CHO表达系统 [0001] 本申请是申请日为2013年6月14日、中国申请号为201380042643.6、发明名称为“CHO表达系统”的发明申请的分案申请。 发明领域 [0002] 本发明属于工业蛋白质生产领域。发明人设计并构建了包含编码人或家犬来源的谷氨酰胺合成酶的表达载体的新表达系统，以及CHO细胞系。更具体而言，本发明涉及以下各项的组合：(i)适用于产生重组蛋白的DNA载体，其中所述载体包含编码谷氨酰胺合成酶的序列，和(ii)中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系，其中所述GS包含与SEQ ID NO:1的序列或与SEQ ID NO:2的序列至少94.5％相同的序列。 背景技术 [0003] 当以工业规模产生重组蛋白时，必需分离产生大量重组蛋白的克隆。 [0004] 将异源基因引入动物宿主细胞并筛选加入的基因的表达是漫长且复杂的过程。该过程涉及转染和选择具有稳定的长期表达的克隆，和筛选重组蛋白的高表达率。 [0005] 在从表达载体产生表达重组蛋白的克隆时，通常将宿主细胞用在同一载体上编码感兴趣的蛋白质和选择标记二者的DNA载体转染。这样的表达载体因而包含选择标记，其允许选择其中存在所述表达载体的克隆。这样的选择标记也可能导致共扩增的发生，由此允许高生产克隆的分离。 [0006] 本领域已知数种这样的选择标记，包括例如G418、潮霉素、嘌呤霉素、新霉素、二氢叶酸还原酶(DHFR)、谷氨酰胺合成酶(GS)和次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)。特别是GS在工业重组蛋白生产领域广泛用作真核细胞中的选择标记。 [0007] 更具体而言，WO 87/04462描述了谷氨酰胺合成酶(GS)作为选择标记的使用。实施例教导了一种表达载体，其包含作为选择标记的编码中国仓鼠来源的GS的序列。进一步显示了这样的表达载体允许在所述表达载体转染至CHO细胞中时产生重组蛋白，所述重组蛋白是tPA。 [0008] 尽管早在八十年代就描述了上述基于使用GS作为选择标记的CHO表达系统，时至今日其仍然是本领域的标准。特别是对于所述原始GS选择标记尚没有显著改进发表。 [0009] 实际上，韩国专利KR10-0267720公开了使用人GS作为选择标记。然而，使用的人GS的精确序列没有公开。另外，其还表明技术效果(高产率)仅与人GS和使用的特定SV40启动子二者相关联(即缺乏128-270位的SV40启动子)。 [0010] 因此本领域需要另外的和/或改进的表达系统，其允许分离大量表达期望产生的重组蛋白的克隆，这些克隆中的至少一些展现出所述重组蛋白的高表达率。 发明内容 [0011] 发明人惊讶地发现当在CHO细胞中产生重组蛋白时，使用人或家犬来源的GS比使用CHO来源的GS产生了更好的结果(参见例如图2和3)。 [0012] 特别是发现了使用人来源的GS尤其有利，因为其允许分离比在使用CHO来源的GS时更多的表达所述重组蛋白的克隆，它们中的一些以比使用CHO来源的GS时更高的水平表达所述重组蛋白(参见例如图3)。 [0013] 本发明的一个实施方案提供中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系，其包含脱氧核糖核酸(DNA)表达载体，并且其中所述载体包含编码异源哺乳动物谷氨酰胺合成酶(GS)的核苷酸序列和至少一个用于表达重组蛋白的表达盒，其中所述GS包含与SEQ ID NO:1的序列或与SEQ ID NO:2的序列至少94.5％相同的蛋白质序列；或SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的至少 100个连续氨基酸的蛋白质片段。在本发明的另一个实施方案中，所述GS包含与SEQ ID NO: 1的序列或与SEQ ID NO:2的序列至少94.5％相同的序列。在本发明的另一个实施方案中，所述GS包含与SEQ ID NO:1的序列至少97.5％相同的序列。在本发明的特定实施方案中，所述GS是人GS并且包含SEQ ID NO:1的序列。在本发明的另一个实施方案中，所述GS是家犬GS并且具有SEQ ID NO:2的序列。 [0014] 在本发明的又另一个实施方案中，所述CHO细胞系包含脱氧核糖核酸(DNA)表达载体，并且所述载体包含编码异源哺乳动物谷氨酰胺合成酶(GS)的核苷酸序列和至少一个用于表达重组蛋白的表达盒，其中已使所述编码GS的序列的三联密码子偏向于在CHO细胞中的表达。在本发明的另一个实施方案中，所述编码GS的序列包含与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的序列至少80％相同的序列。在本发明的特定实施方案中，所述编码GS的序列包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的序列。在本发明的另一个实施方案中，将所述编码人GS的序列置于猿猴空泡病毒40(SV40)启动子的调控之下，并且所述重组蛋白是单克隆抗体。 [0015] 在本发明的又另一个实施方案中，所述CHO细胞系包含脱氧核糖核酸(DNA)表达载体，并且所述载体包含编码异源哺乳动物谷氨酰胺合成酶(GS)的核苷酸序列和至少一个用于表达重组蛋白的表达盒，其中已使所述编码GS的序列的三联密码子偏向于在CHO细胞中的表达。在另一实施方案中，所述载体包含适用于克隆抗体轻链的第一表达盒和适用于克隆抗体重链的第二表达盒。在又另一个实施方案中，所述第一和第二表达盒各自包含CMV启动子，并且所述CHO细胞系能够在不含血清的培养基或不含血清且不含动物来源蛋白质的培养基中生长。 [0016] 在本发明的一个实施方案中，所述CHO细胞系是以保藏号CCL-61保藏在ATCC的细胞系或源自以保藏号CCL-61保藏在ATCC的细胞系。在本发明的另一个实施方案中，所述CHO细胞系在将所述载体转染至所述以保藏号CCL-61保藏在ATCC的CHO细胞系中时，允许获得产生至少1mg/L重组蛋白的克隆。 [0017] 在本发明的又另一个实施方案中，所述CHO细胞系包含脱氧核糖核酸(DNA)表达载体，并且所述载体包含谷氨酰胺合成酶(GS)核苷酸序列(即编码谷氨酰胺合成酶(GS)的核苷酸序列)和至少一个用于表达重组蛋白的表达盒。在一个实施方案中，所述载体不含用于表达重组蛋白的异源基因。在本发明的另一个实施方案中，所述载体含有至少一个编码重组蛋白的序列。在另一个实施方案中，所述载体含有编码重组蛋白的异源基因，所述重组蛋白是单克隆抗体。在本发明的另一个实施方案中，所述载体含有编码重组蛋白的异源基因，所述重组蛋白是用于诱导抗体应答的免疫原性蛋白质。在本发明的另一个实施方案中所述载体含有编码重组蛋白的异源基因，所述重组蛋白是用于酶替代疗法或用于工业用途的酶。 [0018] 本发明的一个实施方案提供脱氧核糖核酸(DNA)表达载体，并且所述载体包含在猿猴空泡病毒40(SV40)启动子调控下的编码谷氨酰胺合成酶(GS)的核苷酸序列和在CMV启动子调控下的适用于克隆异源重组蛋白的第一表达盒。在本发明的特定实施方案中，所述GS包含与SEQ ID NO:1的序列或与SEQ ID NO:2的序列至少94.5％相同的蛋白质序列；或SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的至少100个连续氨基酸的片段。 [0019] 本发明的另一个实施方案提供脱氧核糖核酸(DNA)表达载体，并且所述载体包含在猿猴空泡病毒40(SV40)启动子调控下的编码谷氨酰胺合成酶(GS)的核苷酸序列和在CMV启动子调控下的适用于克隆抗体轻链的第一表达盒和在CMV启动子调控下的适用于克隆抗体重链的第二表达盒。在本发明的特定实施方案中，所述GS包含与SEQ ID NO:1的序列或与SEQ ID NO:2的序列至少94.5％相同的蛋白质序列或SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的至少 100个连续氨基酸的片段。 [0020] 本发明的一个实施方案提供如图1中所限定的载体。 [0021] 本发明的一个实施方案提供产生重组蛋白的体外方法，所述方法包括如下步骤： 提供CHO细胞系；在适用于产生所述重组蛋白的条件下培养获得的所述CHO细胞系；并且分离和/或纯化所述重组蛋白。另一实施方案提供进一步的将所述重组蛋白配制成药物组合物的步骤。 [0022] 本发明的一个实施方案涉及以下各项的组合： [0023] i)真核细胞系(例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系)；和 [0024] ii)适用于产生重组蛋白的DNA载体，其中所述载体包含编码异源哺乳动物谷氨酰胺合成酶(GS)的序列(例如包含与SEQ ID NO:1的序列或与SEQ ID NO:2的序列至少94.5％相同的序列的GS)。 [0025] 本发明的另一方面涉及包含上述组合的试剂盒。 [0026] 本发明的又另一方面涉及这样的DNA载体。 [0027] 本发明的又另一方面涉及包含所述DNA载体的CHO细胞系。 [0028] 在又另一方面，本发明涉及产生重组蛋白的体外方法，所述方法包括如下步骤： [0029] a)提供如上文所限定的载体； [0030] b)用所述载体转染细胞系； [0031] c)将在步骤(b)获得的经转染的细胞系在适用于产生所述重组蛋白的条件下培养；并且 [0032] d)分离和/或纯化所述重组蛋白。 [0033] 本发明的又另一方面涉及这样的组合或这样的载体或这样的细胞系用于在体外产生重组蛋白的用途。 [0034] 本发明还涉及以下各项： [0035] 1.一种中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系，其包含脱氧核糖核酸(DNA)表达载体，并且其中所述载体包含编码异源哺乳动物谷氨酰胺合成酶(GS)的核苷酸序列和至少一种用于表达重组蛋白的表达盒，其中所述GS包含如下序列： [0036] -与SEQ ID NO:1的序列或与SEQ ID NO:2的序列至少94.5％相同的序列；或[0037] -由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的至少100个连续氨基酸的片段组成的序列。 [0038] 2.根据项1所述的CHO细胞系，其中所述GS包含与SEQ ID NO:1的序列并且与SEQ ID NO:2的序列至少94.5％相同的序列。 [0039] 3.根据项1或2所述的CHO细胞系，其中所述GS包含与SEQ ID NO:1的序列至少 97.5％相同的序列。 [0040] 4.根据项1-3中任一项所述的CHO细胞系，其中所述GS是人GS。 [0041] 5.根据项4所述的CHO细胞系，其中所述GS包含SEQ ID NO:1的序列。 [0042] 6.根据项1或2所述的CHO细胞系，其中所述GS是家犬GS。 [0043] 7.根据项6所述的CHO细胞系，其中所述家犬GS包含SEQ ID NO:2的序列。 [0044] 8.根据项1-7中任一项所述的CHO细胞系，其中已使所述编码GS的序列的三联密码子偏向于在CHO细胞中的表达。 [0045] 9.根据项1-8中任一项所述的CHO细胞系，其中所述编码GS的序列包含与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的序列至少80％相同的序列。 [0046] 10.根据项9所述的CHO细胞系，其中所述编码GS的序列包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的序列。 [0047] 11.根据项1-10中任一项所述的CHO细胞系，其中将所述编码人GS的序列置于猿猴空泡病毒40(SV40)启动子的调控之下。 [0048] 12.根据项1-11中任一项所述的CHO细胞系，其中所述重组蛋白是单克隆抗体。 [0049] 13.根据项12所述的CHO细胞系，其中所述载体包含适用于克隆抗体轻链的第一表达盒和适用于克隆抗体重链的第二表达盒。 [0050] 14.根据项13所述的CHO细胞系，其中所述第一和第二表达盒各自包含CMV启动子。 [0051] 15.根据项1-14中任一项所述的CHO细胞系，其中所述CHO细胞系能够在不含血清的培养基中生长。 [0052] 16.根据项1-15中任一项所述的CHO细胞系，其中所述CHO细胞系是以保藏号CCL- 61保藏在ATCC的细胞系。 [0053] 17.根据项1-16中任一项所述的CHO细胞系，其特征在于在将所述载体转染至所述以保藏号CCL-61保藏在ATCC的CHO细胞系中时，其允许获得产生至少1mg/L重组蛋白的克隆。 [0054] 18.根据项1-17中任一项的CHO细胞系，其中所述载体不含用于表达的异源基因。 [0055] 19.根据项1-18中任一项所述的CHO细胞系，其中所述载体包含至少一个编码重组蛋白的序列。 [0056] 20.根据项19所述的CHO细胞系，其中所述重组蛋白是单克隆抗体。 [0057] 21.根据项19所述的CHO细胞系，其中所述重组蛋白是抗原性蛋白。 [0058] 22.一种脱氧核糖核酸(DNA)表达载体，其中所述载体包含在猿猴空泡病毒40(SV40)启动子调控下的编码异源哺乳动物谷氨酰胺合成酶(GS)的核苷酸序列、在CMV启动子调控下的适用于克隆异源重组蛋白的第一表达盒，其中所述GS包含如下蛋白质序列： [0059] a)与SEQ ID NO:1的序列或与SEQ ID NO:2的序列至少94.5％相同的序列；或[0060] b)由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的至少100个连续氨基酸的片段组成的序列。 [0061] 23.根据项22所述的DNA载体，其中所述载体是如项20或21中所限定规定载体。 [0062] 24.一种脱氧核糖核酸(DNA)表达载体，并且其中所述载体包含在猿猴空泡病毒40(SV40)启动子调控下的编码异源哺乳动物谷氨酰胺合成酶(GS)的核苷酸序列、在CMV启动子调控下的适用于克隆抗体轻链的第一表达盒和在CMV启动子调控下的适用于克隆抗体重链的第二表达盒，其中所述GS包含如下蛋白质序列： [0063] a)与SEQ ID NO:1的序列或与SEQ ID NO:2的序列至少94.5％相同；或 [0064] b)由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的至少100个连续氨基酸的片段组成。 [0065] 25.一种以下的组合： [0066] i)中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系；和 [0067] i)适用于产生重组蛋白的DNA(脱氧核糖核酸)载体，其中所述载体包含编码异源哺乳动物谷氨酰胺合成酶(GS)的序列，其中所述GS包含如下序列： [0068] -与SEQ ID NO:1的序列或与SEQ ID NO:2的序列至少94.5％相同的序列；或[0069] -由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的至少100个连续氨基酸的片段组成的序列。 [0070] 26.一种试剂盒，其包含根据项25所述的组合。 [0071] 27.一种产生重组蛋白的体外方法，包括如下步骤： [0072] a)提供根据项1-21中任一项所述的CHO细胞系； [0073] b)在适用于产生所述重组蛋白的条件下培养获得的所述CHO细胞系；并且 [0074] c)分离和/或纯化所述重组蛋白。 [0075] 28.根据项27所述的方法，进一步包括将所述重组蛋白配制成药物组合物的步骤。 [0076] 29.根据项1-21中任一项所述的CHO细胞系或根据项22-24中任一项所述的载体或根据项25所述的组合用于在体外产生重组蛋白的用途。 附图说明 [0077] 图1显示实施例中使用的载体设计(pBH3695、pBH3700、pBH3694、pBH3699、pBH3698、pBH3697和pBH3623)。 [0078] 图2显示使用载体pBH3695、pBH3700、pBH3694、pBH3699、pBH3698、pBH3697和pBH3623转化的CHO细胞系所占孔数和实现的生产率。 [0079] 图3显示对于载体pBH3695、pBH3700和pBH3623，通过在图2所示实验期间获得的克隆实现的生产率。每个柱形代表一个克隆。 [0080] 图4显示在9E4细胞系中进行的实验的结果。显示获得的克隆的生产率和数目。横轴上的数字“0”表示没有获得克隆(对于pBH3700、pBH3694、pBH3697、pBH3698和pBH3699载体即为该情况)。 [0081] 图5显示SEQ ID NO:1的人GS、SEQ ID NO:2的家犬GS和SEQ ID NO:3的CHO GS之间的序列比对，所述比对使用“CLUSTAL 2.1多序列比对”程序进行。与CHO GS相比，在人GS中和在家犬GS中不同的残基用黑色箭头指出。这些残基对应于SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的残基12、16、18、19、33、49、80、82、91、116、191、269、282、350、355和356(分别对应于12G、 16V、18M、19S、33I、49S、80V、82A、91K、116T、191A、269Y、282Q、350S、355L和356I的氨基酸变化)。与家犬和CHO GS相比，在人GS中不同的残基用灰色箭头指出。这些残基对应于在SEQ ID NO:1的位置2、68、98、107、169、213处的残基(分别对应于2T、68L、98L、107R、169R和213S的氨基酸变化)。 [0082] 图6显示在用对照载体(对照1和对照2)以及用分别表达13C3和抗CD38抗体的pBH3695和pBH3772载体瞬时转染CHO-S细胞之后获得的抗体浓度。 [0083] 发明详述 [0084] 本发明的另一方面涉及以下各项的组合： [0085] i)真核细胞系；和 [0086] ii)适用于产生重组蛋白的DNA(脱氧核糖核酸)载体，其中所述载体包含编码异源哺乳动物谷氨酰胺合成酶(GS)的序列。 [0087] 所述真核细胞系可以例如是酵母细胞系(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)细胞系)、真菌细胞系(例如黑曲霉(Aspergillus niger)细胞系)、昆虫细胞系或哺乳动物细胞系(包括但不限于CHO细胞系、人细胞系如HEK293或PERC.6、小鼠细胞系如NS0和猴细胞系)。在具体的实施方案中，所述真核细胞系是CHO细胞系。所述由DNA载体编码的GS源自异源哺乳动物物种，并且可以例如源自人或家犬。 [0088] 在具体的实施方案中，所述异源哺乳动物GS包含如下序列或由如下序列组成： [0089] -与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2至少之一至少94.5％相同；并且/或者 [0090] -由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的至少100、150、200、250、300或350个连续氨基酸的片段组成。 [0091] 这种组合，下文称作“本发明的组合”，构成表达系统。 [0092] 更具体而言，本发明的一个方面涉及如下各项的组合： [0093] i)适用于产生重组蛋白的DNA载体，其中所述载体包含编码谷氨酰胺合成酶(GS)的序列；和 [0094] ii)中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系； [0095] 其中所述GS包含如下序列： [0096] -与SEQ ID NO:1的序列或与SEQ ID NO:2的序列至少94.5％相同；或 [0097] -由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的至少100、150、200、250、300或350个连续氨基酸的片段组成。 [0098] 本发明的组合可以例如以试剂盒的形式提供，例如其中一个小瓶包含所述DNA载体，且另一个小瓶包含所述细胞系。 [0099] 在将所述表达系统用于产生重组蛋白时，将所述载体引入所述细胞系(可以将其例如稳定地或瞬时地转染至所述细胞系中)。 [0100] 如此，本发明： [0101] -一方面涵盖其中所述载体存在于所述细胞系中的组合，且 [0102] -另一方面涵盖其中所述载体与所述细胞系分开的组合。 [0103] 1.本发明的载体 [0104] 用于本发明的组合中的DNA载体(下文称作“本发明的载体”)适用于产生重组蛋白，并且包含编码谷氨酰胺合成酶(GS)的序列。 [0105] 如用于本文，术语“谷氨酰胺合成酶”或“GS”指能够催化如通过以下生化反应代表的、形成谷氨酰胺的谷氨酸和氨的缩合反应的多肽： [0106] ATP+L-谷氨酸+NH3<＝>ADP+磷酸+L-谷氨酰胺 [0107] 这样的多肽归类在酶委员会(EC)编号6.3.1.2之下。能够催化上述反应的多肽展现“GS活性”。 [0108] 在本发明的框架内使用的GS(下文称作“本发明的GS”)可以包含下述序列或由下述序列组成：与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2至少之一至少94.5％、95％、95.5％、96％、 96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％或100％相同。实际上，已经发现这样的GS在CHO细胞中作为选择标记使用是有利的(参见实施例1)。其也可包含下述序列或由下述序列组成：SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2的至少100、150、200、250、300或350个连续氨基酸的片段，只要所述蛋白质保留其GS活性。 [0109] 在具体的实施方案中，根据本发明的GS包含与SEQ ID NO:1的序列并且与SEQ ID NO:2的序列二者至少94.5％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、 99％、99.5％或100％相同的序列或由与SEQ ID NO:1的序列并且与SEQ ID NO:2的序列二者至少94.5％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5％或 100％相同的序列组成。 [0110] 在具体的实施方案中，根据本发明的GS包含与SEQ ID NO:1的序列至少97.5％、 98％、98.5％、99％、99.5％或100％相同的序列或由与SEQ ID NO:1的序列至少97.5％、 98％、98.5％、99％、99.5％或100％相同的序列组成。这样的GS作为选择标记用于CHO细胞中(参见实施例1)，特别是用于E94CHO细胞系中(参见实施例2)是尤其有利的。 [0111] 在具体的实施方案中，根据本发明的GS是人GS，即人来源的GS。如用于本文，术语“人GS”指包含SEQ ID NO:1的序列或由SEQ ID NO:1组成的序列，以及它们展现GS活性的变体。这些变体可以例如对应于在人种中天然存在的变体(例如等位变体或剪接变体)。或者，这些变体可以对应于通过遗传工程获得的变体。最优选地，这些变体与SEQ ID NO:1的序列的区别仅在于如与SEQ ID NO:1相比存在至多22、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸变化(所述变化包括取代、插入和缺失)。 [0112] 在另一具体的实施方案中，根据本发明的GS是家犬GS，即，家犬来源的GS。如用于本文，术语“家犬GS”指包含SEQ ID NO:2的序列或由SEQ ID NO:2组成的序列，以及它们展现GS活性的变体。这些变体可以例如对应于在家犬种中天然存在的变体(例如等位变体或剪接变体)。或者，这些变体可以对应于通过遗传工程获得的变体。最优选地，这些变体与SEQ ID NO:2的序列的区别仅在于如与SEQ ID NO:2相比存在至多22、20、15、10、9、8、7、6、 5、4、3、2或1个氨基酸变化(所述变化包括取代、插入和缺失)。 [0113] 在具体的实施方案中，根据本发明的GS包含至少1、2、3、4、5、6、10、15、16、20或22个以下氨基酸：12G、16V、18M、19S、33I、49S、80V、82A、91K、116T、191A、269Y、282Q、350S、 355L、356I、2T、68L、98L、107R、169R和213S，其中所述数字表明在SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中的位置，且所述字母表明氨基酸的性质(使用单字母遗传代码)。在更具体的实施方案中，根据本发明的GS包含至少1、2、3、4、5或6个以下氨基酸：2T、68L、98L、107R、169R和 213S。在另一更具体的实施方案中，根据本发明的GS包含至少1、2、3、4、5、6、10、15或16个以下氨基酸：12G、16V、18M、19S、33I、49S、80V、82A、91K、116T、191A、269Y、282Q、350S、355L和 356I。如与CHO GS相比，上述氨基酸看上去对于人和/或家犬GS是特异性的(参见图5)。 [0114] 具有与本发明的查询氨基酸序列至少，例如，95％“相同”的氨基酸序列的多肽是指该主题多肽的氨基酸序列与查询序列相同，除了所述主题多肽序列可能包括所述查询氨基酸序列的每100个氨基酸至多五个氨基酸变化。换言之，为了获得具有与查询氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列的多肽，可以在所述主题序列中插入、缺失或以另外的氨基酸取代至多5％(100个中的5个)的氨基酸残基。 [0115] 在本申请的框架内，同一性百分比使用全局比对来计算(即，两个序列在其完整长度内进行比较)。用于比较两个或更多个序列的同一性或同源性的方法是本领域熟知的。例如，在进行全局比对时可以使用“Needle”程序，所述程序使用Needleman-Wunsch全局比对算法(Needleman and Wunsch,1970J.Mol.Biol.48:443-453)在考虑其完整长度的同时寻找两个序列的最优比对(包括缺口)。此Needle程序可在例如ebi.ac.uk万维网网站上获得。 根据本发明的同一性百分比优选使用EMBOSS::needle(全局)程序以等于10.0的“缺口开放”参数、等于0.5的“缺口延伸”参数和Blosum62矩阵计算。 [0116] 参照序列的变体可以包含与所述参照序列相比的突变，如缺失、插入和/或取代。 在取代的情况下，所述取代优选对应于如下表所示的保守取代。 [0117] [0118] 根据本发明的DNA载体包含编码根据本发明的这种GS的序列。编码根据本发明的这种GS的序列可以是天然存在的核苷酸序列。或者，编码这种GS的序列的三联密码子可以偏向于在CHO细胞中的表达。用于使序列产生偏向以获得最优表达的软件和算法是本领域已知的，并且包括，例如，在Raab等(2010,Syst Synth Biol.4:215-25)中记载的算法。此算法不仅提供最佳可用密码子用于表达，还考虑GC含量并且不存在不理想的DNA基序。 [0119] 例如，编码根据本发明的GS的序列可以包含或其组成为与SEQ ID NO:8的序列(即编码SEQ ID NO:1的人GS的序列，其经设计以供在CHO细胞中的最优表达)和/或与SEQ ID NO:9的序列(即编码SEQ ID NO:2的家犬GS的序列，其经设计以供在CHO细胞中的最优表达)至少80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％, 94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％相同的序列。 [0120] 在具体的实施方案中，编码根据本发明的GS的序列包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的序列或由所述序列组成。 [0121] 在根据本发明的DNA载体上，可以将编码根据本发明的GS的序列置于本领域技术人员已知的任何启动子的调控下。 [0122] 例如，可以将编码根据本发明的GS的序列例如置于猿猴空泡病毒40(SV40)启动子，例如SV40的晚期或早期启动子的调控下。早期SV40启动子例如记载在Benoist和Chambon(1981,Nature.290:304-10)以及在Moreau等(1981,Nucleic Acids Res.9:6047- 68)中。具体而言，所述SV40启动子是全长启动子。所述SV40启动子也可以具有含有72bp重复序列的复制起点。 [0123] 在具体的实施方案中，所述SV40启动子不是其中去除了128-270位的SV40启动子，即所述SV40启动子不是韩国专利10-0267720号中记载的并转化在1997年12月17日以保藏号KCTC 8860P保藏在Gene Bank,Institute of Bioengineering,KIST的大肠杆菌转化体的SV40启动子。 [0124] 在另一具体的实施方案中，不将编码根据本发明的GS的序列置于SV40启动子的调控下。 [0125] 适用于产生重组蛋白的DNA载体是本领域技术人员已知的。这些DNA载体通常对应于包含复制起点和至少一个表达盒的表达载体，允许希望产生的重组蛋白的克隆和表达。 表达盒通常包含5’非翻译区(包含启动子和任选地增强子或由它们组成)、一个或多个允许克隆编码重组蛋白的序列的限制位点、3’非翻译区(例如多聚A信号)和任选地一个或多个内含子。启动子序列可以对应于任何本领域熟知的强启动子，如例如人CMV启动子。根据本发明的载体可以例如具有如图1所示的结构，其在实施例1中更详细地得到阐释，条件是 13C3的重链和轻链可以用两个其他编码序列取代(例如，编码另一抗体的重链和轻链的序列)。 [0126] 所述重组蛋白可以对应于本领域技术人员感兴趣的任何蛋白。如用于本文，术语“蛋白/蛋白质”意在包含肽(即少于50个氨基酸的氨基酸链)、多肽(即至少50个氨基酸的氨基酸链)、单体蛋白(即由一条氨基酸链组成的蛋白质)和多聚体蛋白(即由两条或更多条氨基酸链组成的蛋白质，如例如单克隆抗体)。 [0127] 根据本发明的载体通常包含与构成所述蛋白质的不同氨基酸链数目相同的表达盒数目(例如，在单体蛋白或同二聚体蛋白的情况下为一个表达盒，在异二聚体蛋白或单克隆抗体的情况下为两个，等等)。 [0128] 或者，根据本发明的DNA载体可以仅包含一个表达盒，即使是在期望产生异二聚体蛋白或单克隆抗体时。在这样的情况下，编码所述蛋白质另外的氨基酸链的序列存在于与根据本发明的载体共转染至CHO细胞系中的单独表达载体中。 [0129] 在具体的实施方案中，根据本发明的DNA载体可以不含表达盒。在这样的情况下，适用于表达重组蛋白的表达盒存在于单独载体上，其与根据本发明的载体共转染至CHO细胞系中。 [0130] 在本说明书的全文中，术语“重组蛋白”指期望产生的任何重组蛋白。例如其能够对应于治疗和/或预防蛋白，即意图用作药物(包括疫苗)的蛋白质。在具体的实施方案中，所述期望产生的重组蛋白不是谷氨酰胺合成酶(GS)。在另一具体的实施方案中，所述期望产生的重组蛋白是抗体，例如单克隆抗体。在又一具体的实施方案中，所述期望产生的重组蛋白是抗原性蛋白。在又一具体的实施方案中，所述期望产生的重组蛋白不是促红细胞生成素(EPO)。 [0131] 术语“抗体”以最宽含义用于本文并具体涵盖任何同型如IgG、IgM、IgA、IgD和IgE的单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(包括双特异性抗体)、抗体片段(如例如Fv、scFv、dsFv、Fab、Fab’或F(ab’)2片段)和包含抗体片段的融合蛋白。与特定抗原反应的抗体能够通过重组方法产生，如选择噬菌体或类似载体中的重组抗体文库，或通过用所述抗原或抗原编码核酸免疫动物产生。 [0132] “单克隆抗体”，如用于本文，是从基本上均质的抗体群体获得的抗体，即形成此群体的抗体除了可能以小量存在的可能天然发生的突变之外实质上相同。这些抗体针对单一表位(或在多特异性单克隆抗体的情况下针对单一表位组)且因此是高特异性的。 [0133] 典型单克隆抗体包含通过二硫键结合的两条相同的重链和两条相同的轻链。每条重链和轻链含有恒定区和可变区。每个可变区含有三个称为“互补决定区”(“CDR”)或“超变区”的区段，其主要负责结合抗原的表位。它们通常称作CDR1、CDR2和CDR3，从N-端起顺序编号(参见Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th edition,National Institute of Health,Bethesda,MD,1991)。可变区中更高度保守的部分称作“框架区”。 [0134] 单克隆抗体可以例如是鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体或全人抗体。 [0135] 当期望产生的重组蛋白是单克隆抗体时，根据本发明的载体可以包含适用于克隆所述抗体轻链的第一表达盒，和适用于克隆所述抗体重链的第二表达盒。 [0136] 在具体的实施方案中，所述第一和第二表达盒各自包含巨细胞病毒(CMV)启动子，例如来自人或鼠CMV的CMV启动子。更具体而言，所述第一和第二表达盒可以包含： [0137] -CMV立即早期增强子启动子(例如具有Teschendorf或，2002,Anticancer Res.22:3325-30中描述的序列者)；或 [0138] -来自小鼠CMV的IE2启动子/增强子区(例如具有Chatellard或，2007,Biotechnol Bioeng.96:106-17中描述的序列者)；或 [0139] -hCMV-MIE调节元件(例如具有WO 89/01036中描述的序列者)。 [0140] 术语“抗原性蛋白”以最宽含义用于本文并涵盖能够单独或与佐剂组合产生免疫应答的任何蛋白质。其可能意图用于预防性疫苗中或治疗性疫苗中。在具体的实施方案中，抗原性蛋白是疫苗蛋白，即意图用于预防性疫苗中的蛋白质。 [0141] 在本发明的框架中，DNA载体可以包含至少一个编码感兴趣的重组蛋白的序列(例如编码单体蛋白的一个序列、编码抗体链的一个序列或分别编码抗体轻链和抗体重链的两个序列)，或其可能为空(即不含这种编码感兴趣的重组蛋白的序列)。 [0142] 在一个方面，本发明涉及根据本发明的载体本身。这样的载体优选意图用于CHO细胞系。然而，其也可以用于在其他真核细胞系如酵母、真菌、昆虫或哺乳动物(例如人、小鼠、猴等)细胞系中表达蛋白。 [0143] 2.本发明的细胞系 [0144] 在根据本发明的组合中使用的细胞系(下称为“本发明的细胞系”)是真核细胞系，例如哺乳动物细胞系如CHO细胞系。CHO细胞系常用于工业蛋白质生产，并且许多CHO细胞系是本领域技术人员已知的。例如，这些CHO细胞系包括，例如，CHO-K1细胞系(ATCC号：CCL- 61)、CHO DP-12细胞系(ATCC号CRL-12444和12445)和CHO 1-15细胞系(ATCC号CRL-9606)。 这些菌株可从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)公开获得。 [0145] 在具体的实施方案中，根据本发明的CHO细胞系能够在无血清培养基(例如化学限定培养基)中和/或悬浮液中生长。这样的细胞系能够容易地由本领域技术人员通过使亲本细胞系适应在无血清培养基中和/或在悬浮液中生长来获得(例如通过单细胞克隆，通过逐渐适应和/或通过“饥饿和挽救”过程)。 [0146] 根据本发明的CHO细胞系可以是GS缺陷细胞系或包含编码内源GS多肽的内源GS基因的细胞系。 [0147] 在具体的实施方案中，所述CHO细胞系是以保藏号CCL-61保藏在ATCC的细胞系。如用于本文，术语“以保藏号CCL-16包藏在ATCC的细胞系”一方面涵盖实际保藏在ATCC的亲本克隆，并且另一方面涵盖由其衍生的克隆，例如通过单细胞克隆、逐渐适应和/或通过“饥饿和挽救”过程。更具体而言，以保藏号CCL-61保藏在ATCC的细胞系可用于获得能够在无血清培养基中和/或在悬浮液中生长的克隆。 [0148] 在具体的实施方案中，根据本发明的组合的特征在于在将载体转染至以保藏号CCL-61保藏在ATCC的细胞系中时其允许获得产生至少1、2、3、4或5mg/L重组蛋白的克隆。 [0149] 在另一方面，本发明涉及包含根据本发明的载体的CHO细胞系。优选地，将所述CHO细胞系用所述载体转染(稳定或瞬时转染)。更优选地，所述CHO细胞系包含整合至其基因组的所述载体。 [0150] 更具体而言，本发明涉及包含DNA表达载体的CHO细胞系，并且其中所述载体包含编码异源哺乳动物谷氨酰胺合成酶(GS)的核苷酸序列和至少一个用于表达重组蛋白的表达盒，其中所述GS包含如下蛋白序列： [0151] a)与SEQ ID NO:1的序列或与SEQ ID NO:2的序列至少94.5％相同；或 [0152] b)由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的至少100个连续氨基酸的片段组成。 [0153] 3.本发明的试剂盒、方法和用途 [0154] 本发明的一个方面涉及包含根据本发明的组合或由本发明的组合组成的试剂盒。 在这样的试剂盒中，载体优选是空载体，因为这允许本领域技术人员克隆感兴趣的蛋白质。 此外，在这样的试剂盒中DNA载体优选与细胞系隔开。所述试剂盒可进一步包含适用于培养所述细胞系的培养基、适用于将所述载体转染至细胞系中的培养基和/或关于所述表达系统的使用说明。 [0155] 本发明的另一方面涉及本发明的组合产品、或本发明的载体，或本发明的细胞系用于在体外产生重组蛋白的用途。 [0156] 本发明的又另一方面涉及产生重组蛋白的体外方法，所述方法包括以下步骤或由以下步骤组成： [0157] a)提供根据本发明的组合； [0158] b)用所述DNA载体转染所述细胞系； [0159] c)在适于产生所述重组蛋白的条件下培养在步骤(b)获得的经转染细胞系；和[0160] d)分离和/或纯化所述重组蛋白。 [0161] 对于本领域技术人员显而易见的是，以上方面涉及根据本发明的组合，其中在步骤(a)所述DNA载体与所述细胞系隔开。 [0162] 本发明的又一方面涉及产生重组蛋白的体外方法，所述方法包括以下步骤或由以下步骤组成： [0163] a)提供根据本发明的组合； [0164] b)在适于产生所述重组蛋白的条件下培养经转染细胞系；和 [0165] c)分离和/或纯化所述重组蛋白。 [0166] 对于本领域技术人员显而易见的是，以上方面涉及根据本发明的组合，其中在步骤(a)所述细胞系包含DNA载体(例如所述细胞系之前已经用所述DNA载体转染)。 [0167] 本发明的又一方面涉及产生重组蛋白的体外方法，所述方法包括以下步骤或由以下步骤组成： [0168] a)提供根据本发明的载体，其中所述载体包含至少一个编码重组蛋白的序列； [0169] b)用所述载体转染根据本发明的细胞系； [0170] c)在适于产生所述重组蛋白的条件下培养在步骤(b)获得的经转染细胞系；和[0171] d)分离和/或纯化所述重组蛋白。 [0172] 适于产生重组蛋白的条件是本领域技术人员熟知的。例如可以使用在实施例中描述的方案(protocol)。 [0173] 在具体的实施方案中，在培养根据本发明的细胞系时添加GS抑制剂如甲硫氨酸砜亚胺(methionine sulphoximine；msx)或膦丝菌素(phophinothricin)。在更具体的实施方案中，在培养所述细胞系时添加逐渐增加浓度的这类GS抑制剂。这允许选择其中载体衍生的GS基因(并因此编码所述重组蛋白的序列)已经得到扩增的克隆。 [0174] 以上方法可进一步包括将重组蛋白配制成药物组合物的步骤。 [0175] 本发明的又一方面涉及共扩增编码重组蛋白的重组DNA序列的方法，包括以下步骤或由以下步骤组成： [0176] a)提供根据本发明的载体，其中所述载体包括编码所述重组蛋白的序列； [0177] b)提供根据本发明的细胞系； [0178] c)用所述载体转染所述细胞系；和 [0179] d)在允许选择含有扩增拷贝数的编码GS的载体衍生序列的转化体的条件下培养所述经转染的细胞系，其中所述转化体还含有扩增拷贝数的编码重组蛋白完整氨基酸序列的序列。 [0180] 以上方法的步骤(d)可以包括在含有GS抑制剂的培养基中培养经转染的细胞系和选择对逐渐增加水平的GS抑制剂有抗性的转化体细胞。所述含有GS抑制剂的培养基可进一步含有甲硫氨酸，由此能够降低所述培养基中的GS抑制剂浓度。 [0181] 本发明还涉及在共转化过程中使用DNA载体作为显性选择标记的方法，其中所述方法包括以下步骤或由以下步骤组成： [0182] a)提供根据本发明的载体，其中所述载体包含编码重组蛋白的序列； [0183] b)提供根据本发明的细胞系； [0184] c)用所述载体转染所述细胞系；和 [0185] d)选择对GS抑制剂有抗性的转化体细胞，由此选择其中编码GS的、载体衍生的重组DNA序列充当显性选择标记和共扩增标记的转化体细胞。 [0186] 在以上试剂盒和方法的具体实施方案中，所述细胞系是CHO细胞系。 [0187] 在具体的实施方案中，根据本发明的组合或根据本发明的载体、或根据本发明的细胞系的使用与使用CHO来源的GS时相比，允许(i)增加表达所述重组蛋白的克隆，和/或(ii)增加所述重组蛋白的产生。 [0188] 在本说明书的整篇文本中引用了数篇文件。此处的每篇文件(包括任何期刊文章或摘要、公开或未公开的专利申请、授权专利、制造商的说明书、使用说明等)通过提述并入本文。然而，并非认可此处引用的文件事实上是本发明的现有技术。 [0189] 将参考以下附图和实施例进一步说明本发明，所述附图和实施例仅用作说明，而无意限制本发明。事实上，本发明通过权利要求来限定，应借助于说明书和附图来解释权利要求。 [0190] 序列简述 [0191] SEQ ID NO:1显示人来源GS的氨基酸序列。 [0192] SEQ ID NO:2显示家犬来源GS的氨基酸序列。 [0193] SEQ ID NO:3显示中国仓鼠来源GS的氨基酸序列。 [0194] SEQ ID NO:4显示酵母来源(酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))的GS的氨基酸序列。 [0195] SEQ ID NO:5显示源自蟾蜍(非洲爪蟾(Xenopus laevis))的GS的氨基酸序列。 [0196] SEQ ID NO:6显示源自植物(拟南芥(Arabidopsis thaliana))的GS的氨基酸序列。 [0197] SEQ ID NO:7显示源自昆虫(黑腹果蝇(Drosophila melanogaster))的GS的氨基酸序列。 [0198] SEQ ID NO:8显示编码人来源的GS的核苷酸序列。 [0199] SEQ ID NO:9显示编码家犬来源的GS的核苷酸序列。 [0200] SEQ ID NO:10显示编码中国仓鼠来源的GS的核苷酸序列。 [0201] SEQ ID NO:11显示编码酵母来源(酿酒酵母)的GS的核苷酸序列。 [0202] SEQ ID NO:12显示编码源自蟾蜍(非洲爪蟾)的GS的核苷酸序列。 [0203] SEQ ID NO:13显示编码源自植物(拟南芥)的GS的核苷酸序列。 [0204] SEQ ID NO:14显示编码源自昆虫(黑腹果蝇)的GS的核苷酸序列。 实施例 [0205] 实施例1：鉴定GS产生方面的改进结果 [0206] 发明人的目的在于开发用于在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系中表达和产生重组蛋白的新载体。如下文所述设计了一组七种载体。 [0207] 使用两种编码13C3抗体人源化形式的cDNA(分别为一种编码13C3重链的cDNA和另一种编码13C3轻链的cDNA，所述链的组合形成该人源化13C3抗体)作为报道子以供评估载体质量。鼠13C3抗体是特异性结合人β-淀粉样蛋白的初原纤维(protofibrillar)形式的抗体，如WO 2009/065054中所记载。如进一步用于本文，术语“13C3”指鼠13C3抗体的人源化形式。 [0208] 所述七种载体示意性地呈现于图1。这八种载体全部包含： [0209] -编码GS的序列，置于早期SV40启动子的调控下； [0210] -第一表达盒，其中将编码13C3抗体轻链的序列置于CMV启动子的调控下； [0211] -第二表达盒，其中将编码13C3抗体重链的序列置于CMV启动子的调控下； [0212] -原核复制起点； [0213] -真核复制起点；和 [0214] -供原核细胞中使用的选择标记，即编码赋予氨苄青霉素抗性的蛋白质的序列，将其置于其天然启动子的调控下。 [0215] 更具体地，将编码GS的序列置于SV40启动子(包括SV40增强子)的调控下。这种SV40早期启动子含有与21-bp非串联重复序列连接的SV40 72-bp串联重复增强子，和SV40早期前导蛋白序列，不包括任何编码序列。该区作为强启动子的用途由Benoist和Chambon描述(1981,Nature.290:304-10)并且记载于Moreau等(1981,Nucleic Acids Res.9:6047- 68)。其一般用作启动子以供在哺乳动物细胞中表达选择标记。在pBH3694到pBH3700七种载体中，在该启动子区的5’和3’端添加破坏的天然HindIII限制位点和独特限制位点(SalI和XmaI)，以这样的方式允许不同GS cDNA的方便交换。 [0216] 七种载体彼此的区别在于编码GS的序列。实际上，将编码具有不同来源的GS的序列克隆至所述载体中。 [0217] 更具体而言，使用在公共数据库中可以获得的天然存在的氨基酸序列生成了分别编码来自中国仓鼠(黑线仓鼠(Cricetulus griseus))、人(智人(Homo sapiens))、家犬(Canis lupus)、酵母(酿酒酵母)、果蝇(黑腹果蝇)、植物(拟南芥)和蟾蜍(非洲爪蟾)的七种cDNA。从这些序列出发，使用CHO中使用频率最高的密码子矩阵逆向翻译了蛋白质。之后，将cDNA修饰以含有适当的克隆位点并优化核苷酸序列。值得注意的是，在优化核苷酸序列用于CHO表达的同时，使编码蛋白质的氨基酸序列保持与天然编码蛋白犬的氨基酸序列相同。 [0218] 更具体而言，不同GS的天然存在编码序列是在不同公共cDNA文库中挑选的。例如，使用NCBI参考号NM_002065.5用于人GS。NCBI参考号NM_001002965.1用于家犬GS。NCBI参考号NM_078568.2用于果蝇GS。编码酵母GS的序列是可在yeastgenome.org获得的万维网站点上找到的(参考号YPR035W)。中国仓鼠GS氨基酸序列对应于NCBI参照序列：XP_003502909.1(REFSEQ:登录号XM_003502861.1)中所示的序列。从所述天然存在的cDNA序列出发，使用由Wagner和同事们开发的软件使编码这样的GS的序列的三联密码子偏向于在CHO细胞中的表达，所述软件基于Raab等(2010,SystSynth Biol.4:215-25)中描述的算法。这种技术不仅为表达提供了最佳的可用密码子，还考虑了GC含量并且不含不想要的DNA基序。 [0219] 将获得的cDNA克隆至含有13C3抗体表达盒的骨架中，由此生成图1中所呈现的载体。 [0220] 这些载体的名称以及编码GS的来源和序列示于下表中。 [0221] 名称 GS来源 GS的氨基酸序列 GS的核苷酸序列 pBH3695 人 SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:8 pBH3700 家犬 SEQ ID NO:2 SEQ ID NO:9 pBH3623 CHO SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:10 pBH3694 酵母 SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:11 pBH3699 蟾蜍 SEQ ID NO:5 SEQ ID NO:12 pBH3698 植物 SEQ ID NO:6 SEQ ID NO:13 pBH3697 果蝇 SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:14 [0222] 使用经典条件将上述载体核穿孔(nucleoporated)至CHO细胞系中。转染之后24小时，将约2000个细胞接种到96孔板的480至960个孔中，每个孔包含含有浓度为25μM的甲硫氨酸砜亚胺(msx)的200μl CD-CHO培养基。 [0223] 接种后约20天，将孔中的培养基更换为新鲜的并且是选择性的培养基(与如上所述相同)。 [0224] 四天之后，对占用数(the number of occupied)进行计数，即计数含有生长中的克隆的孔的数量。使用由Cisbio Bioassays(Bagnols/Ceze，法国)开发的均相时间分辨荧光(HTRF)技术对来自占用孔的每个上清液测试其13C3抗体生产率。 [0225] 结果示于图2和图3。从这些附图中能够得到的结论是两种载体，即pBH3695和pBH3700，得到了比其他载体更好的结果。它们允许既获得更多的克隆，又获得更好的生产率。 [0226] 测试的不同GS序列之间的同一性百分比示于以下三个表格中。这些同一性百分比使用EMBOSS Needle程序使用以下缺省参数计算： [0227] -矩阵：EBLOSUM62； [0228] -缺口罚分(Gap_penalty)：10.0；和 [0229] -延伸罚分(Extend_penalty)：0.5。 [0230] [0231] [0232] [0233] 从这些表格能够得到的结论是生成最佳结果的两个序列，即人和家犬GS，的特征在于它们的序列与SEQ ID NO:1和/或2的序列展现至少94.5％的同一性。测试的其他GS的序列不符合该特征，导致了不及最优的结果。 [0234] 实施例2：在第二种CHO细胞系中确认使用编码人GS的载体的有利性质 [0235] 使用称作“9E4”的CHO细胞系重复了上述实验，所述细胞系适用于工业生产重组蛋白。 [0236] 9E4细胞系是从CHO-K1细胞系的克隆通过单细胞克隆过程建立的。CHO-K1细胞系由Puck在1957年获得，并且已经以保藏号CCL-61保藏在ATCC。CHO 9E4细胞系看上去表达内源的且为功能性的GS蛋白，因为这种细胞系能够在不存在谷氨酰胺时生长。因而应优选使用甲硫氨酸砜亚胺(msx)来选择转染的克隆。 [0237] 将所述载体通过核穿孔引入9E4细胞系。第一个实验使用实施例1中构建的六种载体(即pBH3695、pBH3700、pBH3694、pBH3697、pBH3698和pBH3699)进行。选择条件与实施例1中描述的条件相同(以25μM的浓度添加msx)。占用孔的数量和13C3抗体的浓度如实施例1中所述的测量。结果示于图4中。 [0238] 在9E4细胞系中，pBH3695是唯一能够生成产生13C3抗体的克隆的载体。这种质粒是携带编码人GS的cDNA的质粒，其中三联密码子偏向于CHO细胞中的表达。因此包含编码人GS的序列的载体的使用对于在CHO细胞系中产生重组蛋白尤其有利。 [0239] 实施例3：使用基于人GS和人CMV启动子的pBH载体在HEK 293中瞬时表达X14[0240] 在本实验中，使用了含有置于SV40启动子调控下的序列SEQ ID NO:1的人GS，和含有在人CMV启动子调控下的编码人或小鼠X14受体(也称C-型凝集素结构域家族14，成员A(CLEC14A)的cDNA，并且分别具有NCBI参考号NP_778230.1和NP_080085.3)和多腺苷酸化位点的单一表达盒的载体。含有编码人X14受体的cDNA的载体即下文的pBH4590载体，而含有编码小鼠X14受体的cDNA的载体在下文称为pBH4589载体。 [0241] 将pBH4590载体、pBH4589载体或对照载体(即无关的质粒载体)通过用Jet PEI转染引入HEK 293-FS细胞，如制造商Poly Plus转染所述。 [0242] 在转染之后24小时通过免疫荧光、流式细胞术或免疫细胞化学在针对人或小鼠X14检测适当标记之后分析所述细胞。 [0243] 免疫荧光检测 [0244] 对于免疫荧光检测，将经转染的细胞离心沉降并弃去其上清液。将细胞沉淀重悬在含有1％牛血清白蛋白(W/V)和0.1％吐温(V/V)的PBS缓冲液(PBS T BSA)中，并在该缓冲液中浸透(saturated)10分钟。将细胞用相同的缓冲液洗涤两次，并与第一血清1(即在免疫动物之前不久获得的血清，称为代表阴性对照的血清免疫前血清)或血清2(即作为在免疫动物之后获得的未纯化免疫血清的血清)和以(PBS T BSA)缓冲液中1/5000稀释的如下所述的纯化X14人细胞外域一起在室温温育10分钟。 [0245] 在洗去未结合的第一抗体之后，添加与Alexa荧光团(来自Invitrogen的Alexa 488nm Ref A11034)连接的第二山羊抗兔抗体。使用设置用于检测Alexa488nm的Leica荧光显微镜实施免疫荧光。 [0246] 分别用对照质粒和血清1或用对照质粒和血清2均不能观察到背景Alexa 488荧光。这说明不存在背景非特异性荧光。与之相对，在用pBH4590和pBH4589载体转染的细胞的质膜上出现了强Alexa 488荧光。因此使用包含编码人GS的序列的载体尤其有利于促进膜结合蛋白的瞬时转染。 [0247] 流式细胞术检测 [0248] 对于流式细胞术检测，通过与三种不同抗体制备物和第二抗体抗兔IgGFc部分的两次系列温育实现了人X14标记。用三种不同稀释(1/5000、1/1000、1/500)的抗-X14血清分析了两种转染的细胞系： [0249] ·血清1，在免疫动物之前不久获得，称为代表阴性对照的血清免疫前血清，[0250] ·血清2，其为未纯化的免疫血清，并且在用纯化的X14人细胞外域免疫动物之后获得， [0251] ·血清3，其对应于血清2的免疫球蛋白部分，针对X14人凝集素。 [0252] 在洗去未结合的第一抗体之后，添加了与Alexa荧光团(来自Life Technologies的Alexa 488nm，目录号A-11034)连接的第二山羊抗兔抗体。使用设置用于检测Alexa 488与分别来自血清1、2和3的三种不同稀释的流式细胞术分析经转染的细胞。 [0253] 值得注意的是所有直方图呈现单一的荧光峰，说明均质的细胞群体。该峰的中值荧光强度在102和103荧光单位之间。然而，与稀释至1/500e的血清2温育的细胞呈现约1000荧光单位的中值荧光强度。这种最小背景强度适合于研究质膜处的检测。以采取使用对照载体和稀释至1/5000e的血清1观察到的荧光作为背景参照荧光的方式校准流式细胞仪。 [0254] 然后分析用pBH4590载体转染的细胞。对于每种稀释，用血清1的人X14转染细胞的荧光密度与对照细胞的信号相似。与之相对，对于血清2和纯化的多克隆抗体(血清3)，其荧光信号比免疫前血清(血清1)的荧光信号显著更强。事实上，免疫血清(血清2)和纯化抗体(血清3)对人X14转染细胞的中值免疫荧光强度为104荧光单位。其在测试的特异性抗血清的三种浓度下增加了10-20倍。 [0255] 这些结果证明在用pBH4590载体转染的HEK 293-FS细胞中，以可清楚检测的水平产生了人X14，如通过荧光显微术和流式细胞术所观察到的。另外，人X14通过细胞外检测可及说明其在质膜处表达。 [0256] 实施例4：人和鼠X14受体在CHO细胞中的表达 [0257] 本实验的目的是测试用于瞬时人或小鼠X14表达的相同载体是否能够作为小鼠或人X14受体的稳定克隆用于在CHO细胞中的表达。为此使用Lonza/Amaxa核穿孔设备开发的方案，将携带人GS cDNA的pBH4590载体或pBH4589载体转染至CHO-9E4细胞系中。将两百万CHO-9E4细胞用10μg的如上所述pBH4590载体或pBH4589载体电穿孔。在电击之后不久，将细胞稀释到2ml CD-CHO新鲜培养基中，并在24小时之后再次将细胞以每毫升10000个细胞的浓度稀释到含有25μM甲硫氨酸砜亚胺(methyl sulfoximide(msx))的新鲜的CD-CHO培养基中。将约10个96孔平板按每孔2000个细胞进行接种。 [0258] 将在用pBH4590载体或pBH4589载体转染CHO细胞之后获得的CHO半克隆使用选择标记GS筛选。还进行了使用表达抗体13C3的参考对照的转染。使用所述对照作为用于通过流式细胞仪的分析的对照。获得了30个人X14半克隆、41个小鼠X14半克隆和29个对照载体的半克隆。 [0259] 在24孔板中进行半克隆的传代之后，即在扩增过程开始之初，使用前文所述手段对人或小鼠X14抗原的存在与否进行了检测。 [0260] 例如，观察到了人半克隆12号具有低于鼠半克隆30号的荧光强度。事实上，使用鼠半克隆，观察到了具有103荧光单位的最大荧光强度的单一峰值荧光的存在，而在人半克隆的情况下，峰是展开的(peak is spread)并且平均荧光强度不超过500荧光单位。 [0261] 对通过流式细胞术分析为阳性的半克隆进行了扩增，从而允许最终产生稳定表达X14鼠凝集素的CHO品系的10个半克隆和稳定表达X14人凝集素的CHO品系的4个半克隆。 [0262] 因此包含编码人GS的序列的载体的使用尤其有利于生成稳定表达重组蛋白的CHO品系。 [0263] 实施例5：编码两种不同抗体的不同DNA质粒在CHO-S中的瞬时转染 [0264] 为了研究使用我们携带人GS cDNA的载体用于CHO-S中瞬时转染的可行性，通过使用经典克隆技术和四个不同的独特限制位点用抗CD38cDNA的轻链和重链代替对应于13C3抗体的轻链和重链的两个cDNA构建了称为源自pBH3695的第二载体。因此，pBH3772载体包含： [0265] -编码GS的序列，其置于早期SV40启动子的调控下； [0266] -第一表达盒，其中编码抗CD38抗体的轻链的序列置于CMV启动子的调控下； [0267] -第二表达盒，其中编码抗CD38抗体的重链的序列置于CMV启动子的调控下； [0268] -原核复制起点； [0269] -真核复制起点；和 [0270] -供原核细胞中使用的选择标记，即编码赋予氨苄青霉素抗性的蛋白质的序列，将其置于其天然启动子的调控下。 [0271] 然后使用 装置用(i)经典用于瞬时转染并且含有两种不同抗体的轻链 和重链的cDNA的两种对照载体(即称作对照1和对照2)，和(ii)pBH3695和pBH3772载体在由公司描述的条件下转染CHO-S。将CHO0S细胞在含有8mM谷氨酰胺的CD-CHO中在 经典CHO-S培养条件下(每2-3天以0.3x106细胞/ml传代)培养。在转染的前日，将细胞分为 1.2x106细胞/ml并且在24小时之后转染。根据 规程进行温度转换和培养基补 料。在第3、6、7、8和9天取培养物样品，并使用纯化抗体作为标准参照曲线通过SEC-HPLC测量。 [0272] 这一实验的结果示于图6。 [0273] 从该图中可以得到结论，pBH3695和pBH3772载体能够以与经典用于瞬时转染的两种对照载体相比等同或更好的水平产生抗体。 [0274] 综上，基于人谷氨酰胺合成酶的pBH3695和pBH3772两种载体能够产生100mg/l以上令人瞩目的水平的抗体。 [0275] 因此使用包含编码人GS的序列的载体对于稳定或瞬时表达膜结合蛋白或抗体尤其有利。 [0276] 实施例6：人促红细胞生成素(EPO)在CHO细胞中的表达 [0277] 为了进行人EPO的表达，将pBH4590载体用限制酶NheI和EcoRI消化，并将两种以NheI和EcoRI位点为边界的人EPO cDNA，即cDNA1或cDNA2，使用经典分子生物学技术插入所述载体。 [0278] 这允许获得携带人EPO cDNA1的pBH4614载体和携带人EPO cDNA2的pBH4615载体。 [0279] 使用Qiagen公司开发的试剂盒以大量制备水平(maxi-preparation level)制备两种载体。 [0280] 使用Lonza电穿孔技术用pBH4614和pBH4615载体分别转染CHO-S、CHO-9E4和CHO30D12三种细胞系。为此，在转染前日将细胞分开以达到1x106细胞/ml的细胞密度。对于每种DNA和细胞系，分别将两百万细胞离心沉降，再在10μg DNA存在下悬浮于100μl溶液V中。使用程序X05电穿孔细胞。电穿孔之后迅速将细胞稀释到含有6mM谷氨酰胺(Life Technologies)的2mol CD-CHO培养基中，并在37℃和5％CO2下温育24小时。此次温育之后，将细胞稀释到200ml不含谷氨酰胺并存在25μM msx的相同培养基中，并使用每孔200μl分配到96孔板中。在15(CHO-S)至25天(CHO-9E4，CHO 30D12)之后，将含有存活细胞的孔中换成新鲜培养基。4至5天之后，在不搅拌的情况下分别将每个孔的存活细胞转移至含有25μM msx的1ml CD-CHO中。对于CHO-S，扩增24个半克隆，同时对于两个其他细胞系分别对于两个EPO cDNA扩增了12个半克隆。对总共96个半克隆进行了扩增、培养并验证了它们产生人促红细胞生成素能力。为此，在3-4天的温育之后，将1ml稀释到含有25μM msx的4ml CD-CHO培养基中并置于37℃和5％CO2的搅拌下。3-4天之后，将培养物再次用5ml新鲜培养基稀释。3- 4天之后，测量细胞密度并将细胞以3x105细胞/ml稀释并首次培养3-4天。测量细胞密度并将细胞以3x105细胞/ml接种至含有25μM msx和30％补料B(Life Technologies)的CD-CHO培养基中。 [0281] 使细胞在10ml上述培养基中(37℃5％CO2)生长10天。在8和10天之后测量细胞密度和存活率。首先使用微流体校准技术(microfluidic Caliper technology)筛选培养物上清液(0.6ml)，以人EPO的表观分子量评估蛋白质的存在。 [0282] 将16个最佳克隆上清液，例如具有最强EPO信号的，提交至特别针对人EPO检测的ELISA，其使用R&D 开发用于体外诊断的试剂盒(用于体外诊断应用的人促红细胞 生成素 IVD ELISA试剂盒，目录号DEP00)。如在第8天和第10天所测量的，显 示7个克隆具有令人感兴趣的生产率(下表)。 [0283] [0284] 所述克隆的生产率范围在0.3至2.0g/l。半克隆90是最佳生产克隆，在第8天和第 10天分别具有1.1至2.0g/L的生产率。 [0285] 该克隆在第10天的存活率为大约70％，每ml少于一百万个细胞(八十万个细胞/ml)，使其不可能计算具体的生产率，因为细胞数在第8天和第10天之间减少。这使其不可能计算比活性(下表)。对于大多数半克隆观察到了这种现象，除了半克隆21、24、92和93。在那些情况下，以μg/106细胞/天表述的比生产率能够达到高达441和854(下表)。 [0286] [0287] 因此，这些结果证明了根据体积或比生产率二者，包含编码人GS的序列的载体的使用均允许具有每百万细胞300μg蛋白质以上的生产率。