[0001] 本发明涉及一种应用于棒杆菌的启动子，尤其是一种棒杆菌中的与中心代谢相关的启动子PodhI及其应用，属于基因工程技术领域。

[0002] 启动子位于转录起始点上游，是RNA聚合酶的识别和结合位点，由此启动转录。

[0003] 棒杆菌是安全生产菌，无内毒素及胞外水解酶活性，广泛应用于多种氨基酸及有机酸的生产，如谷氨酸，赖氨酸，鸟氨酸，精氨酸，尼龙-4等，其产品可作为饲料添加剂，食品添加剂，医药中间体，可降解塑料的前体，在化妆品行业也有着重要应用。

[0004] 近年来棒杆菌启动子工程取得了很大的进展，棒杆菌基因组上的启动子如Psod，Ptuf，PcspB等近年来被应用于增强相关基因的表达，并取得了一定的成效。虽然组成型启动子、诱导型启动子、合成启动子等都有所报道，但是真正应用于棒杆菌的还比较少，与中心代谢相关的启动子研究的也比较少，且迫切需求更多的启动子来增强基因的表达，平衡代谢流，以实现高产目的代谢产物的目标。

[0011] 下面通过实例来证明PodhI启动子的应用，但并非局限于只能用作谷氨酸脱羧酶基因的启动子，还可应用于棒杆菌中任何基因及其相关代谢产物的合成。

[0012] 菌株：本发明所用到的菌株：高产谷氨酸的谷氨酸棒杆菌，大肠杆菌JM 109购自天根生物公司。

[0013] 试剂：限制性内切酶XbaI，T4DNA连接酶，PCR试剂均购自Thermo公司，基因组提取试剂盒，质粒抽提试剂盒，胶回收试剂盒，PCR产物纯化试剂盒，卡那霉素均购自上海生工，其他试剂均为国产或进口的分析纯试剂。

[0014] 种子培养基(100ml)：葡萄糖2.5％，玉米浆3％，尿素0.8％，K2HPO4·3H2O 0.1％，MgSO4 0.02％，NaOH调pH 7.2。

[0015] 发酵培养基(100ml)：葡萄糖10％，K2HPO4·3H2O 0.2％，玉米浆0.2％，MgSO40.04％，MnSO4·H2O 2mg/L，FeSO4·7H2O 2mg/L，NaOH调pH 7.2。

[0016] 启动子对gadB2的表达效果测定：(1)实时荧光定量PCR：实时荧光定量PCR主要用于检测gadB2的转录水平，取20h和40h发酵液，提取RNA，反转录合成cDNA，然后进行实时荧光定量PCR的测定；(2)谷氨酸脱羧酶(GAD)酶活检测：GAD酶活测定时，取40h发酵液，测定OD值，离心去上清，用pH7.2的磷酸缓冲液洗两次，去除发酵液及胞外粘附的杂质，再将细胞悬浮在含0.1％Triton的0.02M pH4.8的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液中，获得全细胞液；GAD酶促反应体系为1ml，包括0.2M pH5.0Na2HPO4-柠檬酸缓冲液，30mM的谷氨酸钠，0.03mM的磷酸吡哆醛及400μl全细胞液，底物和全细胞提前于37℃预热10min，然后全细胞液加到反应体系中，于37℃反应1h，再煮沸10min结束反应，离心20min，上清用于检测合成的γ-氨基丁酸(GABA)含量；(3)高效液相色谱OPA柱前衍生法测定GABA产量：发酵液上清用终浓5％的TCA(三氯乙酸)稀释50倍，沉淀4h以上，12000rpm离心30min去除沉淀，取上清用于检测γ-氨基丁酸及谷氨酸的含量。

[0017] 实施例1：重组谷氨酸棒杆菌的构建及启动子PodhI强度检测

[0018] 1、以

[0019] 上游引物PodhI-F：

[0020] 5'-CATTTCTAGACGATCACGAGGGGGCACATT-3'

[0021] 下游引物PodhI-R：

[0022] 5'-CCCGGCTCTAGATCTTAACGATTTTCATCATA-3'扩增启动子片段PodhI(SEQ ID NO.1)，将启动子与测试质粒pJYW-5-gadB2(pJYW-5构建方法见公开号CN103834679A、发明名称“一种不依赖抗生素为选择压力的棒状杆菌表达系统”的专利，pJYW-5在酶切位点XbaI及PstI之间连gadB2，gadB2见公开号CN102154345A、发明名称“谷氨酸脱羧酶基因及其应用”的专利)用XbaI酶切，载体需要去磷酸化，然后将启动子片段和载体用T4DNA连接酶连接过夜，转化到大肠杆菌感受态细胞JM109，挑选出正确的转化子，构建pJYW-5-PodhI-gadB2。

[0023] 2、将质粒pJYW-5-PodhI-gadB2电转进谷氨酸棒杆菌感受态细胞中，挑选出正确转化子，SH/pJYW-5-PodhI-gadB2

[0024] 3、将活化好的重组谷氨酸棒杆菌SH/pJYW-5-PodhI-gadB2接种到30ml种子培养基，30℃、200rpm，培养8h，转接到发酵培养基中，初始OD5621.9接到发酵培养基，10h-24h，通过补加尿素的方法维持发酵液pH在6.5-7.5，从24h开始，每12h取样测定OD、残糖、pH、GABA产量等各参数，直至72h发酵结束。

[0025] 发酵各参数测定结果表明，含PodhI菌株20h、40h的gadB2转录水平是含Psod菌株的20.04倍、2.69倍，是含Ptuf菌株的13.48倍、3.68倍；含PodhI菌株的谷氨酸脱羧酶活性是含Psod、Ptuf菌株的6.64倍、1.10倍；从72h GABA积累情况来看，含PodhI菌株比含Psod菌株提高了
1.79倍，比含Ptuf的菌株略低，综合三方面均证明启动子PodhI比对照启动子Psod强，与Ptuf强度相近。

[0026] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。