技术领域
[0001] 本发明涉及分子生物学以及基因工程领域，尤其是一种调控珠子参皂苷生物合成的转录因子基因PjMYB1的用途。
相关背景技术
[0002] 珠子参Panax japonicus C. A. Mey.var. major (Burk.) C. Y. Wu et K. M. Feng为五加科Araliaceae人参属Panax植物，因根茎节间纤细，节膨大成球形念珠状而得名。珠子参作为传统中草药，始载于《滇南本草》，为历版《中国药典》收载品种。药用珠子参以其根茎入药，主产于云南，是彝族、纳西族、白族、藏族、傈僳族等少数民族的传统用药。目前，野生珠子参主要分布于滇西北、滇东北地区，常见于海拔达2500-4000 m的亚高山针叶林及阔叶林下。珠子参性味苦、甘、微寒，归肝、肺、胃经，具有补肺养阴、祛瘀止痛，止血之功效，临床上应用于气阴两虚，烦热口渴，虚痨咳嗽，跌打损伤，关节疼痛，咳血，吐血，外伤出血等。
[0003] 珠子参皂苷(Panax japonicus saponins, PJS)为珠子参的主要活性成分，包括达玛烷型和齐墩果烷型三萜皂苷。目前，已从珠子参根茎叶中分离出了30多种皂苷成分，代表性成分为竹节参皂苷IVa、竹节参皂苷IV、竹节参皂苷V、人参皂苷R0等齐墩果烷型皂苷。而人参属的代表物种“人参”(Panax ginseng)主要含达玛烷型皂苷，齐墩果烷型皂苷仅发现含量极微的人参皂苷R0；“三七”(Panax notoginseng)只含达玛烷型皂苷，不含齐墩果烷型皂苷。珠子参所含皂苷组分与同属“人参”、“三七”相比，在成分种类以及各组分含量上均存在明显差异，因其含有大量齐墩果烷型皂苷，导致珠子参在临床上的特殊用途。现代药理学研究表明，珠子参皂苷具有抗炎镇痛、改善心肌缺血、增加脑血流量、抗肿瘤、免疫调节以及治疗白细胞减少症等功效。
[0004] 珠子参为多年生药用草本植物，需生长多年，方能入药。长期对野生资源的过度采挖致使珠子参资源日渐枯竭。近些年，随着珠子参药理研究的不断深入，其药用价值逐渐受到认可和重视，社会对珠子参药用功效的认知度逐步提高，以珠子参为组分的药品市场迅速扩大，珠子参药材需求迅猛增长，供需矛盾日渐突出。鉴于珠子参人工栽培时间长，药用成分化学合成机理和路线不够清晰等弊端，利用生物工程技术和基因调控的方法生产珠子参皂苷逐渐成为研究热点。
[0005] 转录因子对基因的转录激活是植物次生代谢过程重要的调控环节，以其独有的“多点调控”优势，弥补了代谢工程操作中单个关键酶基因作用不足和多个关键酶基因可能产生组成性致死表达的情况。转录因子通过激活植物次生代谢合成途径中功能相关的酶基因的表达，启动或关闭次生代谢合成途径，从而调控次生代谢物的合成。
[0006] MYB类转录因子是植物转录因子家族的重要成员，自MYB发现以来，越来越多的研究表明其对植物的生长发育和次生代谢产物有着密切的关系，并且近年来发现MYB转录因子和其它调控次生代谢产物的转录因子之间存在互作关系。例如龙胆（Gentiana scabra）中过表达两种R2R3-MYB型转录因子GtMYBP3和GtMYBP4有助于黄酮的生物合成以及积累，通过瞬时表达发现转录因子GtMYBP3和GtMYBP4是提高黄酮早期合成的基因FNSII和 F3H的启动子活性，从而促进了内源性黄酮生物合成以及黄酮的积累；AtMYBl23/TT2、TTl与R2R3-MYB能对拟南芥（Arabidopsis thaliana）种皮的原花青素(PAs)的生物合成起协同调控作用。
[0007] 随着对植物次生代谢网络的深入解析和调控机制的阐明，特别是调节特定次生代谢物合成的转录因子的分离和鉴定，基于转录因子的基因工程将为开发利用植物次生代谢物提供更加有效的手段。
具体实施方式
[0013] 下面通过附图和实施例对本发明进一步说明，但本发明保护范围不局限于所述内容。
[0014] 实施例1：PjMYB1基因的克隆以及生物信息学分析采用改良的异硫氰酸胍法取提取珠子参的总RNA（图1），以提取的珠子参愈伤组织总TM
RNA为模板，参照GoScript Reverse Transcriptase System试剂盒说明书合成cDNA第一链，反应体系和操作过程为：取5 μg Total RNA，依次加入50 ng oligo(dT) 15、2 μL dNTP (2.5 mM each)、DEPC水至反应体积为13.5 μL；温和混匀，进行70℃、5min预变性后迅速在冰上冷却5 min，然后依次加入4 μL 5×First-stand buffer、0.5 μL RNasin (200U)、1 μL M-MLV (200U)，混匀并瞬时离心，25℃退火5 min，42℃温浴1.5 h，最后放置于70℃水浴锅加热10 min，使转录酶失活以终止反应，所合成的cDNA第一链置于-20℃保存备用。
[0015] 以合成的第一链cDNA为模板，根据三七中与调控三七皂苷生物合成相关的MYB类转录因子基因cDNA序列设计特异性引物，进行高保真PCR扩增，所用引物序列分别为5’-ATGGGGAGGAGCCCTTGCTGTGC-3’以及5’-TCAAGACAGCCAATCTCCTCCGGAC -3’。PCR反应条件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，32 cycles；72℃ 10 min。反应体系(50 μL)为4 μL 第一链cDNA、5 μL Ex Taq PCR Buffer (10×)、4 μL dNTP Mixture (2.5 mM)、0.5 μL 正向引物(10 μM)、0.5 μL 反向引物(10 μM)、0.5 μL Ex Taq DNA polymerase (5 U/μL)、35.5 μL ddH2O。PCR结束后，取5 μL用于琼脂糖凝胶电泳，检测扩增产物的特异性以及大小，其余PCR产物进行胶回收（图2）。将目的片段胶回收产物进行T-A克隆，反应体系和操作过程为：取3 μL 胶回收产物，依次加入1 μL pMD18-T载体、5 μL SolutionⅠ以及1 μL ddH2O混匀后瞬时离心，16℃反应30 min。采用热激转化法将连接产物转入大肠杆菌Trans1-T1中。用含有氨苄青霉素(ampicillin，Amp)的LB固体培养基筛选阳性克隆。挑选若干个菌落，摇菌后用扩增PjMYB1的特异引物鉴定出多克隆位点插入PjMYB1的克隆，将鉴定的克隆进行测序。
[0016] 最终获得的PjMYB1 cDNA大小为735 bp，通过NCBI ORF finder (http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)分析发现其正好为开放阅读框(见序列表)。PjMYB1编码蛋白的分子量约为27.7KD，等电点为8.85，不稳定系数为68.98，预测PjMYB1编码的蛋白质不稳定。生物信息学预测PjMYB1不包含跨膜区，不含信号肽，具有一个MYB转录因子特征保守结构域。通过在线工具iPSORT预测PjMYB1可能定位于细胞核。借助SWISS-MODEL工具，PjMYB1以1a5j.1.A原癌基因蛋白为模板进行三维结构建模（图3），结果表明
1a5j.1.A具有43.93%的序列相似性的空间结构。
[0017] 实施例2：植物表达载体构建根据植物表达载体pCAMBIA2300S的多克隆位点，利用Primer Premier 5.0对PjMYB1基因序列进行酶切位点的选择及引物的设计。采用SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒(上海生工)提取插入PjMYB1的大肠杆菌质粒pMD18-T-PjMYB1以及植物表达载体pCAMBIA2300S的质粒，取1 μL用于琼脂糖凝胶电泳以检测所提取质粒的完整性和浓度高低。用XbaI (TaKaRa)和SmaI (TaKaRa)分别对质粒pMD18-T-PjMYB1和pCAMBIA2300S进行双酶切(100μL体系)，反应体系和操作过程为：取20μL pMD18-T-PjMYB1或pCAMBIA2300S质粒，依次加入10 μL 10×M buffer、5 μL Xba I、5 μL SmaI、60 μL ddH2O，混匀，放置于37℃水浴锅中酶切6 h。使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工)对PjMYB1片段和pCAMBIA2300S大片段分别进行胶回收。取1 μL回收产物通过琼脂糖凝胶电泳检测回收片段的大小以及浓度，置于-
20℃保存备用。
[0018] 使用T4 DNA Ligase将回收得到的DNA片段进行连接，构建重组载体pCAMBIA2300S-PjMYB1。反应体系(20 μL)和操作过程为：取10 μL PjMYB1DNA片段依次加入
2 μL pCAMBIA2300S载体DNA、2 μL 10×T4 DNA Ligase Buffer、1 μL T4 DNA Ligase、5 μL ddH2O，充分混匀，于16℃进行过夜连接反应。接着采用热激转化法将连接产物转入大肠杆菌Trans1-T1中，将转化后的菌液涂布于含有50 mg/L卡那霉素的LB固体培养基上，37℃，倒置培养过夜，挑取单克隆，摇菌，以菌液为模板，用PjMYB1的上下游引物进行菌液PCR检测，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，筛选含有重组质粒pCAMBIA2300S- PjMYB1的大肠杆菌单克隆菌液，加入20%甘油混匀后置于-80℃保存备用。
[0019] 用质粒提取试剂盒提取并纯化上述大肠杆菌中的pCAMBIA2300S-PjMYB1质粒。制备农杆菌EHA105菌株的感受态细胞并分装于1.5 mL离心管中，每管150 μL，液氮速冻后置于-80℃保存备用。采用液氮冻融法将上述构建的植物表达载体pCAMBIA2300S-PjMYB1转入所制备的农杆菌EHA105感受态细胞中。操作步骤为：取3 μg pCAMBIA2300S-PjMYB1质粒加入含有150 μL感受态细胞的离心管中，轻轻混匀后冰浴30 min，接着转入液氮中速冻5 min后迅速置于37℃水浴5 min，随后立即冰浴2 min。将转化的农杆菌感受态细胞移至LB液体培养基（不加任何抗生素）中，28℃，200 rpm振荡培养4h，使细胞复苏，然后涂布于含有50 mg/L Km和25 mg/L利福平的LB固体培养基上，于28℃培养箱倒置培养48 h左右。挑取单克隆，摇菌，菌液PCR检测，筛选含有重组载体pCAMBIA2300S-PjMYB1的农杆菌EHA105侵染珠子参愈伤组织细胞，并且将菌种甘油保存于-80℃备用。
[0020] 实施例3：农杆菌介导的珠子参遗传转化选取生长状态良好（细胞无颗粒状且呈现淡黄色）的珠子参细胞转接于珠子参细胞预培养基上（含35 mg/L乙酰丁香酮），铺满培养基表面，并置于25℃条件下暗培养3天。从-80℃冰箱中取出保存的含有pCAMBIA2300S- PjMYB1质粒的农杆菌EHA105菌种，以0.1 %的接种量接种于含有50 mg/L卡那霉素和25 mg/L 利福平的LB液体培养基中，28℃，200 rpm振荡培养至OD600值为0.6 0.8，然后分装于50 mL离心管中，室温5000 rpm离心5 min收集菌~
体。将菌体移至含有40 mg/L乙酰丁香酮的MGL液体培养基中，28℃，200 rpm振荡培养至OD600值为0.6~0.8；将上述预培养3天的珠子参愈伤组织细胞完全浸没于菌液中，于25℃摇床，110 rpm振荡培养20 min，随后用布氏漏斗和滤纸去除珠子参愈伤组织表面的菌液。将珠子参细胞转接至表面铺有无菌滤纸的共培养基上，于25℃黑暗条件下共培养3天；
共培养结束后，将珠子参细胞转移至已灭菌的烧杯中，用含有400mg/L 头孢霉素的无菌水清洗5 6次，以充分去除农杆菌。清洗结束后，再次使用布氏漏斗和滤纸去除珠子参愈~
伤组织细胞表面的液体。将珠子参细胞转接至含400 mg/L头孢霉素的除菌培养基上暗培养
15天，防止农杆菌过度生长。最后将愈伤组织转接到筛选培养基中，每45天继代一次。经过4
5次筛选，最终分离出具有Km抗性的转基因细胞系，用于后续检测。
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[0021] 实施例4：PjMYB1基因超表达对珠子参皂苷合成途径关键酶基因PjFPS、PjDS、PjAS表达量的影响选取25天左右、生长状态良好的珠子参阳性转基因细胞系和野生型细胞系，分别提取RNA，按照GoScriptTMReverse Transcriptase System试剂盒将提取的RNA逆转录成cDNA，反应体系和操作过程为：在离心管中加入5μg 总RNA、1μL Random Primer和1μL Oligo(dT)15，用Nuclease-free Water补齐至10μL，混匀，进行70℃、5min预变性，完成后立即置于冰上冰浴5min。随后将离心管在离心机中短暂离心，使反应液收集于管底，再向其中加入4µL GoScriptTM 5×Reaction Buffer、2µL MgCl2 (25 mM)、1µL PCR Nucleotide Mix(10 mM)、TM
0.5 µL Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor和1 µL GoScript Reverse Transcriptase，混匀，瞬时离心，25℃退火5 min，42℃延伸1.5 h，最后，放置70℃水浴锅中
15 min，使逆转录酶失活，结束反应，短暂离心，-20℃保存备用。
[0022] 将逆转录合成的cDNA稀释5倍，即将20.0 µL cDNA稀释至100.0 µL。以稀释后的®cDNA为模板，根据GoTaq 2-Step RT-qPCR System试剂盒说明书以及珠子参18S rRNA基因（登录号：AB088018.1）、法尼基焦磷酸合成酶（Farnesyl diphosphate synthase, FPS）基因（登录号：KP684141）、β-香树脂醇合成酶（β-amysyrin synthase,βAS）基因（登录号：
KP658156）以及达玛烷合成酶基因（dammarane synthase）设计引物，进行荧光定量PCR。
[0023] 所用引物序列为FPSF：5’-AGAATGAGCGATCTGAAGACGAG-3’， FPSR：5’-ACAGACAACAAC TTCCCCTCCAT-3’；βASF：5’-GTATTCCCTGTAGAGCATCGCAT-3’，βASR：5’-GGCACAGGCGTTGTTTTCAC-3’；DSF：5’-TGGGAGTTTCAGCCCGATG-3’，DSR：5’-GGGGAGGTGTATAAAGTAAAGAGCC-3’； 18SF：5’-GTTGTTGCAG TTAAAAAGCTCGTAG-3’，18SR：5’-ACCTCTGACTATGAAATACGAATGC-3’。
[0024] 具体反应体系和操作过程为：在PCR管中加入20 ng cDNA、25 µL GoTaq® qPCR Master Mix (2×)和0.2 µL qPCR Primers(18SF /18SR，FPSF / FPSR，βASF/ βASR，DSF /DSR 10 mM)，用Nuclease-Free Water补齐至50 µL。将反应体系漩涡混匀后，离心将其收集到管底，随后将其置于荧光定量PCR仪中进行反应，采用两步法进行荧光定量PCR，反应参数如下：热启动 95℃ 2min；变性 95℃ 15s，退火/延伸 60℃ 1min，共45个循环。每个样品对应的每个基因重复检测2次。
[0025] qRT-PCR结果显示，转PjMYB1基因珠子参细胞中PjFPS、PjDS、PjAS基因的表达量要比野生型的高（图4），说明PjMYB1作为转录因子，能够促进珠子参皂苷合成代谢途径中关键酶基因PjFPS、PjDS、PjAS的表达；图中，C表示对照组野生型细胞系，1、2、3和4分别表示不同的转基因细胞系实验组。
[0026] 实施例5：PjMYB1基因超表达对珠子参皂苷合成量的影响收集生长35天左右的转基因珠子参细胞和野生型细胞，分别置于55℃烘箱烘至恒重，充分研磨成粉末后过100目筛。称取转基因和野生型珠子参细胞粉末各0.5g，分别置于含有
50mL甲醇溶液的洗净的三角瓶中过夜浸泡。在60W，超声4s，间歇2s的超声条件下超声1.5~
2.0h。常温条件下4, 000rpm离心30min，收集上清液，即珠子参总皂苷溶液，并于4℃冰箱保存备用。
[0027] 精确吸取此样品150μL上述已制备好的各珠子参细胞株系对应的总皂苷溶液于带塞子的试管中（每个样品设置3个平行），于55℃条件下挥发掉溶剂，加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液200 μL，高氯酸800 μL，塞上试管塞，旋涡混匀后60℃水浴加热15 min，每隔5min充分晃动一次，促进充分反应。反应结束后立即将试管放置于冰中冷却，再向反应液中加入5 mL冰醋酸，充分混匀，室温静置10min。用紫外分光光度计在550nm波长处测定各反应液的吸光值，参照标准曲线计算出各转基因和野生型珠子参细胞株系中总皂苷的含量。结果显示，转PjMYB1基因珠子参细胞中皂苷含量明显高于野生型细胞中皂苷含量（图5），说明PjMYB1转录因子参与了珠子参皂苷的合成代谢调控，有助于皂苷产量的提高。C表示对照组野生型细胞系，1、2、3和4分别表示不同的转基因细胞系实验组。
