技术内容
用于抗过敏症状的微生物林、其组合物和 以此微生物抹刺激细胞产生干扰素-y的方法技术领域本发明关于 一种经分离的类干酪乳杆菌(丄actoZwc/〃w paracme/),且特别 关于其可用于抗过敏症状。背景技术过敏疾病是一种免疫疾病，其为人体内的免疫功能失调，出现不平衡的 状况。由于人体内有抗原(过敏原)进入，身体就会产生免疫保护作用，当人体 再次接触抗原时，就会诱发身体免疫系统产生反应，T细胞会释放干扰素 (Interferon, IFN)-y、白细胞介素(Interleukin, IL)-2，使免疫反应趋向第一型T 细胞反应，B细胞因此分泌更多的免疫球蛋白G(IgG)。然而，有过敏体质的 人，当过敏原进入体内，则会诱发身体免疫系统朝第二型T细胞免疫反应， T细胞会释放白细胞介素4、 5、 9、 13，让免疫B细胞制造免疫球蛋白E(IgE) 增加，粘附在肥大细胞(Mast cells)上，再遇过敏原时，过敏原会粘附在免疫 球蛋白E上，共同作用后，月巴大细胞会释放发炎介质如組织胺(Histamine)、 白三烯素(Leukotriene)、前列腺素(Prostaglandin)、和血小板活化因子等，这些 发炎介质会进一步导致过敏症状发生。由上述说明可知，影响过敏免疫反应之一为干扰素y。免疫细胞活化到某程度后所产生的干扰素—1],可以增加抗原呈献细胞的功能，使巨噬细胞能有效的辨识并吞噬侵入的病原体，所以干扰素-y也被称为巨噬细胞的活化因子 之一p]。全世界的过敏疾病罹病率和盛行率有逐年增加之势，且病情转趋严重， 住院率和死亡率也随之增加，全球约有20%到30%的人口有过敏疾病的经验。 如过敏的标的器官是在鼻子则称之为过敏性鼻炎(rhinitis)，发生在皮肤则为异 位性皮肤炎（dermatitis)或荨麻渗(urticaria),发生在眼睛则为过敏性结膜炎 (conjunctivitis),发生在气管为气喘(asthma)等。这些过敏症状影响短则几周长 则数个月，对于过敏患者而言实在造成生活品质上的一大影响因素且现代社会为此付出了巨大成本。乳酸菌是非致病性的革兰氏阳性杆菌，是肠道的益生菌，在肠道粘膜表面的正常菌丛中大多数是乳酸菌与比菲德氏菌，其临床作用有：调节肠道的 通透性、改变肠道微生物的状态与增加肠道IgA的反应性[3，4，5]。早期的研究发现乳酸菌可刺激老鼠的脾脏细胞抹分泌干扰素-/'7-9]，同时在人类的研究上 亦发现血液中的淋巴球细胞亦可被乳酸菌刺激而分泌干扰素-/()'5'|1-12]。经上 述说明可知，干扰素i可调节免疫反应产生与否。因此乳酸菌能刺激产生干 扰素-Y也代表其可调节免疫反应。发明内容本发明提供一种经分离的微生物抹，命名为类干酪乳杆菌(丄acto6ac/〃w /?aracwe/) BRAP-01 ，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心，保藏号为CGMCC No. 2218 。本发明也提供一种用于抗过敏症状的微生物抹，包括如上述的微生物抹。本发明另提供一种用于抗过敏症状的组合物，包括：有效量的上述微生 物抹；以及赋形剂。本发明还提供一种刺激细胞产生干扰素-Y的方法，包括：提供哺乳动物共培养。为了让本发明的上述和其它目的、特征、和优点能更明显易懂，下文特 举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下：附图说明图1A与1B显示分离抹BRAP-01进行API 50CH糖化反应测试的结果。图2A与2B图显示分离株BRAP-01、BR1204以及市售优酪乳（统一LP33 机能优酪乳）中LP33菌三抹菌的API 50CH糖化反应测试的结果差异。图3显示BRAP-Ol、 BR1204以及市售优酪乳（统一 LP33机能优酪乳） 中LP33菌三抹菌的随机扩增多型性DNA图谱。图4A显示BRAP-01 、 BR1204以及市售优酪乳（统一 LP33机能优酪乳） 中LP33菌三林菌进行序列比对的结果。图4B显示BRAP-01 、 BR1204以及市售优酪乳（统一 LP33机能优酪乳）5中LP33菌三4朱菌的演化关系。
图5显示实验样本的不同过敏症状的病患分布情况。
图6显示人类干扰素-Y浓度标准液的序列稀释。
图7显示试剂或各菌抹对刺激细胞产生干扰素-Y能力的差异。
图8显示分离林BRAP-01的革兰氏染色镜检。
图9显示将分离抹BRAP-01进行API 50CH糖化反应测试的测试结果以 API软件进行分析。
发明详述 菌种分离
首先自婴儿粪便一全体以ROGOSA平板培养基作为选择性培养基进行菌 种分离，以得到分离的单一菌落。
菌种确认
将经由上述方法取得的分离抹之一命名为BRAP-01并将其进行各项鉴 定。分离林BRAP-01菌落外观为乳白色凸起菌落，适用的液体培养基为MRS broth，培养温度为33-40°C,微厌氧环境下生长。革兰氏染色结果呈蓝紫色， 分离抹BRAP-Ol为革兰氏阳性杆菌。分离抹BRAP-Ol不具运动性、具触酶、 不具氧化酶。
根据乳酸菌16S核糖体基因高保留性的特性设计一对分类引物 (species primer)-16S rDNA 引 物 ： 顺 向 引 物 为 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG画3，； 反 向 为 引 物 ： 5，-GTATTACCGCGGCTGCTG-3，。将分离抹BRAP-01以上述引物进行聚合 酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)鉴定，得到分离林BRAP-01的16S 核糖体DNA基因部分序列516bp，如序列号1的序列所示。将序列号1的序 列于美国全国生物技术信息中心 （NCBI) (http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi)基因库进行序列比对，结果显示分 离抹BRAP-01与类干酪乳杆菌相似度99%，结果如表1所示。
表1、分离林BRAP-01与其它类干酪乳杆菌亚种的16S核糖体DNA基 因部分序列比对结果
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table see original document page 7
分离抹BRAP-01进行微生物50种糖类生化反应鉴定系统鉴定(API 50CHL),结果如图1A与1B所示，将此结果以API软件进行分析，确认其 为类干酷豸L才干菌类干赂亚种(丄acto6ac/〃tw /?ara;case/ m/? /?an3ca化/)的l岸"i只度为 99%，因此鉴定为类干酪乳杆菌的菌抹。综合上述的各项鉴定结果显示此分 离抹BRAP-01为类干酪乳杆菌的菌林。
不同类干酪乳杆菌的差异分析
将分离抹BRAP-Ol、发明人先前已确认为类干酪乳杆菌的另一菌抹 BR1204以及市售优酪乳（统一 LP33机能优酪乳）中LP33菌抹（也为类干 酪乳杆菌的一^M进^f亍以下的差异分析。
1. API50CHL鉴定分析
将上述三菌林进行API50CHL鉴定，结果显示于图2A与2B,由图可知 三抹类干酪乳杆菌的生化反应不相同。其中BRAP-01对鼠李糖(Rhamnose)与 蜜二糖(Melibiose)的生化反应与其它两林菌完全不同。
2. 随机扩增多态性DNA (Randomly amplified polymorphic DNAs， RAPD)
分析
利用较广泛的应用于族群分布变异或亚种间差异的研究之随机扩增多态 性DNA来判定菌种间的差异。这个方法主要利用聚合酶链式反应的技术以较 短的引物（约10个核苷酸）在DNA上任意的配对而进行放大。由于相同族 群或相同亚种的个体间核酸序列变异较少，所以放大出的核酸片段大小差异较小，而不同族群或亚种的个体间的差异则较大，所以放大出的核酸片段大 小差异亦较大。
本分析所使用引物序列为（5'-AACGCGCAAC-3')，以此引物进行聚合酶链 式反应以得知三抹菌抹随机扩增多型性DNA的差异。聚合酶链锁反应条件为 95°C， IO分钟将双股DNA变性分离为单股(denature); 95°C, 30秒；36°C, 30秒；72°C， 30秒，进行30次循环，最终72。C， 5分钟来扩增DNA片段。 反应完成后以1.5。/。琼脂糖凝胶(agarOse gel)进行DNA电泳分析。图3的随机 扩增多态性DNA图谱中显示BRAP-Ol主要扩增片段为350 bp、 450 bp、 650 bp、 800 bp、 900 bp、 1000 bp、 1300 bp、 1400 bp、 1500 bp、 2500 bp (左起 第l栏）；LP33主要扩增片段为450bp、 950 bp、 1100 bp、 1300bp(左起第 2栏）；BR1204主要扩增片段为450bp、 950 bp、 1000 bp、 2500 bp (左起第 3栏）。因此三抹菌在图谱上主要片段不同，故具有差异性。M为DNA分子 量标准品，由小至大依序为300 bp、 400 bp、 500 bp、 600 bp、 700 bp、 800 bp、 900 bp、 1000 bp、 1500 bp、 2000 bp与3000 bp (右起第1栏）。
3. 16S核糖体基因序列比对 '
如前述，根据乳酸菌16S核糖体基因高保留性的特性设计一对分类引物 (species primer)-16S rDNA 引 物 ： 顺 向 引 物 为 5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3s ; 反 向 为 引 物 ： 5，-GTATTACCGCGGCTGCTG-3，。将分离林BRAP-Ol、 BR1204与LP33以 上述引物进行聚合酶链式反应鉴定，得到分离抹BRAP-Ol的16S核糖体DNA 基因部分序列：序列号l,以及BR1204与LP33的16S核糖体DNA基因部 分序列，分别各皆约为500-600 bp。利用CLC combined Workbench 3.0.2版免 费试用软件(CLC bio Inc. Headquartered in Aarhus， Denmark)将三株菌抹的16S 核糖体DNA基因部分序列进行序列比对，比对结果如图4A所示。将此比对 结果产生演化树以证实三抹菌抹的相关性，如图4B所示。在序列比对上 BRAP-01与其它两4朱具有差异性，经由演化树的结果证实BRAP-Ol、 BR1204 与LP33为不同的菌林。
综上所述可以得知BRAP-01 、 BR1204与LP33在生化反应、基因序列以 及演化分类上皆不相同，三抹菌确实为不同的菌抹，因此可以证实分离林 BRAP-01确实为新颖的菌才朱。将此新颖的分离林命名为类干酪乳杆菌BRAP-01,并且将其保藏于中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.2218。
又本发明提供一种用于抗过敏症状的微生物抹，包括上述的类干酪乳杆 菌BRAP-Ol。其使用形式可包括菌粉等，而菌粉的形成方法包括将培养的细 菌经冷冻干燥等方式而得。在一实施例中，将菌种活化培养后利用冷冻干燥 方式进行冻干。冻干菌粉粉末检测菌数须大于9.0xl(TCFU/g，在一实施例中 为大于1.0xl0"CFU/g。
而上述的过敏症状则包括气喘、过敏性鼻炎、异位性皮肤炎、过敏性结 膜炎、食物过敏、荨麻渗及/或肠躁症等。上述菌抹具抗过敏症状的功能为因
其具有刺激细胞产生干扰素-y的能力。
在一实施例中，可将上述的菌粉取约0.5-3 g溶于5-20 ml无菌水中，充 分均匀混合后，形成菌粉混合液，以系列稀释方式，将菌粉混合液稀释至约 9.0xl07-3.0xl08 CFU/ml,接着置于约80-100°C中加热处理约2-8分钟，优选 为置于95。C水浴槽中加热处理约5分钟，之后置于4。C备用。然后将经上述 处理的菌粉与哺乳动物细胞进行共培养后，再测定细胞所产生的干扰素-y的 量，证实细胞所产生的干扰素i的量确实有增加的情形。上述的哺乳动物细 月包可包括人类外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)。在一
来的约6-12倍。
本发明也可将有效量的上述用于抗过敏症状的^f鼓生物抹与赋形剂等组合 以形成用于抗过敏症状的组合物。而赋形剂可为一般食品可添加或药学上可 接受的赋形剂，包括乳糖(lactose)、干燥淀粉(starch)、淀粉糊(starch paste)、 糊精(dextrin)、环糊精(cyclodextrin)、预胶化淀粉(pregelatinized starch)、羧曱 基;定4分4内(carboxymethyl starch sodium) 、 #5丙基;定斗分(hydroxypropy starch)、孩l 晶性纤维素(microcrystalline cellulose)、羧甲基纤维素(carboxymethyl cellulose) 或麦芽糊精(maltodextrin),优选为千燥淀粉、糊精、羧甲基纤维素或麦芽糊 精。在一实施例中所使用的赋形剂为麦芽糊精。在此组合物中，上述用于抗 过敏症状的微生物抹的型态可包括菌粉，而菌粉可由冷冻干燥等方式而得。
此组合物也具抗过^:症状的功能，由于其具有刺激细胞产生干扰素-y的 能力。又其可抵抗的过敏症状则包括气喘、过敏性鼻炎、异位性皮肤炎、过 敏性结膜炎、食物过敏、荨麻瘆及/或肠躁症等。上述的细胞可包括人类外周血单核细胞。在一实施例中，上述用于抗过敏症状的组合物促进细胞所产生
的干扰素-Y为原来的约6-12倍。 实施例
一、体外实一睑 实验方向
体外实验主要分成二部分进行，第一部分为具过敏症状的病患的血液样 本分离出外周血单核细胞并将其与试剂或各菌林共同培养来观察病患的外周 血单核细胞对试剂或各菌林所产生细胞激素的差异。第二部分为收集不同过 敏症状的病患，分别将其外周血单核细胞进一步与试剂或各菌抹共培养，以 得知BRAP-01抗不同过每丈症状的能力。
菌抹制备
BRAP-01为筛选自婴儿粪便;险体的菌种，该菌种经鉴定为类干酪乳杆菌， 该菌种活化培养后，利用冷冻干燥方式进行冻干。冻干菌粉;险测菌数须大于 1.0xl0"CFU/g。进行细胞实验时，取1 g菌粉溶于10 ml无菌水中，充分均 匀混合后，以系列稀释方式，将菌粉混合液稀释至2.0xl08CFU/ml，置于95。C 水浴槽中加热处理5分钟后，置于4。C备用。实验中使用到的其它菌林的制 备亦如上述。
人类外周血单核细胞制备
1. 过每l病患血液样本收集
血液检体来自台湾高雄某诊所，共计52名过敏病患，其过敏症状由医师 诊断告知，过敏症状包括：气喘(asthma)、过敏性鼻炎(allergic rhinitis)、异位 性皮月夫炎(dermatitis)、过每文性结膜炎(conjunctivitis)、食物过每文(food allergy)、 荨麻渗(urticaria)、肠躁症(IBS， Irritable Bowel Syndrome)等，病患中有多数合 并两种以上症状发生，不同过壽丈症^l大的病患分布如图5所示。
2. 人类外周血单核细胞分离
抽取病患血液约10 ml，将病患血液沿管壁緩慢加入含有聚蔗糖-泛影葡 胺(Ficoll-Hypaque) (BD Pharmacia, Cat. No. 17-1400-02)的离心管中，以冷冻离
10心机进行离心(3000 rpm, 10分钟)来进行全血的血球分离，分界面处为外周血单核细胞，沉淀物为红血球。将取出的外周血单核细胞置于新的15 ml离心管，并加入10 ml 1 x磷酸盐緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)至离心管中，以离心机进行离心（1500rpm, 5分钟），除去上清液，留下血球细胞沉淀。取10ml RPMI-1640培养基（含1。/。青霉素-链霉素(Penicillin-Streptomycin)及10%小牛血清）至离心管中，来回吸冲^)次并避免气泡产生，使血球细胞均匀分布。取血球细胞悬浮液与台盼蓝(trypanblue)染剂等体积混合，以血球计数盘进行细胞计数。并以RPMI-1640培养基调整血球细胞悬浮液浓度为4.0x106个细力包/ml。
人类外周血单核细胞与乳酸菌共同培养
进行共同培养时，取100 pl血球细胞悬浮液及20 pl菌林加于96孔盘细胞培养jEi，每一个孔(well)含有200|al的混合液，将已加热处理的菌抹与人类外周血单核细胞置于培养条件为37°C、 5。/。C02细胞培养箱中一起培养48小时后，收集细胞培养液，分别置于2 ml离心管，以2000 rpm离心5分钟后，取上清液进行酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA),测定干扰素-Y的浓度。
以酶联免疫吸附测定测量细胞上清液中的干护L素-y
1. 人类干扰素-Y浓度标准曲线
干扰素-y标准储存液制备方法如下：将重组人类干扰素-y (BD Pharmingen:Cat. No. 554616)粉末溶解于无菌水中，调整其浓度至56 ng/ml,并以每管50 pi形式分装后储存于-70。C保存。取出一管浓度56 ng/ml的干扰素-Y标号为1，参照图6，将干扰素-Y标准液进行序列稀释，分别取500(11稀释緩沖溶液(lx磷酸盐緩冲液)，加入标示为2、 3、 4、 5、 6及7的1.8ml微量离心管中备用。先以微量分注器将1号管加入1080 jil的稀释緩冲溶液后，与重组人类干扰素-Y混合均匀。并依箭头指示依序进行干扰素-Y标准液的制备，并以稀释緩沖溶液作为干扰素-y浓度为零的样品。依据上述方式稀释后使终浓度分别为1000pg/ml、 500pg/ml、 250pg/ml、 125 pg/ml、 62.5 pg/ml及31.3 pg/ml。
2. 细胞所产生的干扰素-y农度分析取适量经纯化的抗-人类干扰素-Y (BD Pharmingen, Cat. No. 551221)溶于緩冲液(coating buffer, 0.1MNa2HPO4， pH 9.0)使得终浓度为2 pg/ml,力卩150^至每一格中；以胶膜封好，置于4。C中隔夜；次日用洗涤緩冲液(washingbuffer, 0.05% Tween 20溶于磷酸盐緩沖液)沖洗每一格3次各3分钟；然后每格加入200 jil填充緩冲液(blocking buffer, 1%牛血清白蛋白（bovine serumalbumin, BSA)溶于磷酸盐緩冲液)，在37。C反应2小时，再用洗涤緩沖液冲洗每一格3次各3分钟；取样本100 |il加入每一格中，于4。C放置隔夜；隔天用洗涤緩沖液沖洗每一格3次各3分钟，再分别加入100 fil生物素(biotin)小鼠抗-人类干扰素-Y (BD Pharmingen, Cat No. 554550， 0.5|ig/ml) (1000倍稀释）至每格中，37。C2小时；然后用洗涤緩冲液冲洗每一格3次各3分钟；加入100 jil抗生物素蛋白链菌素"威性磷酸酶(Streptavidin-alkaline phosphatase) (1:2000)至每格中，37。Cl小时；洗涤緩沖液冲洗每一格3次各3分钟，最后加入90 |il pNPP (BD Pharmingen,石舞酸对硝基苯酉旨(p-Nitrophenylphosphate), 二钠(di-sodium))至每格中呈色，呈色结果以波长405 nm进行读取，读取lt值与标准曲线进行浓度换算。
不同菌抹刺激具过敏症状病患的人类外周血单核细胞分泌干扰素-Y的比
丝
将病患的人类外周血单核细胞分成五组进行共同培养来分析试剂或各菌
林对刺激细胞产生干扰素-Y能力的差异。第一组为空白组，第二组加入植物白细胞凝集素(Leucoagglutinin， PHA-L) (Sigma L2769) (10 (ig/ml)为正控制组，第三组加入文献中已证实具有抗敏功效的益生菌，鼠李糖乳杆菌(丄actoZ^"7/ws GG (LGG), ATCC 53103)，第四组为加入分离抹
BRAP-01,第五组为加入类干酪乳杆菌33，（LP33)。结果如第7图所示。利用人类外周血单核细胞与热处理乳酸菌共同培养后进行干扰素-Y分析，其结果为空白组：578.8士56.47; PHA: 1359.0±49,97; LGG: 2386.0±31.9; BRAP-01:5495.0士279.1;类干酪乳杆菌33: 3315.0±149.9。由上述结果可得知BRAP-01确实能刺激大量干扰素-Y分泌，且分泌量约为LGG的2.5倍，显示类干酪乳杆菌BRAP-01确实有减轻过^:症状的潜力。
不同菌抹刺激具不同过敏症状病患的人类外周血单核细胞分泌干扰素-Y的比較_
培养来分析试剂或各菌抹对刺激细胞产生干扰素-Y能力的差异。第一组为空
白组，第二组加入植物白细胞凝集素（10(ig/ml)为正控制组，第三组加入文献中已证实具有抗敏功效的益生菌，鼠李糖乳杆菌GG(LGG， ATCC 53103),第四组为加入分离4朱BRAP-01，第五组为加入类干酪乳杆菌33 (LP33)，其结果依据分泌干扰素-y进行比较(以酶联免疫吸附测定单位(ELISA Unit)进行相对值比较，酶联免疫吸附测定单位气OD钆5-NaiVe)/PHAx100。/。)，并以酶联免疫吸附测定单位进行等级区分，<50%:+; 50〜100%:++; 101%〜:+++，结果如表2所示。
表2、不同菌株刺激病患人类外周血单核细胞分泌干扰素-Y的相对值(酶联免疫吸附测定单位） _table see original document page 13
依据相对值分布结果，LGG及类干酪乳杆菌33对于具有过敏症状的病患均具有刺激作用，但以BRAP-01较强，显示BRAP-01对于七大过敏症状的病患均具有调控Thl/Th2的作用，刺激干扰素-Y产生。
二 、 临实马全
利用类干酪乳杆菌BRAP-01进行过敏性鼻炎非正式临床试验1.受试者
受试者以居住在台湾高雄市且能定期在门诊追踪治疗者为优先，且需符合以下条件：年龄5岁以上、患有过敏性鼻炎至少一年以上、对家尘过敏原皮肤测试呈阳性反应且患者愿意接受临床研究评估。若有下列情形，则不列入研究：准备或正在怀孕中妇女病患、正使用全身性类固醇患者、近半年有抽烟习惯、患有精神障碍者、先天免疫不全的患者、对牛奶过敏者。
而如有下列情形发生，受试者可提早退出实-险：急性细菌性或病毒感染并发鼻窦炎、行政因素，如搬家、经济因素、或不合作、有不良反应等。受试者共20位，实马全时间为30天。
2. BRAP-01菌粉胶嚢制备
取类干酪乳杆菌BRAP-01冷冻管进行活化放大后，添加冷冻保护剂进行冷冻干燥后，以系列稀释方法检测其菌数，菌数须达1.0xlO"CFU/g。菌粉制备符合规格后，将菌粉添加麦芽糊精作为赋形剂后充填胶嚢，使每颗胶嚢菌数大于5xl09 CFU/g。
3. 研究设计
本试验自2007年2月19日开始至2007年4月16日结束。在高雄某诊所进行实验。受试者筛选期为期两周，用来收集病患基本资料包括姓名、住址、年龄、过敏性鼻炎病程及鼻炎评分表，总共筛选20名具有过^:鼻炎的病患进行试-睑。
在第二次门诊时(基准期)首先再确认病患资料，并填写第一次鼻炎评分表，之后每日食用三颗胶嚢，30天后请受试者再填写第二次鼻炎评分表，并依据受试者所填写鼻炎评分结果进行分析。
4. 鼻炎评分表
此表修改自Juniper等的小儿鼻结膜炎生活品质评分表（PediatricRhinoconjunctivitis Quality of Life Questionnaire, PRQLQ) [13]。这份简易鼻炎评分表内容含6个过敏性鼻炎主要症状(包含鼻塞、打喷噢、易流鼻水、鼻子痒、鼻弟倒流、揉眼睛及鼻子、擤鼻弟)，每个问题以5分定等级。在频率方面，0分为没有、1分为不常、2分为有时候、3分为常常、4分为每天；在困扰程度方面，0分为没有、1分为不常、2分为有时候、3分为常常、4分为每天，受试者共填写两份问巻，每份问巻约可在10分钟内完成。
5. 统^十方法
14资料收集后，以免费试用版统计软件SPSS 10.0版（SPSS Inc.Headquarters, 233 S. Wacker Drive, 11th floor, Chicago, Illinois 60606)进4亍资料分析，以Wilcoxon-符号等级检定法(Wilcoxon Signed Rank Test)统计，分析后P值0.05具统计上显著差异意义，主要评估依据是所有病患对简易鼻炎评分表上每个项目的分数的平均，所有数据以平均士标准差(Mean士SEM)来表示，结果如表3所示。
表3、人体试验分析结果（受试人数N = 20)
试验前 (分数） 试验后 (分数） P值
频率 鼻塞 2.60±0.22 1.90±0.16 0.002*
打喷噢 2.55±0.22 2.00±0.19 0.005*
易流鼻水 2.80±0.19 1.90±0.19 0.000*
鼻子痒 2.70±0.19 1.75±0.20 0.001*
鼻弟倒流 2.10±0.27 1.70±0.21 0.073
揉眼睛及鼻子 2.60±0.29 1.80±0.21 0.006*
擤鼻涕 2.20±0.28 1.30±0.18 0.003*
总分 17.55±0.47 12.35士0.20 0.000*
困扰 鼻塞 2.70±0.23 1.55±0.15 0細*
程度 打喷嚏 2.35±0.21 1.40±0.18 0細*
易流鼻水 2.35±0.23 1.35±0.18 0.002*
鼻子痒 2.30±0.23 1.25±0.18 0.001*
鼻弟倒流 2.00±0.27 1.15±0.17 0.003*
揉眼睛及鼻子 1.90±0.30 0.95±0.20 0.003*
擤鼻涕 1.80±0.33 0,80±0.16 0.003*
总分 15.40±0.62 8.45±0.05 0駕*
承P值〈0.01
6.结果
受试者食用含有BRAP-01菌粉的胶嚢30天后，比较食用前后过敏性鼻炎相关症状是否具有差异情形。由表3可知，就症状发生频率，在鼻塞、打喷嚏、易流鼻水、揉眼睛及鼻子及擤鼻涕等均具有统计上显着差异(P值<0.01)。而在症状困扰程度上，受试者在所有症状上均有显着差异，显示受试者在食用含有BRAP-01菌粉的胶嚢30天后，每一症状发生频率及困扰程度
15上均有明显的改善(P值<0.01),且所有症状发生频率及困扰程度明显下降，表示食用BRAP-01确实能使过敏性鼻炎患者除了降低症状发生频率之外，还具有改善生活品质的能力。所有的受试者均完成30天的实验，在实验期间内没有严重不良的反应产生。
虽然本发明已以优选实施例批露如上，然其并非用以限定本发明，任何本领域的技术人员，在不脱离本发明之精神和范围内，可作一些更动与润饰，因此本发明的保护范围应以所附的权利要求所界定者为准。
参考文献
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<110>光晟生物科技股份有限公司
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