[0001] 本发明涉及皂苷元制备检测技术领域，具体为油茶皂苷元检测标准品的制备及油茶皂苷的定量检测方法。

[0002] 油茶属于山茶科、山茶属的一种木本油料植物，在油茶种籽中含有丰富的皂苷。油茶皂苷是一类五环三萜类化合物，其基本结构是由皂苷母核、糖基及有机酸组成。作为一种绿色环保非离子型表面活性剂，油茶皂苷在建材、水产、农药和洗涤等行业用途广泛。同时，油茶皂苷还是一种优良的生物活性物质，具有杀菌、抗菌、抗病毒和抗癌等广泛的生物活性，在制药和化妆品行业得到了越来越多的应用，目前应用较广泛的香草醛浓硫酸显色法，是在强氧化性酸的条件下，使皂苷发生脱氢反应。

[0003] 现有的油茶皂苷元检测标准品的制备及油茶皂苷的定量检测方法，由于油茶皂苷分子结构的复杂性、两亲性以及在溶液中将会形成混合聚集体等特性，使得油茶皂苷含量的检测工作非常具有挑战性，此外皂苷分子缺乏较强的发色团，给定量检测带来困难，对于质量分数较低的油茶饼粕或皂苷粗提物的适用性不强，而目前应用较广泛的香草醛浓硫酸显色法，是在强氧化性酸的条件下，使皂苷发生脱氢反应，由于检测样品中还含有大量与皂苷结构相似的黄酮、酚类等化合物，会干扰香草醛显色法的准确度。

[0032] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0033] 请参阅图1-5，本发明提供两种技术方案：油茶皂苷元检测标准品的制备及油茶皂苷的定量检测方法，具体包括以下实施例：

[0034] 实施例1

[0035] 称取茶籽饼粕20kg，粉碎，过80目筛。加160L石油醚超声脱脂两次，每次时间为2h、1h，过滤，合并两次滤液，50℃减压回收石油醚。在干燥的滤渣中加入75％甲醇-水溶液，超声提取3次，每次时间为2h、1h、1h，每次所用溶液为8倍量、5倍量、5倍量；合并提取液，过滤，弃取滤渣，45℃减压回收滤液中的醇，直至无醇度。所得浸膏加1倍量纯化水悬浮，以4BV/h 的流速经AB-8大孔吸附树脂层析柱纯化，首先用1％氢氧化钠溶液冲洗至流出液基本无颜色，再用纯化水冲洗至流出液为中性，依次用5倍柱体积10％甲醇-水、30％甲醇-水冲洗，最后用80％甲醇-水冲洗至无皂苷，收集80％甲醇 -水的流出液，45℃减压浓缩至无醇度，得油茶总皂苷粗品1005g。

[0036] 取上述茶籽总皂苷粗品放入反应釜中，加入20倍量的3mol/L盐酸的50％甲醇-水溶液，调节溶液pH值为1-2，在100℃水浴中加热搅拌回流5h，回流过程中实时监测溶液pH变化，适量补加盐酸，维持溶液的pH在1-2之间。酸解结束后冷却至室温，用10％氢氧化钠调节溶液pH为中性，用3倍体积的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯层，过滤，60℃减压回收乙酸乙酯试剂，残渣用10倍量的2％的氢氧化钠稀释，100℃水浴加热搅拌回流1h，溶液冷却至室温，过滤，固体用纯水洗至中性，得茶籽总皂苷元粗品约130g。

[0037] 取上述茶籽总皂苷元粗品，3倍量200-300目硅胶拌样，经硅胶柱层析，分别以3倍柱体积石油醚:乙酸乙酯(30:1-1:1)→乙酸乙酯→甲醇进行梯度洗脱，每500ml为1馏分，收集乙酸乙酯:甲醇＝10:1至1:1的馏分，TLC检测， 10％硫酸-乙醇溶液为显色剂，合并具有相同Rf值的馏分，60℃减压回收溶剂，得若干不同茶籽皂苷元组份，干燥得粗品23g。

[0038] 实施例2

[0039] 称取茶籽饼粕0.1kg，粉碎，过80目筛。加160L石油醚超声脱脂两次，每次时间为2h、1h，过滤，合并两次滤液，50℃减压回收石油醚。在干燥的滤渣中加入75％甲醇-水溶液超声提取3次，每次时间为2h、1h、1h，每次所用溶液为8倍量、5倍量、5倍量；合并提取液，过滤，弃取滤渣，45℃减压回收滤液中的醇，直至无醇度。所得浸膏加1倍量纯化水悬浮，以
4BV/h 的流速经AB-8大孔吸附树脂层析柱纯化，首先用1％氢氧化钠水溶液冲洗至流出液基本无颜色，再用纯化水冲洗至流出液为中性，依次用5倍柱体积10％甲醇-水、30％甲醇-水冲洗，最后用80％甲醇-水冲洗至无皂苷，收集80％甲醇 -水的流出液，45℃减压浓缩至无醇度，得油茶总皂苷粗品5g。

[0040] 取上述茶籽总皂苷粗品放入反应釜中，加入20倍量的3mol/L盐酸的50％甲醇-水溶液，调节溶液pH值为1-2，在100℃水浴中加热搅拌回流5h，回流过程中实时监测溶液pH变化，适量补加盐酸，维持溶液的pH始终保持在 1-2之间。酸解结束后冷却至室温，用10％氢氧化钠调节溶液pH为中性，用3倍体积的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯层，过滤，60℃减压回收乙酸乙酯试剂，残渣用10倍量的2％的氢氧化钠稀释，100℃水浴加热搅拌回流1 h，溶液冷却至室温，过滤，固体用纯水洗至中性，得茶籽总皂苷元粗品约0.65 g。

[0041] 皂苷元含量检测分析液相条件：色谱柱：UniSil5-120C18Ultra SS4.6*250*5；流速：1.0ml/min；流动相A：乙腈；流动相B：0.2％磷酸-水；检测波长：203nm；柱温：30℃；100g油茶饼粕中皂苷元的含量为：0.65 g*(0.038+0.0273+0.0956+0.1041+0.0405+0.1273)＝0.28g，百分含量为 0.28％。

[0042] 同时本说明书中未作详细描述的内容均属于本领域技术人员公知的现有技术。

[0043] 综上所述，通过油茶皂苷元检测标准品的制备方法可直接快速制备分离油茶皂苷元化合物单体，准确解析结构，无需衍生推测结构，高效液相色谱法检测油茶皂苷元单体，纯度在98.0％以上，提高了油茶皂苷元检测标准品制备方法制备的皂苷元的定量检测方法的可行性，油茶皂苷元检测标准品的制备方法实施方便，适用性广，可适用于其它植物中皂苷元单体化合物的制备分离，蒸发光散射检测器可消除因温度变化引起的基线漂移，在梯度洗脱时也能提供平稳的基线，同时蒸发光散射检测器排除了用UV检测器时的溶剂干扰，大大地提高了分离效果，蒸发光散射检测器基线噪音小，不受梯度影响，能够获得较好的峰形，且仅对不挥发被分析物质产生响应，因此杂质峰较少，和示差折光检测器相比，它的基线漂移不受温度影响。

[0044] 需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

[0045] 尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。