具体技术细节
[0006] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种间充质干细胞及其制备方法和应用，使得该制备方法制备的间充质干细胞直径较小，降低引发过敏性反应的几率，提高传代细胞活力。
[0007] 为实现以上发明目的，本发明提供如下技术方案：
[0008] 一种间充质干细胞的制备方法，将脐带去除脐动脉和脐静脉后切成小块，用含有0.1％IV型胶原酶的αMEM培养基以及完全培养基消化，然后将脐带小块和消化后得到的细胞悬液离心，去上清后洗涤除去胶原酶和胶原，接着用完全培养基重悬，重悬后的悬液转移至由贴壁基质包被过的培养瓶中培养，至出现梭形贴壁细胞时洗涤除去未贴壁细胞，并更换新的完全培养基继续培养，以后每2天更换一次完全培养基，至梭形贴壁细胞的汇聚度达到80-85％即得；
[0009] 所述完全培养基为含有15-25ng/ml FGF、15-25ng/ml PDGF、15-25ng/m1人白蛋白、15-25ng/ml胰岛素、15-25ng/ml硒酸钠和15-25ng/ml铁蛋白的αMEM培养基；
[0010] 本发明采用的脐带由苏州大学第一附属医院妇产科提供，采集前经产妇同意并签署知情同意书。现有制备脐带间充质干细胞的方法，由于采用胎牛血清，使得间充质干细胞带有异种动物蛋白，增加其在患者体内引发过敏性反应的几率，同时现有制备的间充质干细胞直径较大，在用于再生治疗时，会对微循环毛细血管床起阻塞作用，给患者造成威胁。
[0011] 为此，本发明优化培养基成分，选用新的无血清无动物异种蛋白的完全培养基进行制备，大大减小了间充质干细胞引发过敏性反应的几率，并且最终制备的间充质干细胞直径经倒置显微镜检测，平均为26μm，而利用现有方法制备的细胞直径平均为35μm。同时，经小鼠注射试验检测，本发明间充质干细胞注射后小鼠死亡率仅为10％，而现有方法制备的间充质干细胞小鼠死亡率为100％。
[0012] 其中，本发明所述完全培养基优选采用MesenCult-ACF无血清培养基，购自于加拿大Stemcell公司，产品目录号为05420。所述贴壁基质可采用本领域常规贴壁基质，本发明优选采用含有纤连蛋白的贴壁基质，更优选采用MesenCult贴壁基质，购自于加拿大Stemcell公司。含有0.1％IV型胶原酶的αMEM培养基购自于Worthington公司。αMEM培养基为本领域经常使用的培养基，是alpha改良的Earle培养基，购自于美国Gibco公司。
[0013] 本发明所述消化优选为在37℃、250rpm下消化2小时，所述培养优选为在37℃、5％CO2浓度、95％相对湿度下培养。
[0014] 在实际的消化过程中，脐带小块并不能完全消化成细胞悬液，仍有部分较小的小块残留，其上含有许多间充质干细胞，可随细胞悬液一并进入下个制备环节，避免浪费原材料。本发明在消化后的洗涤是为了去除胶原酶和胶原，而在梭形贴壁细胞出现后的洗涤是为了去除未贴壁细胞，两次洗涤可采用本领域常规的不影响细胞生长的试剂，如PBS，本发明优选采用αMEM培养基。
[0015] 在本发明继续培养过程中，按照本领域公知常识需要定期更换培养基，本发明优选每隔2天更换一次完全培养基，为了保证一定的细胞数量，本发明优选在梭形贴壁细胞汇聚度达到80-85％时收集。
[0016] 现有技术在传代时采用猪胰酶来消化贴壁细胞，但是猪胰酶是一种含有多种蛋白的混合物，间充质干细胞会带有一些猪胰酶，猪胰酶中的多种异种动物蛋白无疑会增加引发过敏性反应的几率。并且，猪胰酶对于间充质干细胞的毒性较大，在传代时影响细胞的活力。
[0017] 为此，作为优选方案，本发明还包括传代培养步骤，将上述培养的梭形贴壁细胞(即上一代间充质干细胞)洗涤，然后用TrypLE细胞分散酶消化至梭形贴壁细胞从贴壁基质上分离，将消化后得到的细胞悬液加入完全培养基离心去上清，与洗涤贴壁基质后的溶液混合离心去上清，再次洗涤去上清后用完全培养基重悬，将所得悬液接种于由贴壁基质包被过的培养瓶中，加入完全培养基培养，培养后的梭形贴壁细胞即为下一代间充质干细胞；所述完全培养基、贴壁基质、培养方法同上述制备方法。
[0018] 在本发明传代培养中，第一次洗涤是为了除去上一代间充质干细胞中残留的完全培养基中的蛋白，第二次洗涤是为了最大化收集用于传代培养的间充质干细胞，而第三次洗涤的目的与第一次洗涤相同，这三次洗涤均可采用本领域常规的不影响细胞生长的试剂，如PBS。
[0019] 本发明将用完全培养基重悬后的悬液以一定的细胞密度接种于由贴壁基质包被过的培养瓶中，经过培养即可得到下一代间充质干细胞。其中，作为优选，接种的细胞密3 2
度优选为3×10 个/cm ；为了保证细胞充分的营养物质以及收集到一定量的细胞，本发明在传代培养中优选每隔2天更换一次完全培养基，并在下一代梭形贴壁细胞汇聚度达到
80-85％时收集。
[0020] 本发明采用TrypLE Select重组酶进行细胞的消化分离，它是一种不含动物来源蛋白的重组细胞消化酶，不含牛及猪来源异种蛋白，可用来消化贴壁细胞如CHO、HEK 293、A529等贴壁细胞、是一种能降解细胞表面蛋白的酶，对细胞表面突起蛋白的降解损伤较常用的胰酶弱，购自于美国Gibco公司，目录号为12563-001。本发明的传代方法和现有的传代方法相比，其传代后的细胞活力较后者的细胞活力提高了5％左右。
[0021] 由于本发明所述制备方法制备的间充质干细胞具有上述优点，故本发明还提供一种由本发明所述制备方法制备的间充质干细胞，其可以应用于再生治疗制品的制备过程中。
[0022] 由以上技术方案可知，本发明所述制备方法优化培养基成分，采用无血清无动物异种蛋白的培养基制备，所制备的间充质干细胞直径较小且能够降低过敏性反应的发生几率，增加了患者再生治疗的安全性；传代培养采用细胞毒性小、成分单一的重组酶，提高了细胞的活力。
法律保护范围
涉及权利要求数量10：其中独权1项，从权-1项
1.一种间充质干细胞的制备方法，其特征在于，将脐带去除脐动脉和脐静脉后切成小块，用含有0.1％IV型胶原酶的αMEM培养基以及完全培养基消化，然后将消化后得到的细胞悬液离心，去上清后洗涤，接着用完全培养基重悬，重悬后的悬液转移至由贴壁基质包被过的培养瓶中培养，至出现梭形贴壁细胞时洗涤，并更换新的完全培养基继续培养，培养后的梭形贴壁细胞即为间充质干细胞；
所述完全培养基为含有15-25ng/ml FGF、15-25ng/ml PDGF、15-25ng/ml人白蛋白、
15-25ng/ml胰岛素、15-25ng/ml硒酸钠和15-25ng/ml铁蛋白的αMEM培养基；所述含有
0.1％IV型胶原酶的αMEM培养基和完全培养基的体积比为4∶1。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述完全培养基为MesenCult-ACF无血清培养基。
3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述贴壁基质为含有纤连蛋白的贴壁基质。
4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，所述贴壁基质为MesenCult贴壁基质。
5.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述消化为在37℃、250rpm下消化2小时。
6.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述培养为在37℃、5％CO2浓度、95％相对湿度下培养。
7.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，还包括传代培养步骤，将权利要求1所述梭形贴壁细胞洗涤，然后用TrypLE Select重组酶消化至梭形贴壁细胞从贴壁基质上分离，将消化后得到的细胞悬液加入完全培养基离心去上清，与洗涤贴壁基质后的溶液混合离心去上清，再次洗涤去上清后用完全培养基重悬，将所得悬液接种于由贴壁基质包被过的培养瓶中，加入完全培养基培养，培养后的梭形贴壁细胞即为下一代间充质干细胞；
所述完全培养基、贴壁基质、培养方法同权利要求1。
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8.根据权利要求7所述制备方法，其特征在于，所述接种的细胞密度为3×10 个/cm。
9.权利要求1至8任意一项所述制备方法制备的间充质干细胞。
10.权利要求9所述间充质干细胞在制备再生治疗制品中的应用。
