[0001] 本发明涉及一种从发酵食品如发酵荞麦等中提取的提取组合物。更详细地，涉及一种至少包含乙酰胆碱和丙酰胆碱、口服给药时显示出降血压作用和血管扩张作用的发酵食品提取组合物及其提取方法。

[0002] 本发明还涉及一种作为活性成分包含该提取组合物的食品或药物组合物。

[0003] 本发明人对发酵食品尤其是荞麦发芽体榨汁的发酵物进行研究，发现该发酵物的冻干粉末显示出ACE抑制作用，该粉末组成的功能性食品或功能性饮料已有报告(专利文献1)，进一步地，该ACE抑制物质的分馏方法及使用该方法分离的馏分也有报告(专利文献2)。

[0004] 然后，本发明人开发具有更高功能性的荞麦植物体粉碎物的乳酸发酵物(发酵荞麦)，为了离析并纯化该发酵荞麦中包含的降血压作用和血管扩张作用活性成分，进行反复的研究发现了作为其活性成分包含一些新型肽的发酵荞麦提取物，从而进行了专利申请(专利文献3)。

[0005] 另一方面，迄今为止，已报告了各种关于具有血管扩张作用的荞麦来源化合物及含有这些的组合物(专利文献4～7)。

[0006] 本发明人进一步对包含于发酵荞麦中的降血压作用和血管扩张作用活性成分进行深入研究，分馏了与上述专利文献3的活性成分不同的血管扩张作用成分。

[0007] 此外，对包含于该馏分中的成分进行鉴定确认后，发现至少包含乙酰胆碱和丙酰胆碱的将多种胆碱酯作为主体包含的烷基季铵化合物。

[0008] 胆碱酯中，已知乙酰胆碱是作为哺乳类的神经传递素在生命活动中不可缺少的物质。此外，1929年，从马的脾脏中离析出与组胺不同的降血压物质，已化学鉴定其活性物质为乙酰胆碱(非专利文献1)。

[0009] 人们很久开始就知道动物组织中存在这种乙酰胆碱。进一步地，阐明了麦角的降血压物质为乙酰胆碱，并被确认菌类产生乙酰胆碱(非专利文献2)。

[0010] 乙酰胆碱包含于食用植物、食用菌类、蜂王浆、牛乳等，乙酰胆碱还存在于枯草菌、酵母等；还报告了以生物化验确认作为一种乳酸菌的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)产生乙酰胆碱(非专利文献3～7)。

[0011] 此外，还发现了乙酰胆碱的其他多种胆碱酯类。1953年从牛的脾脏中发现了比乙酰基长一个碳链的具有丙酰基的丙酰胆碱(非专利文献8、9)。

[0012] 然后，已确认在公牛精液中、欧洲小龙虾、美国马蹄蟹、欧洲鸟蛤、软壳蛤、紫贻贝、无齿蚌、苹果蜗牛中的血淋巴和平滑肌中、电鱼的发电组织培养中、变叶木、绿豆、车前草、杨木、桦木中等中产生丙酰胆碱(非专利文献10～13)。

[0013] 但是，迄今为止，没有任何关于发酵食品中存在丙酰胆碱的报告或启示。

[0014] 此外，1954年，从脑提取物中发现了丁酰胆碱(非专利文献14)，表明了与乙酰胆碱、丙酰胆碱一起存在于节肢动物、软体动物中(非专利文献11)。

[0015] 进一步地，除了丙酰胆碱、丁酰胆碱之外，从软体动物中还确认了一些胆碱酯类。例如，从骨螺科的一种中确定了咪唑丙烯酰胆碱(ウロカノイルコリン)结构，从瘤岩螺的一种中确定了β,β-二甲基丙烯酰胆碱(异戊烯酰胆碱)结构，从蛾螺科的一种中确定了丙烯酰基胆碱结构，从瘤岩螺的一种中确定咪唑丙酰胆碱结构(非专利文献15～18)。

[0016] 然而，迄今为止，化学上还完全没有证实发酵食品中存在胆碱酯类，也没有任何关于其提取、分馏方法的报告或启示。

[0017] 现有技术文献

[0018] 专利文献

[0019] 专利文献1：特开2005-304355号公报

[0020] 专利文献2：特开2008-239498号公报

[0021] 专利文献3：特开2012-162503号公报

[0022] 专利文献4：特开2007-254410号公报

[0023] 专利文献5：特开2006-76903号公报

[0024] 专利文献6：特开2006-76904号公报

[0025] 专利文献7：特开平5-97798号公报

[0026] 非专利文献

[0027] 非专利文献1：Dale HH,Dudley HW.The presence of histamine and acetylcholine in the spleen of the ox and the horse.J Physiol 68:97-123,1929.[0028] 非专利文献2：Ewins AJ.Acetylcholine,a new active principle of ergot.Biochem J 8:44-49,1914.

[0029] 非专利文献3：桃木芳枝，植物中的乙酰胆碱，植物的化学调节，30(1)，49-61(1995)

[0030] 非专利文献4：川岛纮一郎，乙酰胆碱的根源和非神经性乙酰胆碱，基础老化研究，34(4)，12-24(2010)

[0031] 非专利文献5：筱田雅人等，关于蜂王浆中的血流增加因子，药学杂志，98(2)，139-145(1978)

[0032] 非专利文献6：Whittaker VP.Acetylcholine in Milk.Nature 181:856-857,1958.

[0033] 非专利文献7：Stephenson M,Rowatt E.The production of acetylcholine by a strain of Lactobacillus plantarum.J Gen Microbiol 1(3):279-298,1947.[0034] 非专利文献8：Banister J,Whittaker VP,Wijesundera S.The occurrence of homologues of acetylcholine in ox spleen.J Physiol 121(1):55-71,1953.[0035] 非专利文献9：Gardiner JE,Whittaker VP.The identification of propionylcholine as a constituent of ox spleen.Biochem J 58(1):24-29,1954.[0036] 非专利文献10：Bishop MR,Sastry BV,Stavinoha WB.Identification of acetylcholine and propionylcholine in bull spermatozoa by integrated pyrolysis,gas chromatography and mass spectrometry.Biochim Biophys Acta 500(2):440-444,1977.

[0037] 非专利文献11：Wolfgang W,Jutta N,Dettmar W.Distribution of choline sters and cholinesterases in haemolymphs and smooth muscles of molluscs.Comp Biochem Phys C 61(1):121-131,1978.

[0038] 非专利文献12：O'Regan S.The synthesis,storage,and release of propionylcholine by the electric organ of Torpedo marmorata.J Neurochem39(3):
764-772,1982.

[0039] 非专利文献13：Miural GA,Shin TM.Identification of proprionylcholine in higher plants.Physiol Plant 62:341-343,1984.

[0040] 非专利文献14：Holtz P,Schumann HJ.Butyrylcholine in brain extracts.Naturwissenschaften 41:306,1954.

[0041] 非专利文献15：Erspamer V,Benati O.Identification of murexine asβ-[imidazolyl-(4)]acrylcholine.Science 117:161-162,1953.

[0042] 非专利文献16：Keyl MJ,Michaelson IA,Whittaker VP.Physiologically a ctive choline esters in certain marine gastropods and other invertebrates.J Physiol139:434,1957.

[0043] 非专利文献17：Whittaker VP.Acrylylcholine:a new naturally occurring pharmacologically active choline ester from Buccinum undatum.Biochem Pharmacol 1(4):342-346,1959.

[0044] 非专利文献18：Roseghini M.Occurrence of dihydromurexine(imidazole propionylcholine)in the hypobranchial gland of Thais(purpura)haemastoma.Experientia 27(9):1008-1009,1971.

[0079] 乳酸发酵荞麦植物体所得的“发酵荞麦”对自发性高血压大鼠(SHR)具有优异的降血压作用。

[0080] 本发明人对该发酵荞麦中的降血压物质进行研究，发现了一些包含新型的肽的发酵荞麦提取物，进行了专利申请(专利文献3)。

[0081] 本发明人对发酵荞麦中的血管扩张成分进行进一步研究，开发了新的分馏、纯化方法，并成功分馏、纯化该发酵荞麦中的血管扩张成分。

[0082] 本发明的分馏、纯化中使用的发酵荞麦是pH3.6酸性，对12周龄的雄性SHR的胸部大动脉血管标本，从0.5μg/mL显示出血管扩张作用，EC50是8.30μg/mL。

[0083] 该发酵荞麦中添加氢氧化钠溶液，以pH12在室温中放置时，则0.5小时中失去了血管扩张活性。

[0084] 此外，调查了发酵荞麦冻干物的有机溶剂提取物的血管扩张作用，其结果是乙酸乙酯提取物中没有血管扩张作用，乙醇和丙酮提取物中有活性，丙酮提取物的血管扩张作用最强。

[0085] 从以上结果中发现，发酵荞麦血管扩张成分需要在酸性或中性条件下纯化或给药，在丙酮中可有效提取。

[0086] 接着，通过色谱分析法检测血管扩张成分的纯化条件。首先，以凝胶过滤色谱分析纯化发酵荞麦冻干物的丙酮粗提取物并比较了活性。其结果是从洗脱时间判断包含较低分子量的馏分中发现了血管扩张作用。

[0087] 由于发酵荞麦的血管扩张成分在碱性中失去活性，因此研究了在酸性条件下操作的阳离子交换树脂中的纯化。其结果，在强酸性阳离子交换树脂处理中的盐酸洗脱馏分中发现了比较强的血管扩张作用。推测之所以出现这一结果是由于发酵荞麦血管扩张成分具有正电荷，因此与树脂上具有负电荷的交换基团亚磺酸基相互作用。

[0088] 但是，对于血管扩张成分对阳离子交换树脂的吸附较强，为了回收足够的血管扩张成分反复进行盐酸洗脱操作而产生大量的洗脱液，而从大量的洗脱液中去除盐酸和溶剂的操作非常繁杂。因此想到利用血管扩张成分的正电荷与具有π电子的苯基之间的阳离子-π相互作用，进行有效分离，使用苯基键合载体进行固相萃取后，能够分离仅浓缩血管扩张成分的馏分。

[0089] 认为这是由于与血管扩张成分共存的其他化合物相比形成了特别强的阳离子-π相互作用，在研究了使用具有更强阳离子-π相互作用的由五氟苯基键合的载体填充的柱(PFP柱)的HPLC分离条件后，能够进一步浓缩、分离血管扩张成分。

[0090] 基于上述研究结果，确立了如下所示本发明的发酵食品提取物的制造方法。

[0091] 即，例如，通过(工序1)，在丙酮中悬浮发酵荞麦冻干物或浓缩物，摇动搅拌后，对离心分离得到的上清液进行减压浓缩；(工序2)，使用由苯基键合的载体填充的固相萃取柱，作为洗脱液使用含酸水，对该减压浓缩物进行洗脱；接着，(工序3)，使用由五氟苯基键合的载体填充的柱(PFP柱)，作为流动相使用含酸性甲醇水，对该洗脱物进行分馏、纯化，从而制造出口服给药时表现出降血压作用和血管扩张作用的发酵食品提取组合物。

[0092] 本发明的制造方法中使用的发酵荞麦，可通过特开2012-162503号公报(专利文献3)记载的制造方法制造。具体地，将培养床和去除种壳的荞麦芽浸渍在100ppm的次氯酸钠中，进行10分钟杀菌后，切割、粉碎，然后将该粉碎物放入密封容器中，每1.0kg粉碎物添加
25mL的乳酸菌发酵剂(植物乳杆菌)，置换氮气后，室温中静置6天使其发酵，对发酵物进行过滤或离心分离，得到红褐色液体的发酵荞麦，冻干或减压浓缩该发酵荞麦，可得到发酵荞麦的冻干物或减压浓缩物。

[0093] 作为工序2中使用的固相萃取柱，可列举例如固相萃取柱(HyperSep Phenyl SPE Columns，Shimadzu STRATA Phenyl，Agilent Bond Elut PH)等，最优选固相萃取柱(GL Science InertSep)(注册商标)。此外，作为洗脱液使用的含酸水，可列举含盐酸水、含乙酸水、含三氟乙酸(TFA)水、含磷酸水等，优选含甲酸水，最优选含0.01％甲酸的水。

[0094] 作为工序3中使用的反相柱，可列举例如苯基柱(Imtakt Unison UK-Phenyl,GL Science InertSustain Phenyl,GL Science Inertsil Ph-3,COSMOSIL 5PFP Packed Column)等，最优选PFP柱(YMC-Triart PFP)。此外，作为流动相使用的含酸性甲醇水，可列举含盐酸、甲醇的水、含乙酸、甲醇的水、含TFA、甲醇的水、含磷酸、甲醇的水等，优选含甲酸、甲醇的水，最优选含0.01％甲酸-33％甲醇的水。

[0095] 通过上述分馏、纯化方法，分馏了发酵荞麦的血管扩张作用成分，可离析更佳纯度的乙酰胆碱、丙酰胆碱、丁酰胆碱，通过NMR和质谱确定了结构。

[0096] 此外，使用PFP柱的LC-MS/MS分析中，除这三种胆碱酯外，还确定了乳酰胆碱、乙酰丙酰胆碱、肉毒碱及其甲基酯、三甲基甘氨酸(甜菜碱)及其甲基酯、乙基酯以及丙酰基酯和磷酰胆碱。

[0097] 本研究结果中第一次将乳酰胆碱确认为天然物，并且迄今为止没有任何关于通过本发明的分馏、纯化方法离析的乙酰丙酰胆碱的报告或启示。

[0098] 使用通过本发明的分馏、纯化方法离析、纯化的乙酰胆碱、丙酰胆碱、丁酰胆碱的盐酸盐，对SHR的胸部大动脉标本进行了血管等长张力试验以及SHR单剂量口服给药试验。

[0099] 在血管等长张力试验中，乙酰胆碱从10-9M开始显示出血管扩张作用，10-6M中最大-8扩张率为89.9％，EC50为2.72×10 M。

[0100] 丙酰胆碱从10-7M开始显示出扩张反应，10-4M中最大扩张率为95.2％，EC50为2.27×10-6M。

[0101] 丁酰胆碱在10-4M添加中显示出7.14％的扩张较弱的血管扩张作用。

[0102] 单剂量口服给药试验中，考虑发酵荞麦的单剂量试验结果和含量，在口服给药10-11mol/kg中进行了试验。

[0103] 其结果是乙酰胆碱给药组和丙酰胆碱给药组中，给药9个小时后，与对照组进行比较，引起显著的降血压作用。

[0104] 本结果推翻了以往公认的口服给药乙酰胆碱时不会引起生理活性的理论。

[0105] 此外，迄今为止没有任何关于口服给药丙酰胆碱时引起生理活性这一研究结果的报告或启示。

[0106] 从发酵荞麦中混合其他烷基季铵化合物(丁酰胆碱、乳酰胆碱、乙酰丙酰胆碱、磷酰胆碱、肉毒碱及其甲基酯、三甲基甘氨酸(甜菜碱)及其甲基酯和乙酯以及丙酰基酯)引起优异的血管扩张作用、降血压作用的推测中，认为即使单独时的血管扩张作用、降血压作用较弱，但是这些化合物协同乙酰胆碱或丙酰胆碱有助于起到降血压作用。

[0107] 此外，认为发酵荞麦包含的有机酸类(乳酸、乙酸、柠檬酸)，使溶液保持酸性，从而使乙酰胆碱或丙酰胆碱等胆碱酯稳定，有助于提高口服给药时的效果，已知的降血压成分氨基酸类(酪氨酸、GABA)等也协同乙酰胆碱和丙酰胆碱有助于起到降血压作用。

[0108] 关于本发明的发酵食品原料，只要是植物来源的茎叶、种子(谷类、豆类)等、动物来源的乳等可食用品，就不做特别限定。此外，关于本发明的发酵食品的发酵中使用的菌，只要不是病原性的，就都可以，对此不做特别限定。

[0109] 本发明人对发酵荞麦以外的发酵食品进行同样的分馏、纯化，并进行检测，发现在酸奶、黑醋、纳豆、日本清酒中包含乙酰胆碱、丙酰胆碱、乳酰胆碱、磷酰胆碱、肉毒碱、三甲基甘氨酸及其甲基酯以及乙基酯。

[0110] 特别是可确认上述发酵食品中显示出丙酰胆碱具有较高的含量。本研究结果是迄今为止没有任何报告或启示的新研究结果。

[0111] 其他还发现黑醋中包括丁酰胆碱、乳酰胆碱、磷酰胆碱、肉毒碱、三甲基甘氨酸(甜菜碱)及其甲基酯和乙基酯；酸奶中包括乳酰胆碱、磷酰胆碱、肉毒碱及其甲基酯、三甲基甘氨酸(甜菜碱)及其甲基酯、乙基酯以及丙酰基酯；纳豆中包括丁酰胆碱、乳酰胆碱、磷酰胆碱、肉毒碱及其甲基酯、三甲基甘氨酸(甜菜碱)及其甲基酯、乙基酯以及丙酰基酯；日本清酒中包括丁酰胆碱、乳酰胆碱、磷酰胆碱、肉毒碱及其甲基酯、三甲基甘氨酸(甜菜碱)及其甲基酯以及乙基酯。

[0112] 从上述事项中可以推测，至少在上述的酸奶、黑醋、纳豆、日本清酒等发酵食品中，通过本发明的发酵荞麦提取组合物的制造方法进行活性成分的分馏、纯化，从而能够得到显示出与发酵荞麦提取组合物相同活性的提取组合物。

[0113] 本发明的提取组合物可用作各种功能性健康食品或药物组合物的有效成分。

[0114] 作为食品时，可与适当的食品添加物结合作为食品用组合物使用。此外，不限于这种食品用组合物，还可以与绿茶、红茶、乌龙茶、粗粮茶等混合作为饮料，或与饼干、面包、糖果等混合作为食品，以日常可摄取的形态提供。此外，还可以按照下述药物制剂以适当的剂型当作所谓保健品使用。

[0115] 作为药物时，与适当的药物添加剂结合，可以按照通常的制剂方法以各种剂型使用。这种剂型可列举口服剂，例如散剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂、片剂等固体制剂，以及水剂，悬浮剂，乳剂等液体制剂。

[0116] 作为食品使用本发明的提取物时，不仅作为一般性食品使用，还可以作为可发挥特定功能促进健康的功能性健康食品使用。

[0117] 此时的具体形态可列举作为有效成分包含本发明组合物的由胶囊剂、片剂、粉末剂、颗粒剂等组成的保健品类；面包、蛋糕、饼干等焙烤食品类；酱汁、汤、调味品、蛋黄酱等调味料类；牛奶、酸奶、奶油等乳制品类；巧克力、糖等糖果类；或者绿茶、红茶、乌龙茶、麦茶、粗粮茶、果汁、蔬菜、乳饮料、清凉饮料以及碳酸饮料等各种饮料类等。

[0118] 作为药物组合物的有效成分使用本发明的提取组合物时的给药量根据各成分的比例而不同，并且，根据患者年龄、体重、性别、症状、给药方式等各种要因而不同，但成人在每日口服给药时，可在约0.1mg～100g范围内选择，非口服给药时，可在约0.1mg～1000mg范围内选择。并且根据症状的改善程度，可适当增减。给药次数可分为1日1次～几次。

[0119] 作为食品使用本发明的提取组合物时的摄取量，可按照上述药物的口服给药时的情况选择。但是，不同于药物的情况，饮食物的情况时由于不能特别限定剂量和次数，因此只要不出现特别严重的症状就不局限于上述范围，以健康为目的，同时考虑美味性、适口性，可选择摄取量。

[0120] 实施例

[0121] 下面，结合实施例和试验例说明本发明的实施方式，但是本发明并不局限于下述的例子。

[0122] 实施例1

[0123] 发酵荞麦的制造

[0124] 根据特开2012-162503号公报(专利文献3)中记载的制造方法制造了发酵荞麦。

[0125] 从沙拉科斯莫(Salad Cosmo)有限公司购买了播种后培养约10天而收获的荞麦芽。将培养床和去除种壳的荞麦芽(10kg)浸渍在100ppm的次氯酸钠(20L)中，进行10分钟杀菌后，以2.0cm左右的长度切割，并弄碎。

[0126] 将粉碎物放入密封容器(10L)中，每1.0kg粉碎物添加25mL的乳酸菌发酵剂(植物乳杆菌)，置换氮气后，室温中静置6天使其发酵，对该发酵物进行过滤或离心分离，得到了红褐色液体的发酵荞麦(6.8kg)。然后通过常用方法，对所得发酵荞麦进行冻干或真空压缩得到发酵荞麦的冻干物或减压浓缩物，并将其用于血管扩张成分的离析纯化。

[0127] 实施例2

[0128] 发酵荞麦血管扩张成分的分馏

[0129] [试验例1]

[0130] 血管扩张成分的纯化条件研究

[0131] 首先，使用从2kg的发酵荞麦得到的冻干物，明确发酵荞麦血管扩张物质的化学性质的同时进行纯化条件研究。对发酵荞麦(2kg)进行离心分离(3220g，30min，4℃)后，去除残余物，得到上清液，对该上清液进行冻干处理，得到深红色的吸湿性的发酵荞麦冻干物(产率2.05％)。

[0132] 各条件研究中，通过各纯化阶段中的血管等长张力测定试验，确定显示出血管扩张作用的馏分，从而确认了活性成分的浓缩。

[0133] pH稳定性试验

[0134] 本条件检测中使用的发酵荞麦(液体)为pH3.6的酸性，对12周龄的雄性SHR的胸部大动脉血管标本，从0.5μg/mL显示出血管扩张作用，EC50是8.30μg/mL。

[0135] 为了试验发酵荞麦的pH稳定性，将发酵荞麦冻干物(10mg)溶解于净化水中，添加1N氢氧化钠，调整至pH7.0、pH9.0、pH12.0后，添加净化水直至1mL。将溶解于净化水(1mL)中的发酵荞麦冻干物(10mg)用作对照试样(pH4.0)。在室温中放置0.5、1、3、6、12、24小时后，在血管等长张力测定试验中，确认了发酵荞麦浓度50μg/mL中的各溶液的血管扩张作用。其结果是对照试样在pH7.0中经过24小时后还维持血管扩张作用，但是在pH9.0中经过6小时后，其血管扩张作用已消失，在pH12.0中经过0.5小时后，其血管扩张作用已消失。

[0136] 有机溶剂提取试验

[0137] 将发酵荞麦冻干物(100mg)分别悬浮于1mL的乙醇、丙酮、乙酸乙酯中，使用振荡培养箱(1811g，6小时，室温)摇晃后，离心分离(3220g，30min，4℃)，得到上清液和沉淀物。

[0138] 将沉淀物再次悬浮于各有机溶剂中，同样进行离心分离，得到上清液和沉淀物。合并上清液进行减压浓缩后，用真空泵完全去除溶剂。

[0139] 各有机溶剂提取物产量为乙醇提取物975μg(0.98％)，丙酮提取物512μg(0.51％)，乙酸乙酯提取物210μg(0.21％)。

[0140] 血管等长张力测定试验中，确认了各提取物浓度50μg/mL中的各溶液的血管扩张作用。其结果是乙醇提取物、丙酮提取物、乙酸乙酯提取物的血管扩张率分别是22％、49％、0％。

[0141] 凝胶过滤色谱分析法

[0142] 将发酵荞麦冻干物(1.25g)溶解于纯水(10mL)中，注入到填充截留分子量为700～1500的交联葡聚糖凝胶G-15(Sephadex G-15)(30g)的空心柱(4.2cm×50cm)。除掉空隙体积300mL后，每次取出50mL，进行凝胶过滤得到馏分1～8。冻干每次取出的各馏分，冻干物供血管等长张力测定试验使用。通过凝胶过滤色谱分析法分馏之时的各馏分的产量和产率如表1所示。

[0143] [表1]

[0144] 表1凝胶过滤馏分产量

[0145]馏分 1 2 3 4 5 6 7 8 合计
产量(mg) 77.2 109.0 160.1 238.0 192.9 136.1 116.2 36.2 1103.3
产率(％) 6.2 8.7 12.8 19.0 15.4 10.9 9.3 2.9 88.3

[0146] 血管等长张力测定试验中确认了各馏分25μg/mL中的血管扩张作用，其结果是凝胶过滤馏分3、4中发现血管扩张作用。通过累计添加检查凝胶过滤馏分3～5的血管扩张作用，其结果是凝胶过滤馏分3在添加1.0ng/mL中显示出4.80％的扩张率，观察到依赖于剂量的血管扩张反应，最大扩张率为添加5.0μg/mL时的61.9％。凝胶过滤馏分4在添加1.0ng/mL的中显示出2.74％的扩张率，最大扩张率为添加5.0μg/mL时的71.2％。凝胶过滤馏分3和4中，在发酵荞麦的1/500的低浓度中开始了血管扩张，由此知晓包括具有很强血管扩张作用的物质。另一方面，凝胶过滤馏分5中观察到依赖于剂量的血管收缩反应，发酵荞麦中不仅包括血管扩张成分还包括血管收缩成分。认为通过凝胶过滤色谱分析法去除了包含于凝胶过滤馏分5中的血管收缩成分，且血管扩张物质被浓缩。

[0147] 离子交换处理

[0148] 强酸性阳离子交换树脂处理

[0149] 将发酵荞麦冻干物(2000mg)溶解于纯水(5mL)中，用1N氢氧化钠(NaOH)调整至pH7，然后离心分离(3220g，4℃，20分钟)，回收上清液，用量筒稀释至10mL。将该上清液(2.5mL)加入到质子型强酸性阳离子交换树脂(Amber Light IR120B，5mL)和纯水(2mL)的悬浮液中，缓慢搅拌的同时，在室温中处理2小时后，过滤分离了处理溶液和树脂。将树脂用纯水(15mL)清洗2次，并与处理溶液合并。清洗后的树脂中加入2N盐酸(HCl)(30mL)缓慢搅拌的同时，在室温中处理30分钟，洗脱吸附成分，过滤分离了盐酸洗脱液和树脂。进一步地，对所得处理溶液反复进行2次使用离子交换树脂处理的操作，并混合各操作中得到的所有洗脱液。将处理溶液(99mL)和盐酸洗脱液(90mL)分别用量筒稀释至300mL后，稀释4倍，在血管等长张力测定试验中确认了血管扩张作用。其结果是盐酸洗脱馏分中发现血管扩张作用，添加100μL盐酸洗脱馏分时为56.0％。假设发酵荞麦中的所有血管扩张成分被吸附到离子交换树脂中，此时的发酵荞麦浓度相当于10μg/mL。在处理溶液中未发现血管扩张作用。

[0150] 弱酸性阳离子交换树脂处理

[0151] 将发酵荞麦冻干物(2000mg)溶解于纯水(5mL)中，用1N氢氧化钠(NaOH)调整至pH7，然后离心分离(3220g，4℃，20分钟)，回收上清液，用量筒稀释至10mL。将该上清液(2.5mL)加入到钠型弱酸性阳离子交换树脂(Amber Light IRC76，5mL)和纯水(2mL)的悬浮液中，缓慢搅拌的同时，在室温中处理2小时后，过滤分离了处理溶液和树脂。将树脂用纯水(15mL)清洗2次，并与处理溶液合并。清洗后的树脂中加入2N盐酸(HCl)(30mL)缓慢搅拌的同时，在室温中处理30分钟，洗脱吸附成分，过滤分离了盐酸洗脱液和树脂。进一步地，对所得处理溶液反复进行2次使用离子交换树脂处理的操作，并混合各操作中得到的所有洗脱液。将处理溶液(94mL)和盐酸洗脱液(90mL)分别用量筒稀释至300mL后，稀释4倍，在血管等长张力测定试验中确认了血管扩张作用。其结果是处理溶液和盐酸洗脱馏分中都发现了血管扩张作用，添加100μL处理溶液时血管扩张率为7.3％，添加100μL盐酸洗脱馏分时为23.3％。认为弱酸性阳离子交换树脂对发酵荞麦血管扩张成分的吸附不充分。

[0152] 固相萃取

[0153] 用甲醇(30mL)活化固相萃取柱(GL Science InertSep PH，5g)(注册商标)，用含0.01％甲酸的水(30mL)清洗并用纯水(30mL)平衡后，将发酵荞麦丙酮提取物(1.0g)溶解于纯水(2.5mL)中应用，用纯水(30mL)和含0.01％甲酸的水(30mL)进行洗脱。对纯水洗脱馏分和含0.01％甲酸水洗脱馏分进行冻干，在血管等长张力测定试验中确认了血管扩张作用。
其结果是含0.01％甲酸水洗脱分馏中发现血管扩张作用，0.5μg/mL时血管扩张率为
35.6％。在纯水洗脱馏分中未发现血管扩张作用。

[0154] HPLC分离条件

[0155] 使用五氟苯基键合的反相柱(YMC-Triart PFP，5μm，4.6mm×250mm)研究发酵荞麦固相萃取物(1mg/mL)中的血管扩张成分分离条件。首先，使用候选血管扩张成分乙酰胆碱标本，改变洗脱液的甲醇含量和酸含量进行了条件研究。即，注入60μL乙酰胆碱标本(0.1mg/mL)，流速0.5mL/min，分离温度30℃中，在洗脱液中使用含0％、5％、15％、30％、50％、60％甲醇的水以及含0.002％、0.004％、0.006％、0.008％、0.01％、0.015％甲酸的
50％甲醇，检查乙酰胆碱的洗脱行为变化。其结果是随着甲醇含量的增加，乙酰胆碱的洗脱时间变快，同时峰形态为良好。此外，甲酸含量不太影响乙酰胆碱的保持时间，但是酸含量越多，由于干扰提升，检测峰变小。从以上结果中可知，含0.01％甲酸-50％甲醇的水最适用于乙酰胆碱的分析。伴随甲醇含量的变化的乙酰胆碱的洗脱行为变化如图1所示，伴随酸含量变化的乙酰胆碱的洗脱行为变化如图2所示。

[0156] 接着，研究了发酵荞麦固相萃取物的分离条件。基于乙酰胆碱分析条件中的结果，改变甲酸含量为0.01％，甲醇含量为25％、30％、35％、40％、45％、50％，进行HPLC分析。其结果是甲醇含量35％中的分离为良好。酸含量(0.01％)固定条件下，伴随甲醇含量变化的发酵荞麦纯化物的行为如图3所示。

[0157] 进一步地，稍微改变了甲醇含量(38％、36％、33％)，色谱分析后半部的分离为33％甲醇时最佳。酸含量(0.01％)固定条件下，伴随甲醇含量变化的发酵荞麦纯化物的行为如图4所示。

[0158] 最后，含0.01％甲酸-33％甲醇的水中，设定30℃和40℃分离温度检查了分离，发现40℃时的分离更好。伴随分离温度变化的色谱变化如图5所示。

[0159] 从以上结果中，确定了最佳分离条件如下：

[0160] 柱：YMC-Triart(注册商标)PFP，5μm，4.6mm×250mm

[0161] 注入量：发酵荞麦固相萃取物(0.1mg/mL)60μL

[0162] 流动相：含0.01％甲酸-33％甲醇的水(等度)

[0163] 流速：0.5mL/min

[0164] 温度：40℃

[0165] 实施例3

[0166] 发酵荞麦血管扩张成分的纯化

[0167] 减压浓缩发酵荞麦100kg，通过丙酮提取、固相萃取、凝胶过滤色谱分析、HPLC纯化了发酵荞麦中的血管扩张成分。

[0168] 发酵荞麦血管扩张成分的丙酮提取

[0169] 对发酵荞麦进行离心分离(3220g，30min，4℃)，除掉离心分离后的残余物。将所得上清液在减压条件下用旋转真空蒸发器浓缩，得到发酵荞麦浓缩物。2L研钵中加入发酵荞麦浓缩物(约120g)和丙酮(300mL)，用杵研磨5分钟，同时提取血管扩张成分，用吸引器回收了上清液。残余物中进一步加入丙酮(300mL)，用杵充分研磨5分钟后，同样回收了上清液。重复该操作总计12次。将所得丙酮溶液在减压条件下用旋转真空蒸发器浓缩，得到丙酮粗提取物。500mL茄子瓶中加入丙酮粗提取物(约60g)和乙酸乙酯(约200mL)，用玻璃棒充分搅拌5分钟后，10分钟冰水冷却后去除上清液。残余物中再加入乙酸乙酯(约200mL)，用玻璃棒充分搅拌5分钟后，同样的方式去除上清液。重复该操作总计12次，将所得残余物在干燥器中减压干燥3小时以上，得到丙酮提取物。

[0170] 根据固相萃取纯化和凝胶过滤色谱分析的发酵荞麦血管扩张成分的分馏[0171] 作为凝胶过滤色谱分析的前处理，用甲醇(300mL)活化固相萃取柱(GL Science InertSep(注册商标)PH，50g)，用含0.01％甲酸的水(300mL)清洗并用纯水(300mL)平衡后，将发酵荞麦丙酮提取物(10g)溶解于纯水(20mL)中应用，用纯水(300mL)洗脱夹杂物后，用含0.01％甲酸的水(300mL)洗脱血管扩张物质。将所得洗脱液在减压条件下用旋转真空蒸发器浓缩，得到浓缩的固相萃取物。

[0172] 接着，凝胶过滤色谱分析中，柱(4.2cm×50cm)中填充Sephadex G-15(230g)，注入用纯水调制为500mg/mL的固相萃取物(2mL)后，用纯水洗脱，取410-485mL的洗脱液。将所取洗脱液减压浓缩、冻干后，得到凝胶过滤物。

[0173] 发酵荞麦血管扩张成分的LC-MS、LC-MS/MS分析

[0174] 进行凝胶过滤物的LC-MS分析以及LC-MS/MS分析。1.5mL容量微管中加入凝胶过滤物和分析溶剂，调制1mg/mL浓度的样品溶液，通过Millex-LH过滤器(0.45μm)(注册商标)后，得到LC-MS分析样品。柱使用了键合PFP基的反相柱YMC-Triart(注册商标)PFP(5μm，4.6mm×250mm)，流动相使用了含0.01％甲酸-33％甲醇的水。离子化模式ESI+，流速为
0.5mL/min(LC)以及0.3mL/min(MS)，分离温度为40℃，注入量为10μL，毛细管(Capillary)电压为3500V，N2气体流量(cone)为50L/h，N2源温度为120℃，N2脱溶剂温度为350℃。此外，进行分析的每个峰中，以10～60V离子化电压进行了检查，使用了最佳离子化的锥电压(Cone voltage)10V、锥电压30V的条件。对于LC-MS分析观察到的主要的离子峰，实施中性丢失扫描，作为烷基季铵化合物限定了具有三甲胺基(质荷比59)的化合物。并且，将特定的烷基季铵化合物的质荷比作为前体离子进行LC-MS分析。其结果是作为烷基季铵化合物限定了乙酰胆碱、丙酰胆碱、丁酰胆碱、乳酰胆碱、乙酰丙酰胆碱、肉毒碱及其甲基酯、三甲基甘氨酸(甜菜碱)及其甲基酯、乙基酯以及丙酰酯和磷酰胆碱。

[0175] 实施例4

[0176] 乙酰胆碱、丙酰胆碱、丁酰胆碱的离析、纯化

[0177] 发酵荞麦血管扩张成分的HPLC纯化

[0178] 参照上述的LC-MS分析结果，将凝胶过滤物中包含的血管扩张成分用HPLC纯化，分离了血管扩张成分。1.5mL容量微管中加入凝胶过滤物和HPLC分析溶剂，调制100mg/mL浓度的样品溶液，通过Millex-LH过滤器(0.45μm)(注册商标)后，得到分离样品。分析系统使用了突出高效液相色谱系统(Prominence HPLC system)，柱使用了YMC-Triart PFP(5μm，20mm×250mm)(注册商标)。分析条件是流动相为含0.01％甲酸-33％甲醇的水，流速为
5.671mL/min，分离温度为40℃，检测波长为215nm，注入量为50μL凝胶过滤物。取包括血管扩张成分的馏分，必要时重复进行相同的纯化，得到三种纯粹的成分。最后，纯化物中加入盐酸进行减压浓缩、冻干，得到盐酸盐，用于确定结构以及试验。

[0179] 发酵荞麦血管成分的NMR分析

[0180] 对三种HPLC纯化物进行了NMR分析。对于得到的分取物，分别在冻干物(1.6mg)中加入重水(D2O，0.16mL)溶解后，得到NMR样品。使用1H共振频率500MHz的NMR装置(ADVANCE DRX500，Bruker Bio-Spin有限公司，横滨)，使用累计次数为128次。其结果是三种HPLC纯化物的NMR图与市售的特级乙酰胆碱盐酸盐、合成的丙酰胆碱、丁酰胆碱相同，从而被鉴定为乙酰胆碱、丙酰胆碱、丁酰胆碱。

[0181] 发酵荞麦血管扩张成分的质量分析

[0182] 对三种HPLC纯化物进行了MALDI-TOF/MS分析。对于得到的分取物，分别用含0.1％TFA的50％乙腈(15μL)溶解冻干物(0.01mg)后，得到测定样品。分别取1μL的样品和作为基质的2,5-二羟基苯甲酸的含0.1TFA50％的乙腈溶液(7500，1500，750μg/mL)在每个板上混合后，干燥器中进行干燥。使用MALDI-TOF MS质量分析装置(AB SCIEX TOF/TOF5800，AB-Sciex有限公司，东京)，在反射模式、扫描范围10～300m/z、激光强度5500eV中进行了MALDI-TOF MS分析。其结果是分别观察到相当于乙酰胆碱、丙酰胆碱、丁酰胆碱的精密质量的146.1182m/z(理论值：146.1176)，160.1337m/z(理论值：160.1332)，174.1497m/z(理论值：174.1489)。

[0183] 发酵荞麦血管扩张物质的特性描述

[0184] 标准物质合成

[0185] 作为离析、纯化的乙酰胆碱、丙酰胆碱、丁酰胆碱的各盐酸盐的标准物质，乙酰胆碱使用了市售的特级乙酰胆碱盐酸盐，丙酰胆碱、丁酰胆碱使用了本研究室中合成的HPLC中纯化的盐酸盐的冻干物。丙酰胆碱以及丁酰胆碱可按照下述式(1)以及式(2)中所示的合成图进行合成。

[0186] 丙酰胆碱的合成

[0187] [化学式1]

[0188]

[0189] 丙酰胆碱的合成：将胆碱盐酸盐(0.42g，3.0mmol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(DMF，6.0mL)，加入丙酰氯(0.56g，6.0mmol)以及二异丙基乙胺(DIPEA，0.78g，4.5mmol)，从0℃返回到室温，使其反应1小时。反应结束后，蒸馏除去DMF，用二氯甲烷(DCM)-乙酸乙酯(1:1)沉淀生成物。将沉淀物用DCM-乙酸乙酯(5:1)再结晶，进一步用DCM再结晶，得到白色粉末的丙酰胆碱盐酸盐。产率92％，1H NMR(500MHz,D2O)δ(ppm):0.96(3H,t,J＝7.8Hz,CH3),2.32(2H,q,J＝7.5Hz,CH2),3.08(9H,s,CH3),3.60(2H,t,J＝2.5Hz,CH2),4.42(2H,t,J＝2.3Hz,CH2)

[0190] 丁酰胆碱的合成

[0191] [化学式2]

[0192]

[0193] 丁酰胆碱的合成：

[0194] 将胆碱盐酸盐(0.42g，3.0mmol)溶解于DMF(6.0mL)，加入丁酰氯(0.62g，6.0mmol)以及DIPEA(0.78g，4.5mmol)，从0℃返回到室温，使其反应1小时。反应结束后，蒸馏除去DMF，用DCM-乙酸乙酯(1:1)沉淀生成物。将沉淀物用DCM-乙酸乙酯(5:1)再结晶，进一步用DCM再结晶，得到白色粉末的丁酰胆碱盐酸盐。产率89％，1H NMR(500MHz,D2O)δ(ppm):0.78(3H,t,J＝7.5Hz,CH3),1.49(2H,6,J＝7.5Hz,CH2),2.29(2H,t,J＝7.5Hz,CH2),3.08(9H,s,CH3),3.60(2H,t,J＝2.3Hz,CH2),4.43(2H,t,J＝2.3Hz,CH2)

[0195] 使用实验动物

[0196] 按照信州大学动物实验准则进行了动物实验。本试验中，作为实验动物使用了雄性10～13周龄的自发性高血压大鼠(SHR/NCrl Crlj，日本Charles River，横滨)。在单独的笼子中，明暗循环12小时，室温控制在22～23℃的饲养室中饲养SHR。在驯化饲养中，任意摄取大鼠标准饲料(MF；Charles River有限公司)和自来水。SHR是由京都大学的动物实验中心饲养的Wistar-Kyoto系大鼠中选择交配的1963年分离的大鼠系统。称为自发性高血压大鼠或原发性高血压大鼠，对于分离母体Wistar-Kyoto的收缩压，成熟雄性为约135mmHg，同种雌性为132mmHg，但是SHR的血压在出生后到2个月几乎都是150mmHg以上，4～5个月时达到最高，大多显示为180～210mmHg。作为占人类高血压约90％的原发性高血压的模型动物，通常用于阐明药理作用或食品功能、血压上升机制。

[0197] 发酵荞麦血管扩张成分含有物的血管等长张力测定

[0198] 从雄性10～12周龄的SHR中摘除胸部大动脉用于试验，去除结缔组织后，按2～3mm切割，制作了环标本。将制作的环标本安装在由通气95％O2-5％CO2混合气体的37℃的克雷布斯液(119mM NaCl/4.7mM KCl/1.1mM KH2PO4/1.2mM MgSO4/25mM NaHCO3,pH7.4)充满的器官浴槽中，负荷1.5g的静止张力(UFER UC-05A，沙丁鱼和岸本医科产业，京都)。通过UFER UM-203传感器(Transducer)测量血管张力。从安装到60分钟的孵化后，环标本使用收缩剂去氧肾上腺素(终浓度0.30μM)进行收缩。收缩的环标本中添加作为内皮依赖性血管扩张剂的市售乙酰胆碱(终浓度100μM)，根据是否有血管扩张作用判断了是否有血管内皮。然后，用去除药剂的克雷布斯液清洗环标本，以10分钟静止张力孵化后，再次用0.30μM去氧肾上腺素收缩。重复进行2次该操作后，再次添加0.30μM去氧肾上腺素，确认收缩达到最大，累计-9 -8 -7.5 -7 -6.5 -6添加溶解于克雷布斯液中的各样品，直至终浓度达到10 、10 、10 、10 、10 、10 、10-5、10-4M。血管扩张作用(扩张率，％)以通过去氧肾上腺素收缩之时的血管张力为标准进行表示。纯化乙酰胆碱、丙酰胆碱、丁酰胆碱的血管等长张力试验结果如图6所示。

[0199] 纯化乙酰胆碱在10-9M的添加中呈现1.52％的扩张率，此后一直到10-6M呈现依赖-5剂量的扩张反应，但是在此以上的高浓度中有一点收缩。最大扩张率为添加10 M中的
89.9％，确认了低剂量高扩张率。EC50为2.72×10-8M。此外，纯化丙酰胆碱从10-7M中呈现扩张反应，10-4M中最大扩张率为95.2％，EC50为2.27×10-6M。另一方面，纯化丁酰胆碱在10-4M的添加中呈现7.14％的扩张，与乙酰胆碱和丙酰胆碱相比具有弱扩张作用。市售乙酰胆碱和合成丙酰胆碱、丁酰胆碱也呈现相同的血管扩张作用。从以上结果中可确认从发酵荞麦中离析纯化的乙酰胆碱和丙酰胆碱具有较强的血管扩张作用。

[0200] 发酵荞麦血管扩张成分含有物的单次口服给药试验

[0201] 使用体重280～320g的雄性12周龄SHR进行了单次口服给药试验。1周驯化饲养后，断食12小时，单次口服给药样品。将给药样品溶解于纯水中，以10-11mol/kg(b.w.)的剂量分别对6只SHR进行单次口服给药。纯化乙酰胆碱、丙酰胆碱、丁酰胆碱给药样品水溶液的pH分别为酸性4.7、4.3、4.4。对照组中提供纯水。使用无创血压测量仪Softron BP-98A(soft Ron有限公司，东京)根据尾套法测定了试样给药前和给药3、6、9、24小时后的收缩压和舒张压变化。纯化乙酰胆碱、丙酰胆碱、丁酰胆碱的单次口服给药试验结果如图7所示。

[0202] 其结果是乙酰胆碱给药组在给药9个小时后与对照组进行比较，出现显著的降收缩压作用(p＜0.01)，此时的最大降血压作用为24.7mmHg。此外，丙酰胆碱给药组中，给药9个小时后，确认最大8.05mmHg的显著的降收缩压作用(p＜0.05)。另一方面，丁酰胆碱给药组中，在10-11mol/kg中无法确认显著的降血压。市售乙酰胆碱以及合成丙酰胆碱、丁酰胆碱也呈现相同的降压作用。

[0203] 实施例5

[0204] 乳酰胆碱、乙酰丙酰胆碱的离析纯化

[0205] 按照实施例3中记载的方法，作为天然物限定了初始乳酰胆碱。

[0206] 乳酰胆碱的LC-MS分析试验中的质谱如图8-1中所示；LC-MS/MS分析试验中的质谱如图8-2中所示。

[0207] 进一步地，离析纯化了认为是新型化合物的下述式(3)中表示的乙酰丙酰胆碱。

[0208] [化学式3]

[0209]

[0210] 乙酰丙酰胆碱的LC-MS分析试验中的质谱如图9-1中所示；LC-MS/MS分析试验中的质谱如图9-2中所示。

[0211] 实施例6

[0212] 发酵荞麦和其他发酵食品中的烷基季铵化合物的LC-MS/MS分析

[0213] 对包含于发酵荞麦、黑醋、酸奶、日本清酒中的烷基季铵化合物进行了LC-MS分析。取各冻干物(1g发酵荞麦，黑醋、酸奶以及日本清酒各10g)到研钵，作为内部标准加入1mg卡巴胆碱。加30mL丙酮搅拌3分钟，采集上清液放入50mL容量的离心管后，离心分离(4℃，
1811g，10min)，得到上清液。进一步重复四次在残余物中再次加入30mL丙酮搅拌、离心分离、采集上清液的操作，得到丙酮提取物。减压浓缩丙酮提取物后，冻干，用纯水(2.5mL)溶解，使用固相萃取柱(GL Science Inert SEP PH，5g)(注册商标)进行固相萃取。固相萃取中，首先用甲醇(30mL)活化，用含0.01％甲酸的水清洗，用纯水平衡(30mL)后，添加样品。用纯水(30mL)去除夹杂物，用含0.01％甲酸的水(30mL)洗脱，得到包括烷基季铵化合物的固相萃取物。将固相萃取物减压浓缩、冻干后，溶解于分析溶剂(含0.01％甲酸-33％甲醇的水，1mL)中进行了LC-MS分析。用单离子监测(SIM)模式指定由发酵荞麦特定的烷基季铵化合物的质荷比，进行化合物的定量。以化合物指定的质荷比为乙酰胆碱：146.1、丙酰胆碱：
160.1、丁酰胆碱：174.2、乳酰胆碱：176.1、乙酰丙酰胆碱：202.1、磷酰胆碱：184.1、肉毒碱：
162.1、甲基肉毒碱：176.1、三甲基甘氨酸：118.1、甲基甜菜碱：132.1、乙基甜菜碱：146.1、丙酰基甜菜碱：160.1。其他分析条件与上述的发酵荞麦血管扩张成分的LC-MS分析相同。烷基季铵化合物定量结果如表2所示。各化合物含量使用内部标准的定量结果，补偿了纯化过程中的物质损失，用乙酰胆碱当量表示新鲜重量100g(100gFW)中的各烷基季铵化合物含量。

[0214] [表2]

[0215] 表2发酵食品中烷基季铵化合物定量结果(μg/100g FW乙酰胆碱当量)

[0216]烷基季铵化合物 发酵荞麦 黑醋 酸奶 纳豆 日本清酒
乙酰胆碱 295.8 11.8 5.8 1.1 41.7
丙酰胆碱 457.9 27.3 1576.5 95.2 134.0
丁酰胆碱 94.4 24.1 N.D. 66.4 16.8
乳酰胆碱 37.3 10.7 10.5 37.5 7.5
乙酰丙酰胆碱 31.1 N.D. N.D. N.D. N.D.
磷酰胆碱 16.1 9.7 11.7 11.7 2.7
肉毒碱 164.1 10.8 127.0 21.7 9.8
甲基肉毒碱 9.4 N.D. 3.2 39.0 12.2
三甲基甘氨酸 23.8 30.8 98.6 3447.8 13.9
甲基甜菜碱 76.1 30.8 3.5 12622.1 20.7
乙基甜菜碱 147.7 6.78 3.1 33.2 48.2
丙酰基甜菜碱 217.4 N.D. 4.2 88.1 N.D.

[0217] N.D.：检测不出(检测极限以下)

[0218] 工业实用性

[0219] 本发明的发酵食品提取物具有显著的降血压作用，通过作为活性成分包含该提取物，能够制造功能性健康食品或高血压等治疗药物。