具体技术细节
[0004] (一)解决的技术问题
[0005] 针对现有技术的不足，本发明提供了油茶皂苷元检测标准品的制备及油茶皂苷的定量检测方法，解决了现有的油茶皂苷元检测标准品的制备及油茶皂苷的定量检测方法，油茶皂苷含量的检测工作较难，油茶皂苷定量检测也较为困难的问题。
[0006] (二)技术方案
[0007] 为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：油茶皂苷元检测标准品的制备及油茶皂苷的定量检测方法，具体包括以下步骤：
[0008] S1：首先将油茶籽或油茶饼粕进行粉碎并过筛，接着将过筛后的油茶籽或油茶饼粕以石油醚超声提取2次，并合并提取液，再将合并后的石油醚提取液过滤，减压浓缩至无石油醚程度，并回收石油醚；
[0009] S2：此时将石油醚提取液过滤后的滤渣晾干，并在干燥的滤渣中加入75％甲醇-水溶液进行三次超声提取，再合并提取液，将合并后的醇提取液过滤，弃取滤渣，减压浓缩至无醇度，并回收甲醇；
[0010] S3：此时醇提取液过滤后所得溶液经AB-8大孔吸附树脂层析柱纯化后，用氢氧化钠、甲醇梯度洗脱，收集含有皂苷的洗脱液，减压浓缩至无醇度，获得油茶总皂苷粗品；
[0011] S4：此时将所得的茶籽总皂苷粗品放入反应釜中，并加入20倍量的3 mol/L盐酸的50％甲醇-水溶液，调节溶液pH值为1-2，在100℃水浴中加热搅拌回流，回流过程中实时监测溶液pH变化，适量补加盐酸，维持溶液的pH 进行水解，接着对水解后茶籽总皂苷粗品进行自然冷却，并用10％氢氧化钠调节溶液pH至中性，再用乙酸乙酯萃取3次，并合并萃取液；
[0012] S5：此时将萃取液进行过滤，并进行减压回收乙酸乙酯试剂，得到浸膏，再将浸膏经氢氧化钠悬浮，沸水浴加热搅拌，将加热搅拌后的浸膏冷却并进行过滤，再利用纯水将浸膏洗至中性，得到油茶总皂苷元。
[0013] 优选的，所述S1中原料可是新鲜或干燥的油茶籽、茶饼粕中的一种或组合，筛网大小20-100目。
[0014] 优选的，所述S2中醇为甲醇、乙醇、正丁醇的一种或甲醇、乙醇、正丁醇的组合，醇的比例50-100％，醇用量为原料的3-10倍，超声时间为30-120 min。
[0015] 优选的，所述S3中醇的比例为10-100％，氢氧化钠、甲醇梯度洗脱为用 1％氢氧化钠溶液冲洗至流出液基本无颜色，再用纯化水冲洗至流出液为中性，依次用5倍柱体积的10％甲醇-水、30％甲醇-水冲洗，最后用80％甲醇-水冲洗至无皂苷。
[0016] 优选的，所述S4中水解时间为1-10hrs，水解pH值保持在1-2之间。
[0017] 优选的，所述S5中氢氧化钠的比例为1-10％，沸水浴搅拌回流时间为 0.5-5hrs。
[0018] 本发明还公开了油茶皂苷元检测标准品制备方法制备的皂苷元的定量检测方法，具体包括以下步骤：
[0019] L1：首先将茶籽总皂苷元粗品利用硅胶进行拌样，再经硅胶柱层析，以石油醚到乙酸乙酯再到乙酸乙酯接着到甲醇的顺序进行梯度洗脱，再进行过反相制备液相色谱法，用甲醇-酸溶液洗脱，并利用TLC进行检测，再进行减压回收溶剂，得到皂苷元粗体；
[0020] L2：将得到的皂苷元粗品用甲醇溶解和过滤，再经高效制备液相色谱反复多次上样制备分离，直至得到单一组份HPLC纯度大于98％单体，经MS、NMR 检测，确定为油茶皂苷元；
[0021] L3：同时将另一半甲醇溶解和过滤后的皂苷元粗品溶液经色谱柱分离后加入蒸发光散射检测器内，并将分离后的皂苷元粗品溶液随流动相导入雾化器内，由高速的载气流将其雾化成微细液滴；
[0022] L4：接着所雾化的微细液滴进入可以控温的蒸发器中，使流动相与蒸发器内的溶剂都气化蒸发，不挥发成分变为微小的雾状颗粒并高速通过蒸发器和光源光路，激光束照在溶质颗粒上产生光散射，光收集器收集散射光并通过光电倍增管转变成电信号，得到油茶皂苷元的检测结果。
[0023] 优选的，所述L1中拌样硅胶为100-300目，硅胶量为样品1-5倍，乙酸乙酯为甲醇＝100:0-0:100，紫外检测色谱条件为色谱柱、流速、等度洗脱为乙腈和检测波长，色谱柱为纳微UniSil5-120C18Ultra(SS4.6*250mm， i.d.5μm)，流速为1.0ml/min，等度洗脱为乙腈为
0.2％磷酸水＝90:10，检测波长为203nm，进样量10μl，柱温30℃。
[0024] 优选的，所述L2中反相制备色谱填料为C18，粒径为5-12μm，MS分析条件为电喷雾ESI负离子模式，毛细管电压负2000V，离子传输管温度为 300℃。蒸发温度为338℃，鞘气压力为56.9psi，辅助气压力为6.5psi，反吹气压力为0.5psi，扫描范围为200-1250u，核磁共振所用溶剂为DMSO-d6 或CDCl3。
[0025] (三)有益效果
[0026] 本发明提供了油茶皂苷元检测标准品的制备及油茶皂苷的定量检测方法。与现有技术相比，具备以下有益效果：该油茶皂苷元检测标准品的制备方法，通过在S1：首先将油茶籽或油茶饼粕进行粉碎并过筛，接着将过筛后的油茶籽或油茶饼粕以石油醚超声提取2次，并合并提取液，再将合并后的石油醚提取液过滤，减压浓缩至无石油醚程度，并回收石油醚；S2：此时将石油醚提取液过滤后的滤渣晾干，并在干燥的滤渣中加入75％甲醇-水溶液进行三次超声提取，再合并提取液，将合并后的醇提取液过滤，弃取滤渣，减压浓缩至无醇度，并回收甲醇，通过油茶皂苷元检测标准品的制备方法可直接快速制备分离油茶皂苷元化合物单体，准确解析结构，无需衍生推测结构，高效液相色谱法检测油茶皂苷元单体，纯度在98.0％以上，提高了油茶皂苷元检测标准品制备方法制备的皂苷元的定量检测方法的可行性，油茶皂苷元检测标准品的制备方法实施方便，适用性广，可适用于其它植物中皂苷元单体化合物的制备分离，蒸发光散射检测器可消除因温度变化引起的基线漂移，在梯度洗脱时也能提供平稳的基线，同时蒸发光散射检测器排除了用UV检测器时的溶剂干扰，大大地提高了分离效果，蒸发光散射检测器基线噪音小，不受梯度影响，能够获得较好的峰形，且仅对不挥发被分析物质产生响应，因此杂质峰较少，和示差折光检测器相比，它的基线漂移不受温度影响。
法律保护范围
涉及权利要求数量9：其中独权1项，从权-1项
1.油茶皂苷元检测标准品的制备方法，其特征在于：具体包括以下步骤：
S1：首先将油茶籽或油茶饼粕进行粉碎并过筛，接着将过筛后的油茶籽或油茶饼粕以石油醚超声提取2次，并合并提取液，再将合并后的石油醚提取液过滤，减压浓缩至无石油醚程度，并回收石油醚；
S2：此时将石油醚提取液过滤后的滤渣晾干，并在干燥的滤渣中加入75％甲醇-水溶液进行三次超声提取，再合并提取液，将合并后的醇提取液过滤，弃取滤渣，减压浓缩至无醇度，并回收甲醇；
S3：此时醇提取液过滤后所得溶液经AB-8大孔吸附树脂层析柱纯化后，用氢氧化钠、甲醇梯度洗脱，收集含有皂苷的洗脱液，减压浓缩至无醇度，获得油茶总皂苷粗品；
S4：此时将所得的茶籽总皂苷粗品放入反应釜中，并加入20倍量的3mol/L盐酸的50％甲醇-水溶液，调节溶液pH值为1-2，在100℃水浴中加热搅拌回流，回流过程中实时监测溶液pH变化，适量补加盐酸，维持溶液的pH进行水解，接着对水解后茶籽总皂苷粗品进行自然冷却，并用10％氢氧化钠调节溶液pH至中性，再用乙酸乙酯萃取3次，并合并萃取液；
S5：此时将萃取液进行过滤，并进行减压回收乙酸乙酯试剂，得到浸膏，再将浸膏经氢氧化钠悬浮，沸水浴加热搅拌，将加热搅拌后的浸膏冷却并进行过滤，再利用纯水将浸膏洗至中性，得到油茶总皂苷元。
2.根据权利要求1所述的油茶皂苷元检测标准品的制备方法，其特征在于：所述S1中原料可是新鲜或干燥的油茶籽、茶饼粕中的一种或组合，筛网大小20-100目。
3.根据权利要求1所述的油茶皂苷元检测标准品的制备方法，其特征在于：所述S2中醇为甲醇、乙醇、正丁醇的一种或甲醇、乙醇、正丁醇的组合，醇的比例50-100％，醇用量为原料的3-10倍，超声时间为30-120min。
4.根据权利要求1所述的油茶皂苷元检测标准品的制备方法，其特征在于：所述S3中醇的比例为10-100％，氢氧化钠、甲醇梯度洗脱为用1％氢氧化钠溶液冲洗至流出液基本无颜色，再用纯化水冲洗至流出液为中性，依次用5倍柱体积的10％甲醇-水、30％甲醇-水冲洗，最后用80％甲醇-水冲洗至无皂苷。
5.根据权利要求1所述的油茶皂苷元检测标准品的制备方法，其特征在于：所述S4中水解时间为1-10hrs，水解pH值保持在1-2之间。
6.根据权利要求1所述的油茶皂苷元检测标准品的制备方法，其特征在于：所述S5中氢氧化钠的比例为1-10％，沸水浴搅拌回流时间为0.5-5hrs。
7.如权利要求1-6任意一项所述油茶皂苷元检测标准品制备方法制备的皂苷元的定量检测方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
L1：首先将茶籽总皂苷元粗品利用硅胶进行拌样，再经硅胶柱层析，以石油醚到乙酸乙酯再到乙酸乙酯接着到甲醇的顺序进行梯度洗脱，再进行过反相制备液相色谱法，用甲醇-酸溶液洗脱，并利用TLC进行检测，再进行减压回收溶剂，得到皂苷元粗体；
L2：将得到的皂苷元粗品用甲醇溶解和过滤，过滤后的皂苷元粗品溶液一半再经高效制备液相色谱反复多次上样制备分离，直至得到单一组份HPLC纯度大于98％单体，经MS、NMR检测，确定为油茶皂苷元；
L3：同时将另一半甲醇溶解和过滤后的皂苷元粗品溶液经色谱柱分离后加入蒸发光散射检测器内，并将分离后的皂苷元粗品溶液随流动相导入雾化器内，由高速的载气流将其雾化成微细液滴；
L4：接着所雾化的微细液滴进入可以控温的蒸发器中，使流动相与蒸发器内的溶剂都气化蒸发，不挥发成分变为微小的雾状颗粒并高速通过蒸发器和光源光路，激光束照在溶质颗粒上产生光散射，光收集器收集散射光并通过光电倍增管转变成电信号，得到油茶皂苷元的检测结果。
8.根据权利要求7所述的油茶皂苷元检测标准品制备方法制备的皂苷元的定量检测方法，其特征在于：所述L1中拌样硅胶为100-300目，硅胶量为样品1-5倍，乙酸乙酯为甲醇＝
100:0-0:100，紫外检测色谱条件为色谱柱、流速、等度洗脱为乙腈和检测波长，色谱柱为纳微UniSil5-120 C18 Ultra(SS4.6*250mm，i.d.5μm)，流速为1.0ml/min，等度洗脱为乙腈为
0.2％磷酸水＝90:10，检测波长为203nm，进样量10μl，柱温30℃。
9.根据权利要求7所述的油茶皂苷元检测标准品制备方法制备的皂苷元的定量检测方法，其特征在于：所述L2中反相制备色谱填料为C18，粒径为5-12μm，MS分析条件为电喷雾ESI负离子模式，毛细管电压负2000V，离子传输管温度为300℃。蒸发温度为338℃，鞘气压力为56.9psi，辅助气压力为6.5psi，反吹气压力为0.5psi，扫描范围为200-1250u，核磁共振所用溶剂为DMSO-d6或CDCl3。
