[0001] 本发明涉及细胞工程领域，具体提供了一种间充质干细胞及其制备方法和应用。

[0002] 间充质干细胞最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。

[0003] 近年来有文献报道人脐带Wharton′s(音译：华顿氏)胶质也富含间充质干细胞。脐带间充质干细胞和骨髓来源的间充质干细胞类似，表达一些共有的表面标志物，具有较高自我再生能力，能分化成脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、神经细胞、心肌细胞及内皮细胞。Baksh D等实验结果表明脐带间充质干细胞增殖能力高于骨髓间充质干细胞。由于骨髓穿刺手术对于供者是有创性手术，而且自采集骨髓液至培养临床治疗数量级的间充质干细胞需要4-6周时间。健康剖宫产脐带以往属于医疗废物，采集脐带对产妇及新生儿无任何影响，而且制备的合格脐带间充质干细胞可建立间充质干细胞库液氮保存，可短期内扩增获得临床治疗数量级细胞。人脐带Wharton′s胶质来源的基质细胞在再生治疗方面有广阔的应用前景。

[0004] 目前国内外文献报道的培养脐带来源间充质干细胞方法为低糖DMEM或αMEM培养基添加5-20％胎牛血清，同时可加入人间充质干细胞相关生长因子，如成纤维细胞生长因子FGF或血小板源生长因子PDGF。脐带间充质干细胞传代培养至P2代或P3代纯度可达到应用于再生治疗的要求，现有制备方法在传代时用猪胰腺提取的胰酶及EDTA.Na2消化上一代细胞后传代培养。但是应用现有方法制备的间充质干细胞制品中混杂少量牛血清白蛋白、猪胰酶，二者均是明确的高致敏原，患者接受本方法制备的间充质干细胞悬液会产生对应抗体，降低间充质干细胞治疗疗效及增加过敏性反应发生，而且有感染包括牛脑海绵状病在内的牛病毒的潜在风险。

[0005] 此外，Furlani D等研究表明利用胎牛血清培养的间充质干细胞有10％以上的细胞直径大于45μm，细胞直径越大对于微循环毛细血管床的阻塞作用越明显，大剂量静脉输注试验条件下严重时可导致小鼠死亡，这为患者利用间充质干细胞进行再生治疗带来了潜在的威胁。同时，在传代时，猪胰酶消化靶点较多，对间充质干细胞的毒性大，进而影响细胞的活力。

[0028] 本发明公开了一种间充质干细胞及其制备方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

[0029] 下面结合实施例，进一步阐述本发明。

[0030] 实施例1：利用本发明所述制备方法制备间充质干细胞

[0031] 脐带运送：选取肝炎、梅毒、艾滋病等传染病检测阴性且无产科并发症的剖宫产脐带，术前经得产妇知情同意并签署知情同意书。术前准备250ml无菌聚苯乙烯储液瓶作为脐带运送瓶，内装100ml αMEM培养基(Gibco公司产品)添加1000U肝素钠及100U青霉素/链霉素。10-30cm长脐带装入瓶内，4℃条件下2小时内送到实验室。

[0032] 脐带消化：脐带运送到实验室后，使用磷酸盐缓冲液PBS(Gibco公司产品)洗涤2遍去除血液及羊水。在2级生物安全柜内进行脐带处理。准备一个无菌包内含1把中号手术直剪、1把中号手术直镊、1个直径为10cm的玻璃培养皿、1个100ml烧杯。将脐带剪为2-3cm的脐带段，分别取出脐动脉和脐静脉弃去。脐带段剪成3mm×3mm×5mm小块，转移至
50ml锥形底聚丙乙烯离心管内，以含0.1％IV型胶原酶αMEM培养基(Worthington公司)和 (目录号05420)无血清无动物成分的完全培养基(Stemcell公司)
为消化液，加入25ml置于恒温摇床以37℃、250rpm消化2小时，消化后用3倍与消化液体积的αMEM培养基洗涤3遍去除胶原酶和胶原。

[0033] 细胞培养瓶包板：提前1天进行包板。以1∶28比例用PBS稀释贴壁基质成分2
(Stemcell公司)，T-75cm 培养瓶加入5ml贴壁基质，拧紧瓶盖水平放置室温过夜。次日使用前用10ml移液管吸尽液体成分避免接触细胞贴壁面。无菌灭菌水洗涤1遍，洗净灭菌水，室温静置15min。

[0034] 脐带间充质干细胞原代培养：将消化后脐带小块及细胞悬液用75-150ml (Catalog#05420)无血清无动物成分的完全培养基重悬。悬
2
液转移至贴壁基质成分包被过的T-75cm 培养瓶，置于37℃及5％CO2、95％湿度培养箱内培养48小时。培养48小时候可见梭形贴壁细胞，吸尽培养液并用αMEM培养基洗涤1遍，加入新鲜 无血清培养基，此后每2天换液一次。直至梭形贴壁细胞汇聚
度达到80％-85％，一般时间为8-12天，即得P0代间充质干细胞。

[0035] 实施例2：间充质干细胞免疫表型检测

[0036] 制备P0代间充质干细胞悬液，调整细胞密度为4×105个/ml，每管加入0.5ml细胞悬液，每管分别加入PE标记抗CD29、CD105、CD73、CD44、HLA-DR、HLA-ABC、CD34、CD45、CD31单克隆抗体，FC500流式细胞仪检测，结果见图1。由图1可知，本发明制备的间充质干细胞细胞免疫表型完全符合公认的间充质干细胞表型。

[0037] 实施例3：间充质干细胞分化潜能检测

[0038] 1、脂肪细胞分化

[0039] P0代间充质干细胞按5×103个/cm2细胞密度接种6孔板，诱导分化完全培养基为添加1μM地塞米松、500μM异丁基甲基黄嘌呤、60μM吲哚美辛、5mg/L胰岛素及10％胎牛血清的低糖DMEM培养基。每3天换新诱导分化液一次。诱导培养21天，吸尽培养液，10％中性甲醛固定1小时，取1ml0.16％油红O染色20min。吸尽染液，70％乙醇快速洗涤1遍，加入1mlPBS镜下观察。镜检结果显示，所制备的间充质干细胞能够分化为脂肪细胞。

[0040] 2、成骨细胞分化

[0041] P0代间充质干细胞按5×103个/cm2胞密度接种6孔板，诱导分化完全培养基为添加10nM地塞米松、5mM β-glycerophosphate、10nM维生素D3、50mg/L抗坏血酸及10％胎牛血清的低糖DMEM培养基。每3天换新诱导分化液一次。诱导培养21天，进行von Kossa染色。吸尽培养液，10％中性甲醛固定1小时，取1ml 5％硝酸银室温避光静置20min。吸尽硝酸银，蒸馏水洗涤1遍，紫外灯下照射20min，5％硫代硫酸钠溶液洗涤1遍，蒸馏水洗涤1遍镜下观察。镜检结果显示，所制备的间充质干细胞能够分化为骨细胞。

[0042] 3、软骨细胞分化

[0043] P0代间充质干细胞调整为1.6×107个/ml细胞密度，用移液器接无菌黄枪头10-20μl多点接种6孔板，饱和湿度下37℃培养箱静置孵育20min。静置后缓慢加入诱导分化完全培养基为含添加100nM地塞米松、10μg/L TGF-β3及10％胎牛血清的低糖DMEM培养基。每3天换新诱导分化液一次。诱导培养21天，进行Alcian Blue染色。吸尽诱导分化液，10％中性甲醛固定1小时，取1ml1％酸性Alcian Blue室温孵育20min。吸尽染液，蒸馏水洗涤1遍，镜下观察。镜检结果显示，所制备的间充质干细胞能够分化为软骨细胞。

[0044] 实施例4：间充质干细胞的细胞直径检测

[0045] 采用相同来源、质量的脐带，分别利用本发明所述方法和传统方法(加胎牛血清培养)制备间充质干细胞，其他培养条件一致，将各自制备的间充质干细胞制成细胞悬液静置于培养瓶内，采用LEICA或NIKON带相机的高端倒置显微镜下测量，以微米为单位。

[0046] 结果显示，本发明所述制备方法制备的间充质干细胞的细胞直径介于18-39μm，平均26μm；利用传统方法制备的间充质干细胞的细胞直径介于20-61μm，平均35μm。

[0047] 实施例5：间充质干细胞的小鼠注射试验

[0048] 将实施例4制备的两种间充质干细胞分别静脉注射到10只20-23克正常雌性6
BALB/c小鼠中，注射量为1.5×10 个细胞。注射本发明所制备的间充质干细胞的10只小鼠中仅有1只出现呼吸循环衰竭而死亡，而注射传统方法制备的间充质干细胞的10只小鼠中全部出现呼吸循环衰竭而死亡。表明注射本发明所制备的间充质干细胞可减轻静脉注射时微血管阻塞程度，减少注射不良反应，降低再生治疗时的危险。

[0049] 实施例6：利用P0代传代培养制备间充质干细胞

[0050] 吸尽培养基，将实施例1制备的P0代间充质干细胞用PBS洗涤1遍并吸尽弃去。培养瓶中加入2ml TrypLE Select重组酶(Gibco公司，目录号12563-011)覆盖细胞生长面，置于37℃培养箱内消化7-10min直至贴壁细胞自表面分离。将细胞悬液吸出置于50ml锥形底离心管，加入等体积 无血清培养基混匀，300×g离心8min去上清，并与用3ml PBS洗涤培养瓶1遍后的溶液混合，离心去上清，再次用PBS洗涤去上清后，用
2
无血清培养基洗涤细胞悬液1遍。T-75cm 培养瓶提前1天包被贴壁基
3 2
质，按3×10 个/cm 细胞密度接种间充质干细胞，加入预温至37℃的
无血清培养基，此后每2天换液一次，直至梭形贴壁细胞汇聚度达到80％-85％，即得P1代间充质干细胞。从P1代传至P2代可参照此方法。

[0051] 实施例7：间充质干细胞活力检测

[0052] 采用实施例1的P0代间充质干细胞，分别采用本发明所述传代培养方法和传统传代培养方法(采用猪胰酶消化分离细胞)，其他培养条件一致，将制备的下一代细胞采用0.4％台盼蓝染色后镜检，即细胞悬液与等体积0.4％台盼蓝混合后2分钟后计数，活细胞有折光性且不染色，死细胞染蓝色，细胞活力＝活细胞数÷(活细胞数+死细胞数)×100％。

[0053] 结果显示，利用本发明传代培养方法制备的下一代间充质干细胞活力介于94-96％，平均95％；利用传统传代培养方法制备的下一代间充质干细胞活力介于88-94％，平均90％，本发明的细胞活力较传统传代方法高5％左右。

[0054] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。