[0001] 本发明涉及丁酸梭菌的新用途，具体涉及丁酸梭菌在制备预防与治疗血管性痴呆组合物中的应用，属于生物制药领域。

[0002] 血管性痴呆(vascular dementia，VaD)是多种脑血管疾病基础上出现的脑组织损害，进而以认知功能障碍为主要临床表现的综合征。研究表明，VaD是仅次于老年痴呆症(Alzheimer′s disease AD)的第二大痴呆症，约占我国全部痴呆患者的一半，我国VaD的患病率为1.1％～3.0％，年发病率在5～9/1000人，并且发病率呈逐年上升的趋势，在65岁以上的脑卒中患者中，约25％～41％的卒中患者在三个月内可发展为VaD。随着我国社会老龄化的来临，脑血管病患者将会越来越多，VaD发病人数也不断增加，严重危害着个人健康，并给社会和家庭造成沉重的经济压力。目前，就VD的发病机制提出凋亡、氧化应激、炎症反应、兴奋毒性氨基酸、胆碱系统等发病机制。研究中发现VD与细胞凋亡确实存在着密切关系。细胞凋亡(apoptosis)又称为程序性细胞死亡(Programmed cell death，PCD)，是生物界细胞死亡的一种特殊类型，即在某些生理或病理性因素诱导下，激活膜信号系统，启动有关调控细胞凋亡的程序基因，最终导致细胞按一定程序控制自我破坏和死亡。根据其作用可将参与神经元调亡的基因和蛋白质产物分成两类：一类抑制神经元调亡，另一类促进神经元调亡。

[0003] VaD为多因素疾病，与高血压、糖尿病、高血脂等因素有关，发病机制可能与以下几个因素有关：(1)中枢胆碱能系统功能障碍，VaD是由脑血管病引起的一种涉及中枢胆碱能神经元及其突触、递质等方面的改变的，慢性进行性获得性智能损害和认知障碍的综合征；(2)氧自由基生成增加。氧自由基可以影响细胞膜的功能，导致细胞膜对一些离子通透性
2+ 2+ 2+
增加，特别是对Ca 通透性增加，细胞内Ca 浓度升高，引起Ca 超载，加重神经细胞损伤；
(3)兴奋性神经递质，谷氨酸(Glu)是一种酸性氨基酸，广泛分布于中枢神经系统中如大脑皮质、海马等，脑组织缺血后能量代谢发生异常，造成体内ATP水平迅速下降，增强了Glu的+ 2+
逆向转运，细胞内Glu含量急剧升高，与NMDA等受体结合，增加Na和Ca 内流，引起细胞
2+
肿胀、Ca 超载，产生的花生四稀酸、氧自由基，破坏生物膜，引发DNA、蛋白质降解，最终导致神经细胞死亡；(4)炎症反应等。但迄今为止，VaD的发病机制尚不完全明确，因而缺乏有效的治疗药物。现有临床治疗手段或药物(如胆碱酯酶抑制剂、N-甲基-D-天冬氨酸受体拮抗药等)均不能完全控制VaD的所有症状或者延缓甚至逆转其进程，治疗效果不理想，并有副作用，影响患者健康，治疗和预防VaD成为医学上的难题，本发明的益生菌制剂部分解决了这一医学难题，能有效防治VaD，而且无副作用，对机体无损害，社会意义巨大。

[0004] “益生菌”是活性的微生物，可以有效改善肠道菌群结构，抑制病原菌，产生良好的健康效应，目前已制备成药品、保健品或饮品等益生菌制剂。通过改善肠道菌群调节和治疗全身疾病现在越来越成为科学界的共识，临床实践中发现很多的神经系统疾病，如自闭症、抑郁症，都与肠道菌群紊乱有密切的联系，与人体的脑-肠轴有密切的关系，甚至有通过饮用酸奶减轻疾病症状的成功例子。脑-肠轴是一个存在于中枢神经系统和肠道菌群之间的复杂的双向交互系统，越来越被人所熟知。但是，通过益生菌调节肠道菌群防治血管性痴呆国内外未见相关报道。

[0005] 丁酸梭菌属(Clostridium butyricum)作为重要的益生菌，先前已广泛地应用来预防和治疗肠炎、便秘等疾病。丁酸梭菌属一般存在于土壤、动物和人体的肠道中，是革兰氏阳性厌氧杆菌，能耐受胃酸进入肠道，分泌肠粘膜再生和修复的重要营养物质酪酸(丁酸)，修复受损伤的肠粘膜，消除炎症，营养肠道，对各种原因包括肠道细菌感染、肿瘤化疗、外科手术等所致的肠道疾病具有良好的疗效。酪酸梭菌不仅对便秘、抗生素相关性腹泻等肠道炎症疾病有效，对肠脑疾病，如肠易激综合征(IBS)、炎性肠道疾病(IBD)和肝性脑病(HE)也具有治疗作用。有研究证明，肠道菌群与脑功能活动能够相互影响，其中脑-肠轴是重要的生理基础。脑-肠轴是中枢神经系统与胃肠道功能相互作用的双向调节轴，其包括中枢神经系统(CNS)、自主神经系统(ANS)、下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴、肠道内神经系统(ENS)等结构，各部分功能相互协调。大脑通过脑-肠轴对胃肠道活动及肠道菌群产生影响。在慢性应激小鼠模型中小鼠除伴有抑郁症状外，其胃肠道常有低度炎症浸润，同时肠道菌群也会发生改变。同时，肠道菌群对胃肠道活动也产生影响。并且研究证明肠道菌群对大脑神经系统的发育是至关重要的，即使是已成熟的中枢神经系统，其作用也不可忽视。在慢性应激中小鼠脑-肠轴会发生紊乱，产生抑郁、焦虑等情绪，给予益生菌治疗又可以使小鼠行为恢复正常。由此可见，肠道菌群、脑-肠轴、脑紧密关联，构成了肠道菌群-肠-脑轴，在人类健康机制中处于独一无二的地位。针对该通路，我们可以对许多疾病进行治疗。
因此，我们推测肠道菌群与血管性痴呆疾病可能存在着一定关系，肠道菌群与血管性痴呆的关系的研究未见报道。

[0025] 丁酸梭菌制剂组合物的制备是首先制备丁酸梭菌菌粉，然后按照需要填加相应辅料制成相应的剂型，本发明以口服丁酸梭菌活菌散剂具体制备为例，说明益生菌的制备方法，其它剂型的制备方法省略，不再一一说明，具体制备剂型并不局限于下面所述的方法。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

[0026] 实施例1丁酸梭菌(Clostridium butyricum)WZMC1016菌株的分离与鉴定[0027] 以一名健康青年人的粪便作为分离样品，在改良MRS琼脂培养基上，37℃厌氧条件下，48h涂布分离培养，获得本发明所述的丁酸梭菌(Clostridium butyricum)WZMC1016，鉴定为丁酸梭菌属。

[0028] 改良MRS培养基的配方：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，K2HPO42g，MgSO4·7H2O 0.5g，MnSO4·4H2O 0.2g，低聚果糖3g，柠檬酸二铵2g，琼脂15g，蒸馏水1L，调pH至7.0，115℃灭菌15分钟。

[0029] 本发明的丁酸梭菌(Clostridium butyricum)WZMC1016具有下述微生物学特征：

[0030] (1)菌落形态：呈乳白色，圆形稍凸，边缘不规则，直径1～3mm，表面略有光泽，液体培养基中有气泡产生。

[0031] (2)个体形态：为G+芽孢杆菌，菌体呈直或弯杆状，0.6～1.2×3.0～7.0μm，端圆，单个、成对、短链、偶见长丝状菌体。

[0032] (3)生理生化特征：麦芽糖(+)；甘露醇(+)；棉子糖(+)；乳糖(+)；核糖(+)；淀粉(+)。

[0033] 培养最适条件：厌氧下生长良好，有氧环境中不生长。最适生长温度35～40℃；最低生长温度25～28℃；最高43～45℃；生长最适pH 6.5～7.0；pH 4.5～5.0或8.0～8.5不生长。

[0034] 本发明的丁酸梭菌(Clostridium butyricum)WZMC1016，已于2014年10月22日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为丁酸梭菌属，保藏编号为CGMCC No.9831。

[0035] 实施例2丁酸梭菌(Clostridium butyricum)WZMC1016益生菌制剂组合物的制备[0036] 1.种子液制备：挑取丁酸梭菌(Clostridium butyricum)WZMC1016单菌落，接种于50mL改良MRS液体培养基中，pH为7.0±0.5，37℃，厌氧培养24h，即为种子液；

[0037] 改良MRS培养基的配方：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，乙酸钠5g，K2HPO4 2g，MgSO4·7H2O 0.5g，MnSO4.4H2O 0.2g，低聚果糖3g，柠檬酸二铵2g，蒸馏水1L，调pH至7.0，115℃灭菌15min。

[0038] 2.发酵培养：取步骤1的种子液，以1％接种量接种至新的改良MRS培养基中，37℃，厌氧培养24h，结束培养；

[0039] 3.收集菌体：取步骤2发酵液，以12,000rpm，10min条件，去除发酵上清液，离心分离出菌体；

[0040] 4.菌粉制备：取步骤3收集的菌体加入含有重量5％的谷氨酸钠和5％多脂奶粉冻干保护液中混合冷冻干燥后即可得到丁酸梭菌菌粉。

[0041] 5.成品制备：取步骤4所得干燥菌粉，依据丁酸梭菌的活菌数，按比例与药用载体(低聚果糖，葡萄糖，海藻糖等)混合，制备丁酸梭菌制剂组合物成品，成品的活菌数不低于7 7
1×10CFU/g或1×10CFU/mL。

[0042] 实施例3血管性痴呆的治疗动物实验

[0043] 目的：观察本发明丁酸梭菌制剂对血管性痴呆小鼠的学习记忆、脑内氧化指标和神经细胞形态学改变的影响。

[0044] 一、材料与方法：

[0045] 1.药物：丁酸梭菌(Clostridium butyricum)WZMC1016菌粉，含活菌数为8
1×10CFU/g，具体制备方法，详见实施例2。

[0046] 2.实验动物：ICR小鼠雄性，体重18-22克。

[0047] 3.血管性痴呆(VaD)小鼠模型制备及动物分组：采用永久性右单侧颈总动脉闭塞(rUCCAO)，小鼠麻醉后，固定于手术台上，分离和缝合用永久性的小丝线进行右侧颈总动脉，小鼠的体温保持在37℃恒温。血管性痴呆模型成功的小鼠分为模型组和丁酸梭菌WZMC1016治疗组。只开皮，不接扎列为假手术对照组，

[0048] rUCCAO后开始给酪酸梭菌WZMC1016治疗，按浓度1×109CFU/mL剂量0.2mL灌胃，每日一次，连续4周给药，阴性对照组及血管性痴呆模型组小鼠灌胃等量的生理盐水。全部小鼠均给予标准鼠饲料常规喂养。实验结束前一周对全部小鼠进行水迷宫神经行为学测试，神经行为学测试结束后，小鼠脑组织进行灌注固定，HE染色、TUNEL染色的病理学检测，电镜超微结构观察。

[0049] 4.学习记忆能力测试

[0050] 旷场实验和Morris水迷宫进行学习记忆能力测试，包括定向航行和空间探索实验。实验设备由视频采集系统、数据分析系统和四个象线的环形水池构成，检测实验动物的空间学习能力和空间记忆能力。

[0051] A)定向航行实验：将小鼠面向池壁分别从4个入水点放入水中，记录小鼠找到平台所需时间，即逃避潜伏期(escape latency)，连续测试5天。

[0052] B)空间探索实验：第6天撤除平台，测量小鼠在目标象线停留时间。

[0053] 5.病理组织学观察：用4％的多聚甲醛进行心脏灌流固定，取脑，石蜡包埋，切片。

[0054] 5.1 HE染色：将石蜡切片进行常规HE染色，石蜡切片常规脱蜡下行至蒸馏水中待染；切片置苏木素染色5min，自来水洗去多余的染料；切片入盐酸酒精中分化数秒；自来水充分水洗切片；1％伊红水溶液中5分钟，洗去多余的伊红；梯度酒精脱水、封片。

[0055] 5.2 TUNEL染色：TUNEL染色操作按说明书进行，TUNEL阳性细胞核染成棕黄色。

[0056] 6.应用PCR-DGGE技术测定肠道菌群变化，计算物种丰度指数，Shannon-Wiener指数，物种均匀度指数。行为测试后，将小鼠处死，迅速取出盲肠内容物。新鲜标本立即转移到冰盒实验室和存储在-80℃，DNA抽提试剂盒的粪便样品中提取细菌的基因组DNA。16S rRNA V3区PCR扩增产物进行DGGE，软件分析DGGE指纹图谱，割胶回收条带并克隆测序，将序列在GenBank数据库中进行同源性分析。

[0057] 7.统计学分析：实验数据以均数±标准差表示，采用SPSS 18.0统计软件进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)统计学分析，组间差异采用q检验，p＜0.05表示有统计学差异。

[0058] 二、实验结果：

[0059] 1.水迷宫实验结果

[0060] 神经行为学结果显示：血管性痴呆模型小鼠出现明显的学习记忆能力及判断能力的下降；酪酸梭菌治疗组明显改善血管性痴呆模型小鼠的学习记忆障碍，定向航行成绩(逃避潜伏期)明显缩短，与模型组比有显著性差异(p＜0.01)。以上结果表明本发明的酪酸梭菌WZMC1016组效果最为明显，具有明显改善血管性痴呆小鼠的学习记忆功能。实验结果见表1。

[0061] 表1 对小鼠定向航行成绩(逃避潜伏期)的影响

[0062]

[0063] 2.旷场实验结果

[0064] 模型组血管性痴呆小鼠运动的总距离和自由活动时间明显比假手术组(P＜0.05)少，而经过酪酸梭菌WZMC1016治疗的小鼠运动总距离和自由活动时间有明显上升(P＜0.05)，小鼠活动性明显转好。

[0065] 3.海马组织形态学改变

[0066] 3.1超微结构观察

[0067] 假手术组海马组织神经元结构正常，椭圆形的核和清晰的染色体，线粒体结构正常。相反，模型组小鼠海马组织神经元细胞核不规则，染色质不均匀切线粒体肿胀，神经元明显受损。酪酸梭菌WZMC1016治疗组完整线粒体数目较多，神经元超微结构受损减轻。

[0068] 3.2 HE染色

[0069] 假手术组小鼠海马CA1区颗粒神经元排列整齐，可见圆形或椭圆形核和明显的核仁。而Model组小鼠海马CA1区神经元变圆，胞质凝固，核固缩，核仁消失，病理改变明显。酪酸梭菌WZMC1016治疗后，神经元损伤减轻。

[0070] 3.3 TUNEL染色

[0071] 模型组小鼠海马CA1区可见许多棕褐色细胞，代表细胞凋亡。经酪酸梭菌WZMC1016治疗后，几乎不见标记的凋亡细胞，以上结果表明本发明的酪酸梭菌具有明显的抗凋亡作用。。

[0072] 4.对血管性痴呆的肠道菌群影响

[0073] 酪酸梭菌WZMC1016治疗组在肠道菌群丰度指数、Shannon-Wiener指数(H’)和物种均匀度指数上显著性优于血管性痴呆模型小鼠。

[0074] 结论：

[0075] 本发明创造性地以肠道菌群为治疗靶点，开创防治血管性痴呆的新模式，研制出了一种疗效好、无毒副作用的防治血管性痴呆的药物，经动物实验研究证明，明显改善血管性痴呆小鼠的学习记忆能力，减轻细胞凋亡的病理改变。本发明选用丁酸梭菌WZMC1016菌株来防治血管性痴呆，疗效显著，且未发现任何毒副作用，可作为营养制剂和其他营养素一