技术领域
[0001] 本发明涉及样品处理方法，尤其涉及用于X射线仪器元素扫描的植物样品处理方法。
相关背景技术
[0002] X射线仪器元素扫描即通过X射线仪器的扫描对植物样品的元素组成进行检测，随着X射线技术的不断发展，在植物组织及细胞显微层面研究元素的分布在植物科学的各个研究领域都成为可能。但是，传统的制样及切片方法不能很好地适应新技术的发展，存在众多十分明显的缺点。传统的石蜡切片操作复杂、步骤多、时间周期长、二甲苯危害身体健康、最为严重的是样品经过多次的脱水、浸蜡极易导致元素发生扩散与移位，使元素分布产生变化从而导致实验失败，不适用于X射线对于元素准确定位的研究。徒手切片偶然性大，样品厚度难以标准化，不利于大量样品的对比与研究。所以，环保、高效、操作简单、时间周期短、样品标准化的样品制备与切片方法亟待开发利用，特别是对植物鲜样切片保存的方法。
具体实施方式
[0018] 实施例1
[0019] 鲜植物样品野生型水稻(日本晴)与锌转运基因突变体(oszip4)基部节维管束切片样品元素分布绘制图
[0020] 1.将野生型水稻(日本晴，WT-1)与锌转运突变体(oszip4)两种水稻一起在1/2强度的Kimura B营养液中培养至32日龄，使用尖嘴镊子剥除水稻老叶，使用双面刀片截取根茎结合部1厘米的鲜植物样品。将样品取样后置于0℃冰盒中1小时，使鲜植物样品停止一切生命活动，防止金属离子转移。
[0021] 2.使用ddH2O配制质量分数10％的低熔点琼脂糖凝胶，高温灭菌后45℃水浴锅内保温。
[0022] 3.用锡箔纸做好凝胶样品托，倒入低熔点琼脂糖凝胶，将截取的鲜样包埋到琼脂糖内部，使用尖嘴镊子将样品放置水平，室温下冷却至凝固状态。
[0023] 4.将样品托放入保存盒，用保鲜膜多层包裹，防止水分散失。放入-20℃超低温冰箱直冷冻1小时至冷冻完全。
[0024] 5.恢复至室温，使用振荡切片机(LeicaVT1200s)室温下切片，切片厚度为100μm。
[0025] 6.将切片移至用ddH2O配置的质量分数为1％的琼脂糖凝胶上保湿，防止切片因失水变形。
[0026] 7.使用光学显微镜观察切片，选择结构完整、位置适中的切片样品。
[0027] 8.使用X射线荧光光谱仪(Bruker；M4 Tornado)在1％琼脂糖凝胶上直接扫描样品，并绘制元素分布图。
[0028] 实施例2
[0029] 鲜植物样品野生型水稻(日本晴)与锌转运基因突变体(oszip4)基部节维管束切片样品元素分布绘制图
[0030] 1.将野生型水稻(日本晴，WT-1)与锌转运突变体(oszip4)两种水稻一起在1/2强度的Kimura B营养液中培养至32日龄，使用尖嘴镊子剥除水稻老叶，使用双面刀片截取根茎结合部1厘米鲜植物样品。将样品取样后置于0℃冰盒中3小时，使鲜植物样品停止一切生命活动，防止金属离子转移。
[0031] 2.使用ddH2O配制质量分数20％的低熔点琼脂糖凝胶，高温灭菌后45℃水浴锅内保温。
[0032] 3.用锡箔纸做好凝胶样品托，倒入低熔点琼脂糖凝胶，将截取的鲜样包埋到琼脂糖内部，使用尖嘴镊子将样品放置水平，室温下冷却至凝固状态。
[0033] 4.将样品托放入保存盒，用保鲜膜多层包裹，防止水分散失。放入-40℃超低温冰箱直冷冻3小时至冷冻完全。
[0034] 5.恢复至室温，使用振荡切片机(LeicaVT1200s)室温下切片，切片厚度为80μm。
[0035] 6.将切片移至用ddH2O配置的质量分数为5％的琼脂糖凝胶上保湿，防止切片因失水变形。
[0036] 7.使用光学显微镜观察切片，选择结构完整、位置适中的切片样品。
[0037] 8.使用X射线荧光光谱仪(Bruker；M4 Tornado)在1％琼脂糖凝胶上直接扫描样品，并绘制元素分布图。
[0038] 实施例3
[0039] 鲜植物样品野生型水稻(日本晴)与锌转运基因突变体(oszip4)基部节维管束切片样品元素分布绘制图
[0040] 1.将野生型水稻(日本晴，WT-1)与锌转运突变体(oszip4)两种水稻一起在1/2强度的Kimura B营养液中培养至32日龄，使用尖嘴镊子剥除水稻老叶，使用双面刀片截取根茎结合部1厘米鲜植物样品。将样品取样后置于冰盒中4小时，使鲜植物样品停止一切生命活动，防止金属离子转移。
[0041] 2.使用ddH2O配制质量分数20％的低熔点琼脂糖凝胶，高温灭菌后45℃水浴锅内保温。
[0042] 3.用锡箔纸做好凝胶样品托，倒入低熔点琼脂糖凝胶，将截取的鲜样包埋到琼脂糖内部，使用尖嘴镊子将样品放置水平，室温下冷却至凝固状态。
[0043] 4.将样品托放入保存盒，用保鲜膜多层包裹，防止水分散失。放入-40℃超低温冰箱直冷冻4小时至冷冻完全。
[0044] 5.恢复至室温，使用振荡切片机(LeicaVT1200s)室温下切片，切片厚度为80μm。
[0045] 6.使用光学显微镜观察切片，选择结构完整、位置适中的切片样品。
[0046] 7.将样品放置在两层聚丙烯薄膜之间，使用X射线荧光光谱仪(Bruker；M4 Tornado)直接扫描样品，并绘制元素分布图。
[0047] 实施例4
[0048] 鲜植物样品野生型水稻(日本晴)与锌转运基因突变体(oszip4)基部节维管束切片样品元素分布绘制图
[0049] 1.将野生型水稻(日本晴，WT-1)与锌转运突变体(oszip4)两种水稻一起在1/2强度的Kimura B营养液中培养至32日龄，使用尖嘴镊子剥除水稻老叶，使用双面刀片截取根茎结合部1厘米鲜植物样品。将样品取样后置于冰盒中1小时，使鲜植物样品停止一切生命活动，防止金属离子转移。
[0050] 2.使用ddH2O配制质量分数10％的低熔点琼脂糖凝胶，高温灭菌后45℃水浴锅内保温。
[0051] 3.用锡箔纸做好凝胶样品托，倒入低熔点琼脂糖凝胶，将截取的鲜样包埋到琼脂糖内部，使用尖嘴镊子将样品放置水平，室温下冷却至凝固状态。
[0052] 4.将样品托放入保存盒，用保鲜膜多层包裹，防止水分散失。放入-80℃超低温冰箱直冷冻1～4小时至冷冻完全。
[0053] 5.恢复至室温，使用振荡切片机(LeicaVT1200s)室温下切片，切片厚度为100μm。
[0054] 6.将切片移至用ddH2O配置的质量分数为1％的琼脂糖凝胶上保湿，防止切片因失水变形，加盖聚丙烯薄膜Prolene thin-film(Chemplex426)。
[0055] 7.使用光学显微镜观察切片，选择结构完整、位置适中的切片样品。
[0056] 8.使用X射线荧光光谱仪(Bruker；M4 Tornado)在1％琼脂糖凝胶上直接扫描样品，并绘制元素分布图，绘制的图如图1所示。
[0057] 实施例5
[0058] 设计若干组平行实验，设计将鲜植物样品包埋入固定基质的种类分别为低熔点琼脂糖凝胶、普通琼脂糖凝胶、高熔点琼脂糖凝胶。其余原料和处理步骤与实施例4相同，使用得到的样品经过X射线荧光光谱仪扫描，绘制的元素分布图如表1：
[0059] 表1-鲜植物样品固定基质种类对X射线仪器元素扫描的影响
[0060]
[0061] 由表1可知，当固定基质为凝胶温度为24～30℃、溶胶温度为65.5℃以下的低熔点琼脂糖凝胶时，由于溶胶温度较低，可以有效防止操作过程中高温对植物的影响，防止鲜植物样品高温下变性或者元素发生转移，从而影响元素分布效果图中数据的清晰度和准确性。
[0062] 实施例6
[0063] 设计若干组平行实验，设计包埋鲜植物样品的低熔点琼脂糖凝胶中，低熔点琼脂糖凝胶的质量分数分别为3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％，其余原料和处理步骤与实施例4相同，使用得到的样品经过X射线荧光光谱仪扫描，绘制的元素分布图如表2：
[0064] 表2-低熔点琼脂糖凝胶的质量分数对X射线仪器元素扫描的影响
[0065]
[0066] 由表2可知，当加入的低熔点琼脂糖凝胶的质量分数为5～15％之间时，包埋后的样品硬度适中，鲜植物样品和琼脂糖融合性好，包埋紧密，有利于切片过程的操作。琼脂糖浓度过高，包埋样品硬度太大，也不利于鲜植物样品与琼脂凝胶的融合，在切割过程中，受刀片的力，容易从中脱落，不利于切片过程的进行。
[0067] 实施例7
[0068] 设计若干组平行实验，设计鲜植物样品包埋入低熔点琼脂糖凝胶并切片的切片厚度分别为15、20、40、60、80、100、120μm，其余原料和处理步骤与实施例4相同，扫描并绘制的元素分布图效果如表3所示。
[0069] 表3-切片厚度对鲜植物样品X射线仪器扫描效果的影响
[0070]
[0071] 由表3可知，因为当鲜植物样品切片厚度低于60μm时，切片样品中各元素积累量有限，所以元素分布图效果不清晰准确；扫描信号弱大于100μm时，样品厚度增加，生物结构跨度大，也不利于实验结果的科学性。
[0072] 实施例8
[0073] 设计若干组平行实验，设计步骤1中野生型水稻(日本晴，WT-1)与锌转运突变体(oszip4)两种水稻处理后得到的鲜植物样品分别置于0℃冰盒内0.5、1、2、3、4、4.5小时后将样品包埋，其余原料和处理步骤与实施例4相同，扫描并绘制的元素分布图效果如表4所示。
[0074] 表4-零度保存的时间对鲜植物样品X射线仪器扫描效果的影响
[0075]
[0076] 由表4可知，把鲜植物样品及时的转入冰盒内，可有效降低植物的生命活动，使植物体内各元素稳定存在，不发生转运现象。当鲜植物样品分别置于0℃冰盒内小于1小时样品元素扫描图边界模糊，元素可能发生微量转移。大于4小时，无影响，但降低了实验的时间效率。
[0077] 实施例9
[0078] 设计若干组平行实验，设计鲜植物样品分别置于0、0.5％、1％、5％、10％、20％、30％琼脂糖凝胶上防止水分散失，使用X射线荧光光谱仪扫描样品，其余原料和处理步骤与实施例4相同，扫描并绘制的元素分布图效果如表5所示。
[0079] 表5-置于不同浓度的琼脂糖凝胶上对鲜植物样品X射线仪器扫描效果的影响[0080]
[0081] 由表5可知，当切片样品直接放在聚丙烯薄膜上扫描，切片样品失水变形，扫描图像模糊。当切片后的鲜植物样品置于小于1％的琼脂糖凝胶上，凝胶水分过大，容易将样品淹没，不利于扫描的正常进行，导致元素分布图效果不清晰。当大于5％时，凝胶水分不足，不利于植物鲜样的保湿，样品容易失水变形，影响实验结果的准确性。
