[0001] 本发明涉及来源于斑节对虾的鲜味肽及其应用，属于生物活性肽技术领域。

[0002] 鲜味是一种基本的味觉感受，能极大地改善食物的整体味道，从而产生愉悦的味觉体验，刺激食欲。研究表明，许多物质都具有鲜味特征，如肽和游离氨基酸等。鲜味化合物广泛存在于动植物产品中，其中海产品是鲜味成分的主要来源之一。Yoshio Yamasaki和Kazuyuki Maekawa在1978年分离出第一条鲜味肽KGDEELSA后，鲜味肽开始受到广泛关注。随后又从不同来源中发现了许多鲜味肽。由于水产品特殊的味道特征，海洋蛋白质是鲜味肽的重要来源之一。在水产品中有许多已被鉴定的鲜味肽，如大西洋鳕鱼中含有鲜味肽LVDKL、ESKIL；金鲳鱼中含有鲜味肽APAP、ASEFFR、LGDVLVR、AEASALR和WDDMEK；在文蛤中也发现了GLLPDGTPR、RPNPFENR、STMLLESER和ANPGPVRDLR等鲜味肽。鲜味肽是一种低分子量肽，具有独特的鲜味特性，分子量一般不超过3 kDa。

[0003] 斑节对虾是一种味道鲜美、营养丰富的物种，广泛分布于热带和亚热带水域，是挖掘和利用鲜味肽的潜在资源。然而，迄今为止，关于斑节对虾鲜味肽的研究还很有限。

[0004] 酶解是制备鲜味肽的主要方法。酶解后，酶解液通过不同分子量的超滤膜进行分离，然后进行纯化，最后对得到的肽进行鉴定。然而，传统的鲜味肽制备方法费时费力且难以控制，不利于降低生产成本；因此，人们开始采用计算机模拟、分子对接和各种生物信息学技术来克服这些问题，同们还可以通过生物信息学技术预测肽对人体的不利影响，以确保其安全性。最近，BIOPEP‑UWM和ExPASy PeptideCutterd等程序的出现，使得虚拟酶解技术受到广泛关注，为研究人员成功获得鲜味肽提供了便利。

[0005] 鲜味肽及其衍生物通过与受体的相互作用，可以通过多种方式改变食物的味道。因此，研究鲜味肽与鲜味受体的相互作用，有利于更好的了解鲜味呈现机制。人体通过一系列专门的味觉受体感知基本味觉，这些受体将这些刺激转化为可识别的神经信号。T1R1和T1R3是研究最为广泛的味觉受体，它们被归类于G蛋白偶联受体（GPCR）家族，其味觉识别结构域被称为“捕蝇草”结构域（VFTD），T1R1和T1R3已被证明对味觉感知过程至关重要。尽管T1R1/T1R3复合物的晶体结构尚未解析，但同源建模技术可以预测蛋白质结构。

[0032] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域技术人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。

[0033] 下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法、检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法、检测方法。

[0034] 实验 鲜味肽的虚拟筛选及验证1 材料与方法
1.1 实验材料
用于电子舌的氯化钾（KCl）、氯化钠（NaCl）和谷氨酸钠（MSG）购买自索莱宝生物科技有限公司（中国北京）。盐酸奎宁购买自上海源叶生物科技有限公司。用于感官的味精、氯化钠、蔗糖和柠檬酸均为食品级，购买自三亚旺豪超市。实验中使用的所有化学品和试剂均为分析级。目标肽由上海生工生物技术有限公司合成(中国上海）。

[0035] 1.2 虚拟酶解斑节对虾肌球蛋白序列来自NCBI数据库（NCBI：XP_037785821.1），使用BIOPEP‑UWM进行虚拟酶解。

[0036] 首先，将从NCBI数据库中获取的蛋白序列输入服务器，然后，选择虚拟酶解所需的酶。本研究使用六种酶进行虚拟酶解：胰凝乳蛋白酶（EC：3.4.21.1）、胰蛋白酶（EC：3.4.21.4）、胃蛋白酶（pH 1.3；EC：3.4.23.1）、蛋白酶P1（EC：3.4.21.96）、菠萝蛋白酶（EC：
3.4.22.32）和木瓜蛋白酶（EC：3.4.22.2）。

[0037] 1.3 虚拟筛选两个机器学习程序UMPred‑FRL和iUmami‑SCM被用来预测多肽的鲜味特征。随后，使用PeptideRanker工具对其活性进行了预测，从而筛选出得分大于0.5的多肽。选出两个机器学习程序都显示为鲜味且PeptideRanker评分大于0.5的多肽作为潜在鲜味肽，并使用ToxinPred工具预测多肽毒性，使用AllerTOP v. 2.0工具预测多肽过敏性，使用Innovagen工具预测多肽水溶性。

[0038] 1.4同源建模由于缺乏人类味觉受体T1R1和T1R3的晶体结构，我们采用同源建模的方法生成它
们的3D结构。首先，从UniProt数据库中获得T1R1（UniProt ID：Q7RTX1）和T1R3（UniProt ID：Q7RTX0）的氨基酸序列，然后，根据氨基酸序列使用SWISS‑MODEL建模工具进行模板搜索，按照序列一致性（seq id）对搜索结果进行排序，得到鳉鱼味觉受体T1r2a‑T1r3的晶体结构（PDB id：5X2M）与目标序列一致性最高，故将其作为同源建模的模板，生成初步的同源模型。

[0039] 利用GROMACS 2023对初步同源模型进行分子动力学模拟，进一步优化初步同源模型。使用Amber99sb‑ildn力场和TIP3P水模型对蛋白进行非约束分子动力学模拟。模拟体系均采用正方体溶剂化盒子，伴随性周期边界条件为1 nm。首先，进行了500 ps的NVT和500 ps的NPT平衡，以稳定该系统。随后，对复合物进行了持续50 ns的分子动力学（MD）模拟。模拟结束时选择稳定的构象输出。使用SAVES  v6.0服务器绘制的拉马钱德兰图（Ramachandran Plots）进一步评估蛋白质构象的合理性，并使用Deepsite预测结合位点和活性口袋。经过验证的同源模型被用于后续的分子对接研究。

[0040] 1.5 分子对接使用ChemDraw 21.0软件绘制多肽的分子结构式，并在Chem3D 21.0中打开多肽的
分子结构式，得到多肽的三维结构，多肽经MM2力场优化后保存为mol2格式。

[0041] 对优化后的受体模型进行脱水和加氢处理，并使用Autdock 1.5.7计算gasteiger charge，最后将所有原子设置为AD4类型并保存为PDBQT格式。在PyRx中使用Autodock Vina算法将处理后的T1R1/T1R3与潜在的鲜味肽进行分子对接，使用Discovery Studio 4.5 Client分析分子对接结果。

[0042] 1.6 肽的合成所有多肽（ACWVPCEK、QRMMQ、DAKKACW、DRM、RMM、PDPDPT、EACWVPCEK、DDRM、DRMM和RMMD，氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1～10所示）使用Fmoc固相合成法合成，合成肽的纯度大于95%，并经过脱盐处理。

[0043] 1.7 感官评价在感官分析实验室进行感官评价，感官分析实验室的照明正常，温度为23±2℃。8名小组成员（4名女性和4名男性，年龄在20～30岁之间）在感官评定前均按照ISO 8586‑1:
2012的标准进行培训，并由监督员指导。样品使用7分制进行评分，柠檬酸（0.43%）、蔗糖（5.76%）、盐酸奎宁（0.0195%）、氯化钠（1.19%）和味精（0.595%）溶液被用来代表五种基本味道，其强度设为5分。

[0044] 使用三角测试（TDA）确定合成肽的鲜味阈值。制备浓度为1 mg/ml的鲜味肽溶液，以1:1的比例用去离子水逐级稀释，并按浓度递增的顺序将其呈现给感官小组。在三角测试中，参与者同时获得三种溶液，并选出与其他两种溶液不同的一种。

[0045] 无论选择正确与否，下次将继续使用更高浓度的溶液。如果小组成员只能区分前一个样品和空白对照，但无法区分后一个浓度水平的样品，则计算两个浓度水平的平均值来得到个人阈值，将小组成员个人阈值的平均值作为肽的阈值。

[0046] 为了评价协同增鲜效果，以1分（0.1% MSG）、5分（0.35% MSG）和9分（0.6% MSG）作为三个鲜味水平以供参考。用0.35%的味精溶液配制浓度为1 mg/ml的合成肽溶液，小组成员根据参考溶液对样品进行评分。

[0047] 合成肽的协同增鲜阈值是使用三角测试法进行测定的。合成肽的配制使用0.35%的味精溶液作为溶剂。确定协同增鲜阈值的方法与确定鲜味阈值的方法相同。

[0048] 1.8 电子舌测试使用去离子水配制浓度为0.3 mg/ml的合成肽溶液用于电子舌分析。使用SA‑402B型味觉分析系统（Insent SA402B，日本东京）测定潜在鲜味肽的味觉特征。

[0049] 1.9 鲜味肽的理性设计多肽（DAKKACW、QRMMQ、RMM、DRM、ACWVPCEK）基于D/E共识效应进行序列优化，即在多肽的N/C端分别添加D/E残基，以增强鲜味。使用上述1.3中描述的方法筛选多肽，选出符合条件的多肽。采用与上述1.5中相同的对接方法将筛选出的多肽与T1R1/T1R3进行分子对接，并选择对接Vina分数低于优化前的多肽进行进一步分析。

[0050] 1.10 数据分析数据以平均值±标准差表示。使用SPSS 26和Origin 2021进行了单变量方差分析
和邓肯多重比较分析。P＜0.05为差异显著。

[0051] 2 结果与讨论2.1 斑节对虾肌球蛋白的虚拟酶解及肽的性质预测
蛋白质是虾肌肉的主要成分，大多数水生动物肌肉的蛋白质含量为16%～20%。在
水生动物肌肉蛋白中，肌纤蛋白占总蛋白的50%以上，其中肌球蛋白占肌纤蛋白的40%～
50%。经过在NCBI数据库中搜索与斑节对虾肌球蛋白相关的序列，选择含有1987个氨基酸的斑节对虾肌球蛋白进行虚拟酶解。采用胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶P1、菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶这六种酶进行虚拟酶解，共获得1862个肽段（≥2个氨基酸，含重复）。

[0052] UMPred‑FRL（得分大于588）和iUmami‑SCM（得分大于0.5）用于预测上述多肽的鲜味特性。生物活性预测使用PeptideRanker，如果多肽的PeptideRanker得分高于0.5，则被认为具有潜在生物活性。

[0053] 毒性和过敏性也是评估多肽应用价值的两个重要指标。ToxinPred是一种计算机模拟工具，用于预测多肽和蛋白质的毒性，也有助于设计毒性较低的多肽，并识别蛋白质中的毒性区域。同时，还使用AllerTOP v.2.0工具和Innovagen工具进行了过敏性和水溶性预测。有研究表明，大多数海洋源鲜味肽序列长度为7～12个氨基酸，因此我们选择了序列长度小于12个氨基酸的肽进行进一步研究。

[0054] 2.2 同源建模T1R1/T1R3是鲜味肽的主要受体。然而，其晶体结构尚未解析。因此，构建T1R1/
T1R3受体时使用了同源建模技术。5X2M与T1R1/T1R3的序列一致性最高，两者的序列相似度高达40%，因此被用作同源建模的模板。

[0055] 利用SWISS‑MODEL构建T1R1/T1R3味觉受体的同源模型，使用MD模拟对模型进行优化，经过50 ns的优化后，其结构更加开放，具有明显的向外扩张特征，如图1所示，图2为优化后的最终模型。

[0056] RMSD用于评估系统中复合物的稳定状态，蛋白质紧密度则通过计算回转半径（Rg）来评估。如图3所示，40 ns后RMSD趋于稳定。如图4所示，与优化前相比，模型的Rg值有所下降，这表明模型呈现出更开放的构象，有利于多肽进入其活性口袋。

[0057] 通过MD模拟优化受体后，使用SAVES v6.0对优化模型进行了评估。图5的拉马钱德兰图表明，99.8%的氨基酸残基在合理区域内，其中84.6%在最佳区域内，14.7%在额外允许区域内，0.5%在最大允许区域内。只有0.2%的残基位于不允许区域。位于合理区域内的氨基酸比例超过了90%的临界值，证明所构建的受体是合理的，使用该受体用于后续的分子对接研究。

[0058] 2.3 分子对接利用Deepsite预测了经MD优化的T1R1/T1R3同源模型的结合口袋，结合口袋位于
VFTD内。

[0059] 根据Vina评分进一步筛选2.1中得到的肽，结果如表1所示。通常，配体与受体的结合能越低，说明两者之间的结合能力越强。因此，我们选择了Vina得分小于‑7.0的肽，并通过感官评价和电子舌实验进行鲜味验证。由于DAKKACW和YDAKKACWV有重复序列，我们选择了DAKKACW进行进一步研究。对接结果表明，这些潜在鲜味肽的Vina评分与肽段长度之间没有必然联系。

[0060] 2.4多肽的感官特性利用分子对接和机器学习的结果筛选多肽，合成出符合条件的多肽。通过电子舌
实验和感官评价来确认其感官特性。合成肽的感官评价结果（图6）显示，大多数肽都表现出一定程度的鲜味，其中五条肽表现出更明显的鲜味（P＜0.05）。酸味在所有受测肽中都很普遍，这可能是合成过程中引入的乙酸盐和游离氨基酸造成的，也可能是电离的结果。为了更全面的了解合成肽的味道特征，感官评价小组成员进一步评价了肽的鲜味阈值（结果如表2所示）、协同增鲜效果（图8）和协同增鲜阈值。其中，PDPDPT（0.08±0.052 mM）的鲜味阈值最低，与已报道的DGGRYY的鲜味阈值相近，其余肽的鲜味阈值均低于已报道的YVDPNVLPE、EDG、DQR和NNP的鲜味阈值。通过评价协同增鲜效应发现，ACWVPCEK具有更明显的协同增鲜效应 ，其协 同 增鲜 阈 值为 0 .3 4  m M ，低 于 已报 道 的 DE A GP S IV H 。

[0061] 图7展示了合成肽的电子舌实验结果。结果与感官评价结果一致，都表明合成肽具有明显的酸味。电子舌实验结果表明，合成肽缺乏鲜味，但表现出明显的咸味。这可能是由于咸味和鲜味之间的相似性，导致电子舌难以区分。这些结果凸显了味觉感知的复杂性，证明味觉特性需要大脑的参与。因此，人类感官评价对于全面评估和测量特定味觉属性仍然至关重要。所以将感官评价作为主要指标，电子舌实验结果作为参考。根据感官评价结果显示，合成肽还具有其他味道，如咸味、苦味等。感官评分较好（P＜0.05）的五条肽被选择用于分析它们的呈鲜机制。

[0062] 2.5 鲜味肽与T1R1/T1R3的相互作用分析根据感官评价结果，选择了DAKKACW、ACWVPCEK、DRM、QRMMQ和RMM进行相互作用机制研究。主要结合位点如图9所示，其中HIS145、TYR167和SER392在鲜味肽与T1R1/T1R3的结合过程中发挥重要作用，HIS145出现在每条肽的对接位点中。

[0063] 图10显示了T1R1/T1R3与多肽之间的相互作用力。T1R1/T1R3与多肽之间的作用力主要是非共价作用力，如常规氢键、范德华力和吸引电荷。对于这5条肽来说，常规氢键是主要作用力，HIS145和TYR167是形成常规氢键的主要位点，而GLN389与RMM的关系值得注意，它与RMM形成了3个常规氢键。碳氢键主要存在于DAKKACW、ACWVPCEK、DRM和QRMMQ中，其中GLY168与QRMMQ之间形成了2个碳氢键。在DRM、QRMMQ和RMM中都存在吸引电荷，形成这种作用力的位点都是GLU301。然而，在DAKKACW和ACWVPCEK中没有吸引电荷，据此推测，短肽可能倾向于形成吸引电荷，或者是R/M氨基酸倾向于形成吸引电荷。具体来说，HIS145和TYR167参与氢键的形成，而GLU301则通过与肽产生吸引电荷参与相互作用。

[0064] 2.6 肽的理性设计通过在肽段的N/C端添加D/E两种氨基酸来建立D/E共识效应组，对改善肽的鲜味
有积极影响。所以根据D/E共识效应对多肽进行优化，优化后的多肽如图11所示。在预测了鲜味、生物活性、毒性、过敏性和水溶性之后，符合条件的多肽与鲜味受体进行了对接。

[0065] Vina得分低于优化前多肽的肽段被选择用于后续实验。表3展示了对接得分。图12展示了优化后的多肽与受体之间的相互作用，与优化前相比，每种多肽都出现了接触损失，但多肽与受体之间的许多作用力仍然存在，这说明在味觉呈现中，一些发挥作用的氨基酸是保守的。常规氢键是最普遍的相互作用力。

[0066] 图13、图14显示了优化后多肽的感官特征。通过与优化前的多肽进行比较，我们发现其鲜味得分与优化前的多肽并无不同。这可能是由于多肽的鲜味受多种因素的影响，如多肽的疏水性和电荷等因素。因此，可能很难通过单一的D/E共识效应来优化鲜味。此外，我们进一步分析了合成肽的阈值，发现除DRMM外，所有肽的阈值与优化前相比都得到了降低，这表明D/E共识效应对鲜味的影响可能不限于增强鲜味，还可能改变阈值或产生其他积极影响。通过优化降低了鲜味肽的阈值，这表明在产生相同鲜味的条件下，可以减少鲜味肽的用量，从而节约成本。利用D/E共识效应理性设计多肽结构也为改善鲜味肽的功能提供了参考。

[0067] 3 结论本发明利用虚拟酶解和虚拟筛选技术，成功地从斑节对虾肌球蛋白中快速筛选出
六条鲜味肽，并验证了它们的感官特征。发现ACWVPCEK具有协同增鲜效果，协同增鲜阈值为
0.34 mM。根据D/E共识效应对获得的肽进行了优化。优化前后多肽的阈值范围分别为0.080～0.386 mM和0.074～0.188 mM，优化后多肽的鲜味阈值普遍低于优化前，表明D/E共识效应对肽的鲜味有一定的积极作用。分子对接结果表明，范德华力和传统氢键是呈鲜过程中的主要作用力，其中HIS145等氨基酸是主要的结合位点。该研究丰富了海洋来源的鲜味肽库，提高了斑节对虾的经济价值，并为研究不同结构鲜味肽的呈鲜机理提供了参考。

[0068] 给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。