[0001] 本发明涉及三肽化合物及其作为药物的用途，尤其是其作为抗炎药物的用途。

[0002] 在医学上炎症的治疗非常重要。然而，现有的治疗方法不充分或者有问题。短暂的炎症是保护哺乳动物免受入侵的病原体侵害的有益机制。然而，由先天性免疫反应或者适应性免疫反应引起的失控性炎症可能导致组织的损伤和疼痛，并且这种失控性炎症是许多疾病的根本原因，这些疾病包括哮喘，也包括其它的过敏性、感染性、自身免疫性、退化性和特发性疾病。现有的治疗方法通常表现出较低的、延迟性的或者仅仅暂时性的效力，不良的副反应和/或缺乏选择性。

[0003] 鉴于大量的炎症类型以及与炎症有关的疾病，以及现有药物的缺点，非常需要新的活性药剂以有效治疗这些疾病及其症状，而不会产生免疫抑制不良反应。

[0004] WO88/00833公开了三肽赖氨酸-脯氨酸-缬氨酸(Lys-Pro-Val)在制备治疗炎症的药剂中的用途。

[0005] WO02/064131描述了像赖氨酸-脯氨酸-苏氨酸(Lys-Pro-Thr)这样的炎症抑制化合物。

[0006] WO02/094856涉及甘氨酸-L-脯氨酸-L-谷氨酸(GPE)的类似物和肽模拟物。

[0007] WO03/002593公开了二肽基肽酶IV(DPP IV)抑制剂。

[0008] WO2007/080194公开了三肽基肽酶II(tripeptidyl peptidase II)(TPP II)抑制剂在增强γ放射癌症治疗的疗效中的用途。

[0009] WO2007/088099公开了三肽基肽酶II抑制剂在治疗缺血和神经退化中的用途。

[0010] WO2009/000296描述了三肽基肽酶II抑制剂在治疗自身免疫性、炎性疾病以及治疗移植排斥反应中的应用。

[0011] WO2009/000297公开了三肽基肽酶II抑制剂结合化学疗法在治疗癌症中的用途。

[0012] W02012/102832描述了甘氨酸-L-2甲基脯氨酸-L-谷氨酸在治疗孤独症谱系障碍(autism spectrum disorders)中的用途。

[0107] 下面描述了本发明的详细的实施例。其中，各种试剂符号和缩略词的含义如下：

[0108] Boc         叔丁氧基羰基

[0109] BTC         二(三氯甲基)碳酸酯

[0110] DIC         N，N′-二异丙基碳二亚胺

[0111] DIPEA       乙基-二异丙基胺

[0112] DMF         N，N-二甲基甲酰胺

[0113] DMSO        二甲基亚砜

[0114] eq.         当量

[0115] ESI-MS      电喷雾质谱

[0116] Fmoc        9H-芴-9-基甲氧基羰基

[0117] h           小时

[0118] HATU       2-(1H-7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸甲胺[0119] HOBt        1-羟基苯并三氮唑

[0120] HOAc        醋酸

[0121] HPLC       高效液相色谱

[0122] m/z         质荷比

[0123] min         分钟

[0124] MeCN        乙腈

[0125] MeOH        甲醇

[0126] MW         分子量

[0127] RT          室温

[0128] T          温度

[0129] tBu        叔丁基

[0130] TFA         三氟乙酸

[0131] TIS         三异丙基硅烷

[0132] tR(min)     高效液相色谱保留时间

[0133] 分析方法

[0134] 高效液相色谱(HPLC)

[0135] 分析型HPLC是在由Dr.Maisch(D-Ammerbuch)制造的含有分析柱Reprospher C18-DE(5μm，50x4.6mm)的Abimed(D-Langenfeld)Gilson HPLC(样品在水中浓度为1mg/mL)上进行的。梯度为水/0.1％三氟乙酸(v/v)(洗脱液A)和乙腈/0.1％三氟乙酸(v/v)(洗脱液B)，流速为1mL/min(10分钟法)。

[0136] 产品的纯度根据在λ＝214nm测定的峰面积分析。

[0137] 电喷雾质谱(ESI-MS)

[0138] 电喷雾质谱分析在Waters-Micromass(D-Eschborn)ZQ质谱仪上进行。

[0139] 多肽的合成，一般步骤

[0140] 装载树脂

[0141] 所有的肽都是通过固相多肽合成法制备的，利用Fmoc/tBu-策略，使用ClTCP(氯代-(2-氯)三苯甲基聚苯乙烯树脂H100 33，Rapp Polymere，蒂宾根，德国)。在Rink-amide聚苯乙烯树脂(H100 33，Rapp)上合成多肽酰胺。

[0142] ClTCP树脂(容量1.48mmol/g)用DMF平衡10分钟，并用DMF进行洗脱。将1当量的Fmoc-氨基酸(相对于装载的树脂)和4当量的DIPEA的DMF溶液加入所述树脂，并震荡120分钟。滤出树脂并用DMF洗脱。用含10当量甲醇和5当量DIPEA的DMF覆盖树脂，并用DMF，DCM和乙醚洗脱。

[0143] 使用含30％哌啶的DMF将Rink树脂(容量0.67mmol/g)脱保护(2×15分钟)。在用DMF洗脱后，加入3当量Fmoc-氨基酸、3当量TBTU和6当量DIPEA的DMF溶液。震荡所述溶液180分钟。滤出树脂并用DMF，DCM和乙醚洗脱。反应的完成程度通过茚三酮检测法检测。

[0144] 在装载树脂后，装填密度通过紫外吸收法检测。检测到脱离的Fmoc-二苯富烯(dibenzofulven)物质的吸收度在292nm。所有Fmoc-氨基酸的树脂装载量为0.5mmol/g，除了N-甲基氨基酸，N-甲基苏氨酸(叔丁基)，叔丁基甘氨酸和N-甲基缬氨酸，其导致了约0.4mmol/g的替换。

[0145] 偶联步骤

[0146] 向树脂中加入含30％哌啶的DMF溶液，并将所得混合物孵育5分钟。滤出树脂，重复该步骤15分钟。滤出树脂并用DMF洗脱。

[0147] 将Fmoc-氨基酸(3当量)用于DMF中的HOBt(3当量)溶解。向树脂中加入含有DIPEA(6当量)的偶联试剂DIC(3当量)或者TBTU(3当量)以及Fmoc-氨基酸。

[0148] 在经过180分钟(DIC)或者120分钟(TBTU)的偶联后，滤出偶联试剂，并用DMF，DCM和乙醚洗脱树脂。

[0149] 在N-甲基氨基酸后偶联Fmoc-氨基酸

[0150] 用净(dry)THF清洗树脂，并用在净THF中的DIPEA(14当量)孵育1-2分钟。滤出树脂。将Fmoc-氨基酸(3.5当量)溶解在于净THF中的BTC溶液(68mM)中。加入2，4，6-三甲基吡啶(10当量)，并向树脂中加入所得悬浊液。在180分钟后，滤出树脂并用DCM，THF和DMF洗脱。偶联反应的完成度通过四氯苯醌实验进行检查。

[0151] Me2-氨基酸的N-端偶联：

[0152] 将Me2-氨基酸(3当量)以及HOBt(3当量)，HATU(3当量)和DIPEA(6当量)溶解在DMF中。向树脂中加入所得溶液并摇动2小时。滤出树脂并用DMF，DCM和乙醚洗脱。

[0153] 脱离

[0154] 在3小时内，肽从树脂和用三氟乙酸/TIS/水(92.5/5/2.5)脱保护的侧链上脱离。溶剂在真空下蒸发。所得油状物用乙醚处理从而沉淀出来，用乙醚清洗2次。通过超声将肽溶解在叔丁基醇/水(80/20)中，并进行冻干。

[0155] 所有的Fmoc-氨基酸，标准的侧链保护剂：叔丁基(苏氨酸)和叔丁氧羰基(赖氨酸，鸟氨酸，α，γ-二氨基丁酸)

[0156] Nα，Nα-二甲基氨基酸可以用Garcia-Lopez，MT et al.，Archiv der Pharmazie(1989)，322，145-152中所述方法合成。

[0157] 本发明所获得的化合物如下表1和表2所示。

[0158] 表1：

[0159]

[0160]

[0161]

[0162] 表2：

[0163]

[0164]

[0165]

[0166]

[0167] 生物实验

[0168] A.在蛋白质水平和基因表达水平检测细胞因子分泌

[0169] 分别从健康受试者的外周血和未经任何处理的(naive)C57BL/6小鼠的次级淋巴组织分离出初始T细胞。所得细胞分别用佛波醇-12-十四酸酯-13-乙酸酯(PMA)/离子霉素和γ干扰素(IFN-γ)刺激48小时，以活化所得细胞。所得到的活化细胞释放出促炎性细胞因子。平行地，也分别用PMA/离子霉素和IFN-γ活化人类(HaCaT)角质细胞系。已知分别用PMA/离子霉素和IFN-γ处理将导致促炎性细胞因子IL-1，IL-2，IL-6，IL-17，IFN-γ或TNF-α的释放增加。同时，抗炎性IL-10的释放被抑制。在分别加入PMA/离子霉素和IFN-γ后两天，测定了上清液中诱导分泌的IL-1，从而证实细胞被激活。此后，用不同剂量(10-7M，10-9M和10-11M)的三肽、PBS(阴性对照)以及α-促黑激素(α-MSH)，K(D)PT、霉酚酸酯(MMF)和地塞米松(分别作为阳性对照)处理所述细胞。在刺激后48小时和72小时测定三肽的抗炎性。基于FACS分析的13-plex系统用于显示上清液中促炎性细胞因子分泌减少。IL-1，IL-2，IL-6，IL-12p70 IL-17，IFN-γ和TNF-α的数据被认为相关度最高。因此，优选地，所述三肽的抗炎性的分析是基于由这些分析所获得的结果。此外，通过mRNA的制备和随后的RT-qPCR分析证实这些结果。使用这些方法，确定了诸如IL-6，IL-17，IFN-γ和TNF-α等促炎性标记物的基因表达。

[0170] 在第一个实验中，可以看出，与阳性对照K(D)PT相比，实施例3、8和9尤其显示出更强的抗炎效果的特性。这些实施例不但可以减少被活化的初始小鼠T细胞和初始人类T细胞中促炎性细胞因子的分泌，而且可以更有效地减少人类角质细胞中促炎性细胞因子的分泌。上述所有三肽抑制了所分析的促炎性细胞因子(IL-1，IL-2，IL-6，IL-17，IFN-γ或者TNF-α)中至少三种的分泌，比阳性对照K(D)PT的抑制程度更大。另外，在角质细胞中观测到了抗炎性细胞因子IL-10的分泌诱导(表3-5)。用实施例1和2处理导致角质细胞中促炎性细胞因子的分泌减少。

[0171] 对于实施例3、8和9，通过测定上清液的细胞因子数据所得到的结果在基因表达水平得到了证实。RT-qPCR实验显示了实施例3和8的免疫调节活性，与作为阳性对照的K(D)PT具有可比性。用所述化合物刺激后，IL-6，IL-17，IFN-γ和TNF-α的mRNA表达在人类T细胞和小鼠T细胞中减少。此外，用实施例3、8和9处理与HaCaT角质细胞中促炎性细胞因子的基因表达的减少相关(图1-3)。

[0172] 在第二个实验中，可以看出，实施例12可以减少所有三种细胞模型中促炎性细胞因子的表达。其活性与K(D)PT的活性具有可比性。用实施例6和13处理导致了人类T细胞和人类角质细胞中促炎性细胞因子的表达下降。对于实施例5和7，免疫性调节作用可见于人类T细胞和小鼠T细胞(表6-8)。

[0173] 促炎性标记物(诸如IL-6，IL-17，IFN-γ和TNF-α)的编码基因的表达如前所述进行测定。实验结果显示了，用实施例13刺激导致所有被刺激的细胞中促炎性标记物的表达降低(图4-6)。

[0174] 在第三个实验中，小鼠T细胞和人类T细胞以及HaCaT细胞用PMA/离子霉素进行刺激，并用实施例14，15，16和17以10-7M，10-9M和10-11M进行处理。使用Luminex技术测定上清液中细胞因子(T细胞中的IFN-γ，IL-17和IL-10以及HaCat的IFN-γ)浓度。测定了Il-1β，IL-6和TNF-α编码基因的表达。在所有的细胞类型和所有测试的浓度中，用实施例14，15，16和17处理导致促炎性细胞因子Il-1β，IL-6和TNF-α在mRNA水平的表达降低。此外，上清液中促炎性细胞因子IFN-γ和IL-17的浓度降低，而抗炎性细胞因子IL-10的浓度增加。而且，对所测试的所有浓度都能观测到该结果。

[0175] 本发明所选择的实施例的抗炎和免疫调节作用与常规的免疫抑制剂进行了对比。因此，用MMF或者地塞米松刺激分别用PMA/离子霉素和IFN-γ活化的细胞。接着，在蛋白质水平和基因水平分析促炎性细胞因子的分泌(表9和图4-6)。令人惊讶发现：相比于所观测到的MMF的免疫调节活性，实施例13显示出更高的免疫调节活性。

[0176] 对于生物实验，选择不同起源的两种人类细胞系，以对所获得的结果进行转化(translation)。HaCaT细胞属于用于科学研究的永生性人类角质细胞系的细胞类型。其在研究中的应用允许使用模型表征人类角质细胞，该模型是可重复的并且代表了人类上皮细胞系。相比之下，人类T淋巴细胞(T细胞)是一类淋巴细胞(自身是白细胞的一种类型)，其在细胞介导的炎症/免疫中扮演着核心角色。

[0177]

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[0196] B.小鼠的血管炎模型

[0197] C57BL/6小鼠接受了LPS皮内注射。在第二天，通过皮内注射TNF-α诱导血管炎。此外，注射偶氮蓝(Evan’s blue)。在注射TNF-γ后24小时，小鼠被挠伤。测定耳部厚度，并通过计算出血点评估血管炎程度。在耳部组织的偶氮蓝含量作为血管渗透性的标记物。通过组织学、FACS和RT-qRCR分析耳朵。

[0198] 用实施例13(皮下)处理导致耳部厚度降低，并且出血点数量降低。在组织学上，可以观测到炎性渗透减少。

[0199] C.小鼠内咪喹莫特-诱导的银屑病

[0200] 通过局部每天施用咪喹莫特8天诱导Balb/c小鼠的银屑病。用测试物治疗动物(局部或全身)。在第九天，用临床计分系统表征皮肤表型(0＝正常小鼠皮肤；1＝轻微变红；2＝红疹；3＝红疹，肿胀；4＝红疹，肿胀，鳞片；5＝红疹，肿胀，鳞片，(血性)损伤)。在组织结构上分析皮肤。通过流式细胞术和RT-qPCR分析淋巴结。受损皮肤的mRNA表达通过RT-qPCR分析。血清中细胞因子的浓度使用Luminex技术进行评估。

[0201] 相对于空白对照，用实施例13(静脉注射)治疗导致表皮突(rete ridge)的尺寸减小。临床得分降低。在损伤皮肤中IL-17，IFN-γ，IL-23，IL-36和IL-22的mRNA表达降低。在接受过治疗的小鼠血清内TNF-α和IL-17的浓度降低。

[0202] 用实施例14，15，16和17(静脉注射)治疗导致临床得分降低，且表皮厚度降低。在接受过治疗的小鼠的血清内TNF-α和IL-17的浓度降低。在受损皮肤内，IFN-γ和IL-36的mRNA表达相对于空白对照降低。

[0203] D.小鼠内硫酸葡聚糖(DSS)诱导的结肠炎

[0204] 用含2.5％的硫酸葡聚糖(DSS)的饮用水处理C57BL/6小鼠7天，诱导结肠炎。用检测物检测小鼠。每天检测体重。在第八天，小鼠被挠伤。进行潜血(haemocult)实验。测定结肠的尺寸。使用H&E染色剂(H&E stains)计分系统测定结肠炎。用RT-qPCT分析结肠样品中的mRNA表达。

[0205] 与空白对照相比，用实施例13(腹腔注射)治疗导致体重减少量降低。结肠尺寸部分正常化。在组织学上观测到疾病改善。与空白对照相比，观测到LY-6G，MPO，IFN-γ，IL-6和TNF-α的mRNA表达降低。

[0206] E.皮肤渗透研究

[0207] 用离体的人类皮肤进行皮肤渗透研究。组织样品术后用生理盐水清洗，去除皮下脂肪层。钻取活组织(直径20mm，3.14cm2)，并在-20℃下保存。在渗透研究开始时，解冻全厚(full thickness)皮肤样品并用棉签弄干。渗透研究是在Franz扩散池中进行。含有所述三肽化合物的乳膏基质被施用于皮肤并分布均匀。皮肤样品被放置在预先温度调至32℃的扩散池上。分别在30，100和300分钟后，用棉签去除残留的组分。在从扩散池去除后，取3块钻取的活组织(直径6mm)。制备水平切面，从中提取出三肽化合物。用HPLC-MS分析所有提取物和受体介质中的肽含量。

[0208] F.溶液稳定性

[0209] 将含有0.02％叠氮化钠的三肽化合物水溶液(c肽＝160μg/ml)(1500μL)及不含有叠氮化钠的三肽化合物的水溶液(1500μL)分别在32℃和8℃进行孵育。在0，30，100，300和1000分钟取样。将100μL样品用1900μL含内标(internal standard)的甲醇稀释，并用HPLC-MS进行分析。所有的分析重复三次。

[0210] 对于实施例3，8和9，甚至在1000分钟后，没有观测到降解。

[0211] G.在人类皮肤匀浆中的稳定性

[0212] 人类皮肤样品(耳部皮肤，脐区皮肤和青少年包皮)被混合在一起，冷冻在液氮中，搅匀。所得到的人类皮肤匀浆被分批(50-70mg)转移到蛋白质LoBind试管(2mL)中，并在-32℃下保存至使用。在稳定测试开始时，解冻人类皮肤匀浆。加入含有0.02％叠氮化钠或者不含叠氮化钠的三肽化合物水溶液(1500μL)(c肽＝160μg/mL)，所得混合物在32℃下孵育。在0，30，100，300和1000分钟取样。100μL样品用含有内标的1900μL甲醇稀释，并用HPLC-MS进行分析。所有的分析重复三次。

[0213] 对于实施例8，分别在30分钟和100分钟后，测试溶液仍含有94-95％的起始浓度。在300分钟后进行观测，降至77-80％，在1000分钟后进行观测，分别降至40％(没有叠氮化物)和47％(含有叠氮化钠)。

[0214] 在300分钟后，溶液中实施例9的量分别减少至58％(没有叠氮化物)和63％(含有叠氮化钠)。

[0215] 对于实施例3没有观测到降解。在所有时间点所有样品含有80-90％的起始浓度。

[0216] 药物组合物实施例

[0217] 实施例3的组合物：

[0218]

[0219] 实施例8的组合物

[0220]

[0221] 实施例3的组合物：

[0222] 作为本发明化合物口服组合物的具体实施例，将21mg实施例3与足够精细的乳糖一起配制，总量为580～590mg，填充0号硬质明胶胶囊。

[0223] 实施例9的组合物：

[0224] 作为本发明化合物口服组合物的另一个具体实施例，将17mg实施例9与足够精细的乳糖一起配制，总量为580-590mg，填充0号硬质明胶胶囊。