技术领域
[0001] 本实用新型涉及试剂盒或试剂箱，具体地说，本实用新型涉及一种构建嵌合抗原受体修饰的T细胞的试剂盒。
相关背景技术
[0002] 在国际上，一种新型的过继细胞免疫治疗技术异军突起，这就是应用嵌合抗原受体基因修饰的T细胞过继性地靶向性治疗肿瘤的研究，该研究在临床上取得了非常显著的进展。最为代表性的是以CD19为靶向的CAR-T细胞治疗CD19阳性的B细胞白血病和淋巴瘤的基础和临床研究。June等发表在NEJM的报道显示：应用CD19CAR-T细胞治疗的三例白血病患者取得显著的效果(两例患者完全治愈，一例患者基本缓解)。目前，至少有5个在美国的研究组在进行此临床治疗研究。
[0003] 随着过继细胞免疫治疗技术的普及，本领域中迫切需要一种能够快速构建嵌合抗原受体修饰的T细胞的试剂盒。实用新型内容
[0004] 本实用新型的目的在于提供一种构建嵌合抗原受体修饰的T细胞的试剂盒，以解决快速、便捷、高效地制备嵌合抗原受体修饰的T细胞的技术问题。
[0005] 本实用新型提供了一种构建嵌合抗原受体修饰的T细胞的试剂盒，所述试剂盒包括盒体、可开启的盒盖以及储存单元，所述存储单元位于所述盒体内部，所述储存单元包括细胞储存单元、慢病毒包装系统储存单元和嵌合抗原受体载体储存单元，[0006] 所述细胞储存单元的总容量为0.5ml-5ml(优选为1ml-2ml)；
[0007] 所述慢病毒包装系统储存单元的总容量为10μL-1000μL(优选为100μL-500μL)；
[0008] 所述嵌合抗原受体载体储存单元的总容量为10μL-1000μL(优选为100μ L-500μL)。
[0009] 在另一优选例中，所述盒体内部装有固定板，所述细胞储存单元、所述慢病毒包装系统储存单元和所述嵌合抗原受体载体储存单元可拆卸地固定于所述固定板上。
[0010] 在另一优选例中，所述细胞储存单元中储存有293T细胞。
[0011] 在另一优选例中，所述慢病毒包装系统储存单元中包括相互独立的Rev质粒试剂瓶、VSV-G质粒试剂瓶和△R质粒试剂瓶。
[0012] 在另一优选例中，所述Rev质粒试剂瓶储存有Rev质粒；VSV-G质粒试剂瓶容储存有VSV-G质粒；△R质粒试剂瓶储存有△R质粒。
[0013] 在另一优选例中，所述嵌合抗原受体载体储存单元中储存有嵌合抗原受体载体。
[0014] 在另一优选例中，所述嵌合抗原受体载体可以为已知的嵌合抗原受体慢病毒载体。
[0015] 在另一优选例中，所述嵌合抗原受体载体储存单元中包括1-5个嵌合抗原受体载体试剂瓶，优选地，每个嵌合抗原受体载体试剂瓶的容量为10ul-100ul(优选为50-100ul)。
[0016] 在另一优选例中，所述细胞储存单元包括1-5个细胞试剂瓶，各所述细胞试剂瓶的容量为0.5ml-1.5ml，优选为1-2ml。
[0017] 在另一优选例中，所述Rev质粒试剂瓶、VSV-G质粒试剂瓶和△R质粒试剂瓶的容量为10μL-100μL，优选为50-100μL。
[0018] 在另一优选例中，所述试剂盒还包括细胞分离试剂储存单元。细胞分离试剂为用于从外周血中分离PBMC的试剂。
[0019] 在另一优选例中，所述细胞分离试剂储存单元包括Ficoll-Paque Plus试剂容器，优选地，所述Ficoll-Paque Plus试剂瓶中存储有Ficoll-Paque Plus试剂。
[0020] 在另一优选例中，所述试剂盒还包括限制性内切酶储存单元。
[0021] 在另一优选例中，所述限制性内切酶储存单元包括EcoRI酶试剂瓶和NotI酶试剂瓶。
[0022] 在另一优选例中，所述固定板上设置有孔或凹槽，所述细胞试剂瓶、慢病毒包装系统试剂瓶(Rev质粒试剂瓶、VSV-G质粒试剂瓶和△R质粒试剂瓶)、和嵌合抗原受体载体试剂瓶置于所述孔或凹槽内。
[0023] 在另一优选例中，所述固定板设有：
[0024] 第一凹槽组，所述第一凹槽组用于安放所述细胞储存单元；
[0025] 第二凹槽组，所述第二凹槽组用于安放所述慢病毒包装系统储存单元；和[0026] 第三凹槽组，所述第三凹槽组用于安放所述嵌合抗原受体载体储存单元。
[0027] 在另一优选例中，所述固定板上还设有第四凹槽组，所述第四凹槽组包含2个第四凹槽，用于放置EcoRI酶试剂瓶和NotI酶试剂瓶。
[0028] 在另一优选例中，所述固定板上还设有第五凹槽，所述第五凹槽用于放置Ficoll-Paque Plus试剂容器。
[0029] 在另一优选例中，所述第一凹槽组包含1-5个第一凹槽，如1、2、3、4、5个第一凹槽。
[0030] 在另一优选例中，所述第二凹槽组包含1-5个第二凹槽，如1、2、3、4、5个第二凹槽。
[0031] 在另一优选例中，所述第三凹槽组包含1-3个第三凹槽，如1、2、或3个第二凹槽。
[0032] 在另一优选例中，所述试剂瓶为密封无菌试剂瓶。
[0033] 在另一优选例中，所述试剂瓶为锥形底、圆底或平底的试剂瓶。
[0034] 在另一优选例中，所述盒体和所述盒盖是相连接的或相互独立的，所述盒盖盖在所述盒体上，使所述试剂盒保持密封状态。
[0035] 在另一优选例中，所述固定板固定在所述盒体内，或者所述固定板是可拆卸的。
[0036] 在另一优选例中，所述固定板为海绵固定板或泡沫固定板，可拆卸地固定在盒体内部。
[0037] 在另一优选例中，所述固定板上还设有第六凹槽组，所述第六凹槽组包含1-3个第六凹槽，用于放置制冷物，所述制冷物优选为冰袋，更优选为正方体或长方体的冰袋。
[0038] 应理解，在本实用新型范围内中，本实用新型的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
具体实施方式
[0043] 本实用新型提供的构建嵌合抗原受体修饰的T细胞的试剂盒，以解决快速、便捷、高效地制备嵌合抗原受体修饰的T细胞的技术问题。
[0044] 术语
[0045] 如本文所用，“试剂盒”也可称为试剂箱，具有相同的含义，均用于盛载适用于NK细胞扩增的配套器具(如试剂瓶)，并在配套器具中存放相应的试剂。
[0046] 如本文所用，“细胞储存单元”中储存的细胞为293T细胞。关于这些细胞是已知的，现有技术中已经存在相关公开的报道，也可以从市售的渠道的获得，比如购自ATCC细胞库。
[0047] 如本文所用，“慢病毒包装系统储存单元”中储存的慢病毒包装系统为已知的慢病毒包装系统，可以从市售的渠道获得，或者参考本专利申请之前的文献方法制备而得，优选地慢病毒包装系统为：Rev质粒，VSV-G质粒，和△R质粒的三质粒慢病毒包装系统，该三质粒慢病毒包装系统可以购自Addgene公司。
[0048] 如本文所用，“嵌合抗原受体载体储存单元”中储存的嵌合抗原受体载体为已知的嵌合抗原受体载体，可以是基于慢病毒载体、逆转录病毒载体、和睡美人表达系统的嵌合抗原受体载体，这些嵌合抗原受体载体可以从市售的渠道获得，或者参考本专利申请之前的文献方法制备而得。
[0049] 如本文所用，“细胞分离试剂储存单元”中，储存的细胞分离试剂为Ficoll-Paque Plus试剂，为已知的试剂，可以购自美国GE公司。
[0050] 如本文所用，“限制性内切酶储存单元”中储存的限制性内切酶，包括EcoRI酶试剂和NotI酶试剂，均未已知常规试剂，可以从市售渠道获得。
[0051] 本实用新型的优选地实施方式中，所述试剂盒是密封的，包括合体和可开启的盒盖，所述合体内部装有固定板，所述固定板上设置数个放置有器具的孔或凹槽，所述器具为试剂瓶。试剂瓶紧密嵌在孔或凹槽内，保证在保存、运输和使用过程中试剂瓶不会脱落。盒体和盒盖是相连接的或相互独立的，所述盒盖盖在所述盒体上，使所述试剂盒保持密封状态。固定板固定在所述盒体内，或者所述固定板是可拆卸的。所述试剂瓶分别放置在所述的孔或凹槽内。所述固定板为海绵固定板或纸质固定板，可拆卸的固定在盒体内部。另一优选例中，所述试剂盒内试剂瓶数目和所装试剂不变，固定板上孔或凹槽的位置相应变化。
[0052] 使用方法举例
[0053] CD19单链抗体序列的重链和轻链可变区序列来自于中国专利申请CN200910100763.2中公开的序列。将VH(CD19单抗重链可变区序列),Linker序列，VL(CD19单抗轻链可变区序列)按顺序用overlap PCR方法得到一条CD19单链抗体序列(引物两端含有限制性内切酶酶切位点，用于直接亚克隆到嵌合抗原受体载体上)，将CD19单链抗体片段和嵌合抗原受体载体(CAR慢病毒载体)用限制性内切酶(如XbaI和EcorI酶)切后，进行连接，转化，菌检，测序，CD19-CAR慢病毒载体(CD19-CAR-T慢病毒载体)构建完成。
[0054] 将得到的CD19-CAR-T慢病毒载体用三质粒(Rev、VSV-G和△R)包装系统和293T细胞进行慢病毒的包装。病毒浓缩后进行T细胞的转染。利用Ficoll-Paque Plus试剂从6
外周血中分离得到PBMC。T细胞经活化后，取出1X10个细胞，加入浓缩过的CD19-CAR-T慢病毒液，混匀，MOI＝30。一周后对转染的T细胞进行相关目的蛋白的检测，并进行细胞毒性试验。
[0055] 本实用新型的主要优点在于：
[0056] (1)本实用新型提供的用于构建嵌合抗原受体修饰的T细胞的试剂盒，能 够快速、便捷、高效地制备嵌合抗原受体修饰的T细胞。
[0057] (3)应用本试剂盒制备的嵌合抗原受体修饰的T细胞具有较高的杀伤活性。
[0058] 下面结合具体实施例，进一步详陈本实用新型。应理解，这些实施例仅用于说明本实用新型而不用于限制本实用新型的范围。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
[0059] 实施例1试剂盒
[0060] 如图1、图2所示，本实施例提供的试剂盒，包括盒体1、可开启的盒盖2以及储存单元4，所述存储单元4位于所述盒体内部，所述储存单元4包括细胞储存单元41、慢病毒包装系统储存单元42和嵌合抗原受体载体储存单元43，所述细胞储存单元41的总容量为1-2ml；所述慢病毒包装系统储存单元42的总容量为100-500μL；所述嵌合抗原受体载体储存单元43的总容量为0.1-0.5ml。
[0061] 所述细胞储存单元41中储存有293T细胞；所述慢病毒包装系统储存单元42中储存有慢病毒包装系统Rev质粒、VSV-G质粒和△R质粒；和所述嵌合抗原受体载体储存单元43中储存有嵌合抗原受体载体。
[0062] 细胞储存单元41包括1个细胞试剂瓶(图中未示出试剂瓶)，所述细胞试剂瓶的容量为1-2ml；慢病毒包装系统储存单元42包括相互独立的Rev质粒试剂瓶、VSV-G质粒试剂瓶和△R质粒试剂瓶(图中未示出试剂瓶)，各试剂瓶的容量为100μL；嵌合抗原受体载体储存单元43包括1个嵌合抗原受体载体试剂瓶，嵌合抗原受体载体试剂瓶的容量为0.05-0.1ml。
[0063] 如图3所示，所述盒体内部装有固定板3，细胞试剂瓶、慢病毒包装系统中的试剂瓶和嵌合抗原受体载体试剂瓶可拆卸地固定于固定板3上。
[0064] 盒体1和所述盒盖2是相连接的或相互独立的，所述盒盖2盖在所述盒体1上，使所述试剂盒保持密封状态。
[0065] 固定板3固定在所述盒体1内，或者所述固定板3是可拆卸的。
[0066] 固定板3为海绵固定板3或泡沫固定板3，可拆卸地固定在盒体1内部。
[0067] 在固定板3上设置有孔或凹槽，所述试剂瓶置于所述孔或凹槽内。
[0068] 如图3所示，本实施例中固定板3设有：
[0069] 第一凹槽组31，所述第一凹槽组31用于安放所述细胞试剂瓶；
[0070] 第二凹槽组32，所述第二凹槽组32用于安放所述慢病毒包装系统试剂瓶；
[0071] 第三凹槽组33，所述第三凹槽组33用于安放所述嵌合抗原受体载体试剂瓶；和[0072] 第六凹槽36，所述第六凹槽36，用于放置制冷物，所述制冷物优选为冰袋，更优选为正方体或长方体的冰袋。
[0073] 第一凹槽组31包含1个第一凹槽311，用于存放上述的1个细胞试剂瓶，在其它实施方式中，第一凹槽组31可以包含多个第一凹槽。
[0074] 第二凹槽组32包含3个第二凹槽，分别为用于存放Rev质粒试剂瓶的第二凹槽321、分别为用于存放VSV-G质粒试剂瓶的第二凹槽322和用于存放△R质粒试剂瓶的第二凹槽323。
[0075] 第三凹槽组33包含1个第三凹槽331，用于存放上述嵌合抗原受体载体试剂瓶，在其它实施方式中，第三凹槽组331可以包含多个第三凹槽。
[0076] 本实施例中所用试剂瓶均为密封无菌试剂瓶。试剂瓶为锥形底、圆底或平底的试剂瓶。
[0077] 在其它的实施方式中，如图4所示，固定板3上还包括第四凹槽34，第四凹槽组34包含2个第四凹槽，用于放置EcoRI酶试剂瓶的第四凹槽341和用于放置NotI酶试剂瓶第四凹槽342。
[0078] 固定板3上还设有第五凹槽35，所述第五凹槽用于放置Ficoll-Paque Plus试剂容器。
[0079] 在其它的实施方式中，在所述试剂盒的外部可以设置一保温隔离箱。
[0080] 在本实用新型提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本实用新型的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本实用新型作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
