
[0217] 与制造例17的(1)同样地进行操作，制成核酸溶液。
[0218] (2)医药组合物的制备
[0219] 使用所有的上述(1)中制备的核酸溶液和5mL制造例10中制成的药物载体的分散液，与制造例17的(2)同样地制成1.0mg/mL的医药组合物。
[0220] 还有，医药组合物中的药物载体的平均粒径通过与制造例17的(3)同样的方法测定，结果为65.1nm。
[0221] 制造例24 医药组合物的制备
[0222] (1)核酸溶液的制备
[0223] 与制造例17的(1)同样地进行操作，制成核酸溶液。
[0224] (2)医药组合物的制备
[0225] 使用所有的上述(1)中制备的核酸溶液和5mL制造例11中制成的药物载体的分散液，与制造例17的(2)同样地制成1.0mg/mL的医药组合物。
[0226] 还有，医药组合物中的药物载体的平均粒径通过与制造例17的(3)同样的方法测定，结果为63.5nm。
[0227] 制造例25 医药组合物的制备
[0228] (1)核酸溶液的制备
[0229] 与制造例17的(1)同样地进行操作，制成核酸溶液。
[0230] (2)医药组合物的制备
[0231] 使用所有的上述(1)中制备的核酸溶液和5mL制造例12中制成的药物载体的分散液，与制造例17的(2)同样地制成1.0mg/mL的医药组合物。
[0232] 还有，医药组合物中的药物载体的平均粒径通过与制造例17的(3)同样的方法测定，结果为97.3nm。
[0233] 制造例26 医药组合物的制备
[0234] (1)核酸溶液的制备
[0235] 与制造例17的(1)同样地进行操作，制成核酸溶液。
[0236] (2)医药组合物的制备
[0237] 使用所有的上述(1)中制备的核酸溶液和5mL制造例13中制成的药物载体的分散液，与制造例17的(2)同样地制成1.0mg/mL的医药组合物。
[0238] 还有，医药组合物中的药物载体的平均粒径通过与制造例17的(3)同样的方法测定，结果为97.7nm。
[0239] 制造例27 医药组合物的制备
[0240] (1)核酸溶液的制备
[0241] 与制造例17的(1)同样地进行操作，制成核酸溶液。
[0242] (2)医药组合物的制备
[0243] 使用所有的上述(1)中制备的核酸溶液和5mL制造例14中制成的药物载体的分散液，与制造例17的(2)同样地制成1.0mg/mL的医药组合物。
[0244] 还有，医药组合物中的药物载体的平均粒径通过与制造例17的(3)同样的方法测定，结果为98.0nm。
[0245] 制造例28 医药组合物的制备
[0246] (1)核酸溶液的制备
[0247] 与制造例17的(1)同样地进行操作，制成核酸溶液。
[0248] (2)医药组合物的制备
[0249] 使用所有的上述(1)中制备的核酸溶液和5mL制造例15中制成的药物载体的分散液，与制造例17的(2)同样地制成1.0mg/mL的医药组合物。
[0250] 还有，医药组合物中的药物载体的平均粒径通过与制造例17的(3)同样的方法测定，结果为78.2nm。
[0251] 制造例29 医药组合物的制备
[0252] (1)核酸溶液的制备
[0253] 与制造例17的(1)同样地进行操作，制成核酸溶液。
[0254] (2)医药组合物的制备
[0255] 使用所有的上述(1)中制备的核酸溶液和5mL制造例16中制成的药物载体的分散液，与制造例17的(2)同样地制成1.0mg/mL的医药组合物。
[0256] 还有，医药组合物中的药物载体的平均粒径通过与制造例17的(3)同样的方法测定，结果为92.7nm。
[0257] 制造例30 医药组合物的制备
[0258] (1)核酸溶液的制备
[0259] 与制造例17的(1)同样地进行操作，制成核酸溶液。
[0260] (2)医药组合物的制备
[0261] 使用所有的上述(1)中制备的核酸溶液和5mL制造例9中制成的药物载体的分散液，与制造例17的(2)同样地制成1.0mg/mL的医药组合物。
[0262] 还有，医药组合物中的药物载体的平均粒径通过与制造例17的(3)同样的方法测定，结果为84.9nm。
[0263] 制造例31 医药组合物的制备
[0264] (1)核酸溶液的制备
[0265] 将0.50mL制造例1中合成的具有序列编号3的碱基序列的低聚RNA、0.50mL制造例1中合成的具有序列编号4的碱基序列的低聚RNA和4.0mL注射用水混合，制成核酸溶液。
[0266] (2)本发明组合物的制备
[0267] 使用所有的上述(1)中制备的核酸溶液和5.0mL制造例9中制成的药物载体的分散液，与制造例17的(2)同样地制成1.0mg/mL的医药组合物。
[0268] 还有，医药组合物中的药物载体的平均粒径通过与制造例17的(3)同样的方法测定，结果为95.7nm。
[0269] 此外，由具有序列编号3的碱基序列的低聚RNA和具有序列编号4的碱基序列的低聚RNA形成的低聚双链RNA为具有Bcl-2的表达抑制活性的低聚双链RNA(参照国际公开第2004/106511号文本)。
[0270] 比较例1 比较对照用药物载体的分散液的制备
[0271] 使用60mg化合物A和100mg卵黄卵磷脂，与制造例4同样地制成比较对照用药物载体的分散液。
[0272] 比较例2 比较对照用药物载体的分散液的制备
[0273] 使用LIPOFECTIN(注册商标)(英杰公司(Invitrogen，Inc.)制)，按照提供公司指定的制备方法制成比较对照用药物载体的分散液。
[0274] 比较例3 比较对照用药物载体的分散液的制备
[0275] 使用OLIGOFECTAMINE(注册商标)(英杰公司制)，按照提供公司指定的制备方法制成比较对照用药物载体的分散液。
[0276] 比较例4 比较对照用医药组合物的制备
[0277] (1)核酸溶液的制备
[0278] 与制造例17的(1)同样地进行操作，制成核酸溶液。
[0279] (2)比较对照用组合物的制备
[0280] 使用所有的上述(1)中制备的核酸溶液和5.0mL比较例1中制成的药物载体的分散液，与制造例17的(2)同样地制成1.0mg/mL的比较对照用医药组合物。
[0281] 还有，比较对照用医药组合物中的药物载体的平均粒径通过与制造例17的(3)同样的方法测定，结果为148.1nm。
[0282] 比较例5 比较对照用医药组合物的制备
[0283] (1)核酸溶液的制备
[0284] 与制造例17的(1)同样地进行操作，制成核酸溶液。
[0285] (2)比较对照用组合物的制备
[0286] 使用所有的上述(1)中制备的核酸溶液和5.0mL比较例1中制成的药物载体的分散液，与制造例17的(2)同样地制成1.0mg/mL的比较对照用医药组合物。
[0287] 还有，比较对照用医药组合物中的药物载体的平均粒径通过与制造例17的(3)同样的方法测定，结果为168.9nm。
[0288] 比较例6 比较对照用医药组合物的制备
[0289] (1)核酸溶液的制备
[0290] 与制造例31的(1)同样地进行操作，制成核酸溶液。
[0291] (2)比较对照用组合物的制备
[0292] 使用所有的上述(1)中制备的核酸溶液和5.0mL比较例1中制成的药物载体的分散液，与制造例31的(2)同样地制成1.0mg/mL的比较对照用医药组合物。
[0293] 还有，比较对照用医药组合物中的药物载体的平均粒径通过与制造例31的(3)同样的方法测定，结果为138.6nm。
[0294] 试验例1 血中滞留性的评价
[0295] 以药物载体所含的核酸的放射活性为指标评价了制造例3中合成的含PEG修饰磷脂的药物载体的血中滞留性。
[0296] (1)实验方法
[0297] 将制造例17～24中制成的医药组合物以2.5mg/kg(核酸浓度)对雄性小鼠(C57BL/6J，6周龄，日本科雷亚株式会社(日本クレア社)制)进行尾静脉内给药。自给药起2小时、8小时和24小时后，对小鼠在氨氟醚麻醉下从腹部大动脉采集全血，获得血浆。作为用于获得血浆的抗凝剂，采用肝素。给药用量均以10mL/kg实施。每1组使用了4只小鼠。
[0298] 向50μL的血浆中加入10mL闪烁照相试剂(Hionic-Fluor：珀金埃尔默公司(PerkinElmer，Inc.)制，下同)混合后，用液体闪烁计数器测定了各试样的放射活性。根据结果算出药物载体的分布率(剂量的百分比)。
[0299] (2)实验结果
[0300] 如图3和图4所示，制造例3的PEG修饰磷脂的含量在30～50重量％的范围内的情况下，血中的滞留性最高。
[0301] 试验例2 血中滞留性的评价
[0302] 以药物载体所含的核酸的放射活性为指标评价了含化合物B的药物载体的血中滞留性。
[0303] (1)实验方法
[0304] 将制造例25～28中制成的医药组合物以2.5mg/kg(核酸浓度)对雄性小鼠(C57BL/6J，6周龄，日本科雷亚株式会社制)进行尾静脉内给药。自给药起24小时后，对小鼠在氨氟醚麻醉下从腹部大动脉采集全血，获得血浆。作为用于获得血浆的抗凝剂，采用肝素。给药用量均以10mL/kg实施。每1组使用了4只小鼠。
[0305] 向50μL的血浆中加入10mL闪烁照相试剂混合后，用液体闪烁计数器测定了各试样的放射活性。根据结果算出药物载体的分布率(剂量的百分比)。
[0306] (2)实验结果
[0307] 如图5所示，化合物B的含量在30重量％以上的情况下血中的滞留性高。
[0308] 试验例3 本发明载体的体内动态的评价
[0309] 以药物载体所含的核酸的放射活性为指标评价了本发明载体的体内动态。
[0310] (1)实验方法
[0311] 将制造例29或比较例4中制成的医药组合物以2.5mg/kg(核酸浓度)对雄性小鼠(C57BL/6J，6周龄，日本科雷亚株式会社制)进行尾静脉内给药。在给药后5分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、8小时、24小时、48小时和72小时的时间点，对小鼠在氨氟醚麻醉下从腹部大动脉采集全血，获得血浆。作为用于获得血浆的抗凝剂，采用肝素。给药用量均以10mL/kg实施。每1组使用了3或4只小鼠。
[0312] 向50μL的血浆中分别加入10mL闪烁照相试剂混合后，用液体闪烁计数器测定了各试样的放射活性。根据结果，算出血浆中的药物载体的分布率(剂量的百分比)和分布容积(L/kg)、消失半衰期(小时)、血浆中浓度下面积(μg·h/mL)、清除率(L/h·kg)。
[0313] (2)实验结果
[0314] (i)血浆中浓度
[0315] 如图6所示，制造例29的本发明组合物中的本发明载体的血浆中的滞留性比比较例4的比较对照用医药组合物中的比较对照用药物载体高。
[0316] (ii)药物动力学参数值
[0317] 如表1所示，制造例29的本发明组合物中的本发明载体的血浆中浓度下面积(AUC0-8)与比较例4的比较对照用医药组合物中的比较对照用药物载体的血浆中浓度下面积(AUC0-8)相比，高约5倍。此外，本发明载体的分布容积为比较对照用药物载体的分布容积的约1/8。
[0318] [表1]
[0319]
[0320] 试验例4 本发明载体的体内动态的评价
[0321] 以药物载体所含的核酸的放射活性为指标评价了本发明载体的体内动态。
[0322] (1)实验方法
[0323] 将制造例29或比较例4中制成的医药组合物以2.5mg/kg(核酸浓度)对雄性小鼠(C57BL/6J，6周龄，日本科雷亚株式会社制)进行尾静脉内给药。在给药后30分钟、2小时、8小时和24小时的时间点，对小鼠在氨氟醚麻醉下从腹部大动脉采集全血，获得血浆。作为用于获得血浆的抗凝剂，采用肝素。此外，在采血的同时摘出肝脏、肺、脾脏和肾脏，称量各自的湿重。给药用量均以10mL/kg实施。每1组使用了3或4只小鼠。
[0324] 各脏器通过在管瓶中加入1mL组织裂解剂(SOLVABLE：珀金埃尔默公司制)，在40℃振荡两晚来使其裂解。
[0325] 向50～200mg使各脏器裂解而得的试样中分别加入10mL闪烁照相试剂混合后，用液体闪烁计数器，测定各试样的放射活性。根据结果算出各脏器中的药物载体的分布率(剂量的百分比)。还有，血浆中的药物载体的分布率(剂量的百分比)与试验例1同样地算出。
[0326] (2)实验结果
[0327] 如图7所示，血浆中的制造例29的本发明组合物中的本发明载体的分布率比比较例4的比较对照用医药组合物中的比较对照用药物载体高。如图8、9所示，肝脏和脾脏中的制造例29的本发明组合物中的本发明载体的分布率比比较例4的比较对照用医药组合物中的比较对照用药物载体低。如图10、11所示，肺和肾脏中的分布率在制造例29和比较例4的医药组合物的药物载体之间没有差异。
[0328] 试验例5 癌细胞移植小鼠的本发明载体的体内动态的评价
[0329] 以药物载体所含的核酸的放射活性为指标评价了癌细胞移植小鼠的本发明载体的体内动态。
[0330] (1)癌细胞移植小鼠的制备
[0331] 癌细胞移植小鼠如下制备：将1×106个细胞的A431细胞(人鳞状上皮细胞)移植至雄性裸鼠(BALB/cA Jcl-nu，9周龄，日本科雷亚株式会社制)的皮下，移植后饲养9天。
[0332] (2)实验方法
[0333] 将制造例30或比较例5中制成的医药组合物以10mg/kg(核酸浓度)对上述(1)中制成的小鼠进行尾静脉内给药。在给药后8小时、24小时和72小时的时间点，对小鼠在氨氟醚麻醉下从腹部大动脉采集全血，获得血浆。作为用于获得血浆的抗凝剂，采用肝素。此外，在采血的同时摘出癌周边部、癌结节，称量各自的湿重。给药用量均以10mL/kg实施。
每1组使用了3只小鼠。
[0334] 癌周边部、癌结节和血浆中的药物载体的移行量(μg/g或μg/mL)与试验例1或4同样地测定。
[0335] (3)实验结果
[0336] 如图12所示，癌周边部的制造例30的本发明组合物中的本发明载体的移行量比比较例5的比较对照用医药组合物中的比较对照用药物载体高。另一方面，如图13所示，癌结节中的分布率在制造例30和比较例5的医药组合物的药物载体之间没有差异。还有，如图14所示，血浆中的制造例30的本发明组合物中的本发明载体的分布率比比较例5的比较对照用医药组合物中的比较对照用药物载体高。
[0337] 试验例6 本发明载体的溶血性的评价
[0338] (1)实验方法
[0339] 将从雄性大鼠(Slc：SD，7周龄，日本SLC株式会社(日本エスエルシ一社)制)采集的血液以3000rpm离心分离10分钟后，除去上层，获得红细胞悬浮液。对于所得的红细胞悬浮液加入2倍量的注射用生理盐水(大塚制药工场株式会社(大塚製薬工埸社)制，下同)混合后，以3000rpm离心分离5分钟。再重复该操作2次。所得的红细胞悬浮液用9
注射用生理盐水稀释至1×10 个细胞/mL。
[0340] 将制造例16或比较例1～3中制成的药物载体的分散液用10％麦芽糖稀释至0.3μg/μL～30mg/μL的范围内的所需浓度。将285μL经稀释的药物载体的分散液在
37℃预加温10分钟后，加入15μL红细胞悬浮液混合，在37℃孵育30分钟。将反应液以
3000rpm离心分离3分钟，回收上清。测定405nm时的上清的吸光度。
[0341] 溶血度以未加药物载体时的吸光度为溶血度0％、加入0.02％TritonX100时的吸光度为溶血度100％来计算。此外，根据算出的溶血度计算50％溶血浓度。
[0342] (2)实验结果
[0343] 如表2所示，制造例16的本发明载体的50％溶血浓度比比较例1～3的比较对照用药物载体的50％溶血浓度高。
[0344] [表2]
[0345]
[0346] 试验例7 本发明载体的细胞毒性的评价
[0347] (1)实验方法
[0348] 将人脐静脉内皮细胞(三光纯药株式会社(三光純薬社)制)以3000个细胞/孔接种于96孔板，培养一晚。将制造例16或比较例1～3中制成的药物载体的分散液用10％麦芽糖稀释至3μg/μL～10mg/μL的范围内的所需浓度。添加培养基的1/10容量的经稀释的药物载体的分散液。培养72小时后，使用细胞计数试剂盒-8(Cell Counting Kit-8)(WST-8：株式会社同仁化学研究所(同仁化学社)制)测定存活细胞数，根据该值算出50％细胞增殖抑制浓度。还有，人脐静脉内皮细胞的培养使用M199培养基(日水制药株式会社(ニツスイ社)制)。
[0349] (2)实验结果
[0350] 如表3所示，制造例16的本发明载体的50％细胞增殖抑制浓度比比较例1～3的比较对照用药物载体的50％细胞增殖抑制浓度高。
[0351] [表3]
[0352]
[0353] 试验例8 本发明组合物的细胞因子诱导能力的评价
[0354] (1)实验方法
[0355] 采集人新鲜血液，为了防止凝固而每10mL血液混合1mL肝素钠(味之素株式会社(味の素社)制)。加入等量的磷酸缓冲液(以下称为“PBS”)，使每3mL Ficoll-Paque PLUS(GE保健生物科技公司(GEヘルスケア バイオサイエンス社)制)为10mL的血液稳定地分层而保持界面不乱。以400×g、室温的条件离心30分钟，获得外周血单核细胞。将所得的外周血单核细胞用PBS清洗2次。然后，使外周血单核细胞悬浮于含10％胎牛血清(JRH生物科学公司(JRH BioSciences，Inc.)制)、100U/mL青霉素(纳卡莱泰思科公司(Nacalai Tesque，Inc.)制)、100μg/mL链霉素(纳卡莱泰思科公司制)的RPMI 1640培养基(日水制药株式会社制)，测定细胞数，制成2×106个细胞/mL的细胞悬浮液。
[0356] 将制成的细胞悬浮液以300μL(6×105个细胞)/孔接种于48孔板，在37℃、5％CO2的条件下培养3小时后，将制造例17～24、制造例31或比较例6中制成的医药组合物以所需的浓度(制造例17～24：100nM，制造例31、比较例6：30、100、300nM)添加至培养基中。添加医药组合物后培养24小时，然后回收培养上清，进行ELISA。IFN-α的测定使用人干扰素-α ELISA试剂盒(生物源公司(Biosource，Inc.)制)按照附带的实验方案进行。
[0357] (2)实验结果
[0358] 如表4所示，制造例17～19的医药组合物的IFN-α的诱导能力比制造例20～24的医药组合物强。
[0359] 如表5所示，通过以制造例31的本发明组合物处理而诱导的IFN-α量比通过以比较例6的比较对照用医药组合物处理而诱导的IFN-α量低。
[0360] 还有，表4和表5中，n.d.表示在检测极限以下。
[0361] [表4]
[0362]
[0363] [表5]
[0364]
[0365] 试验例9 本发明组合物的药效评价
[0366] (1)癌细胞移植小鼠的制备
[0367] 癌细胞移植小鼠通过将3×105个细胞的PC-3细胞(人前列腺癌细胞)移植至雄性裸鼠(BALB/cA Jcl-nu，6周龄，日本科雷亚株式会社制)的皮下而制成。
[0368] (2)实验方法
[0369] 自移植10天后起连续5天，将制造例31中制成的本发明组合物以10mg/kg(核酸浓度)对上述(1)中制成的小鼠进行1天1次的尾静脉内给药。然后，自移植17天后起连续5天同样地给药。给药用量均以10mL/kg实施。每1组使用了6只小鼠。还有，将给与10％麦芽糖的小鼠作为阴性对照。
[0370] 肿瘤体积通过在移植10、13、17、20和24天后测定肿瘤的短径和长径而由“(短2
径)×(长径)÷2”的式子算出。
[0371] (3)实验结果
[0372] 如图15所示，通过给与制造例31中制成的本发明组合物，肿瘤体积的增加得到抑制。
[0373] 试验例10 本发明组合物的药效评价
[0374] (1)癌细胞移植小鼠的制备
[0375] 癌细胞移植小鼠通过将7×105个细胞的MCAS细胞(人卵巢癌细胞)移植至雌性裸鼠(BALB/cA Jcl-nu，6周龄，日本科雷亚株式会社制)的腹腔内而制成。
[0376] (2)实验方法
[0377] 评价对于连续给与本发明组合物的情况和间歇给与的情况进行。连续给药时间表中，在移植后第3～7天和第10～14天给与制造例31中制成的本发明组合物，1天1次。间歇给药时间表中，在移植后第4、7、11、14、18、21、25、28、32和35天给与制造例31中制成的本发明组合物，1天1次。本发明组合物以10mg/kg(核酸浓度)实施尾静脉内给药。给药用量均以10mL/kg实施。每1组使用了6只小鼠。还有，将给与10％麦芽糖的小鼠作为阴性对照。
[0378] (3)实验结果
[0379] 如图16和图17所示，通过给与制造例31中制成的本发明组合物，存活率增加。
[0380] 试验例11 本发明组合物的药效评价
[0381] (1)癌细胞肝转移小鼠的制备
[0382] 癌细胞肝转移小鼠如下制备：将1×106个细胞的A549细胞(人非小细胞肺癌)移植至雄性裸鼠(BALB/cA Jcl-nu，6周龄，日本科雷亚株式会社制)的脾脏，移植10分钟后摘出脾脏。
[0383] (2)实验方法
[0384] 自移植7天后起连续5天，将制造例31中制成的本发明组合物以10mg/kg(核酸浓度)对上述(1)中制成的小鼠进行1天1次的尾静脉内给药。然后，自移植14天后起连续5天同样地给药。给药用量均以10mL/kg实施。每1组使用了6只小鼠。还有，将给与10％麦芽糖的小鼠作为阴性对照。
[0385] (3)实验结果
[0386] 如图18所示，通过给与制造例31中制成的本发明组合物，存活率增加。
[0387] 试验例12 本发明组合物的药效评价
[0388] (1)癌细胞移植小鼠的制备
[0389] 癌细胞移植小鼠通过将1×106个细胞的HPAC细胞(人胰脏癌细胞)移植至雄性裸鼠(BALB/cA Jcl-nu，7周龄，日本科雷亚株式会社制)的胰脏而制成。将使用培养基代替HPAC细胞进行了同样的操作的小鼠作为伪手术组。
[0390] (2)实验方法
[0391] 自移植后第6～10天和第13～17天，将制造例31中制成的本发明组合物以10mg/kg(核酸浓度)对上述(1)中制成的小鼠进行1天1次的尾静脉内给药。移植29天后解剖小鼠，进行胰脏重量的测定，评价抗肿瘤效果。还有，每1组使用了8只小鼠。此外，将给与10％麦芽糖的小鼠作为阴性对照。
[0392] (3)实验结果
[0393] 如图19所示，通过给与制造例31中制成的本发明组合物，胰脏重量的增加得到抑制。
