[0001] 本实用新型属于生物技术领域，涉及一种肝癌早期筛查的数字PCR试剂盒，具体涉及一种针对RASSF1A基因和p16基因甲基化检测的数字PCR试剂盒。

[0002] 原发性肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是全球最常见的恶性肿瘤之一，在世界范围内，肝癌的发病率排行肿瘤第六位，死亡率则高居第三，每年新增病例超过60万。在中国，肝癌的发病率在所有肿瘤中居第三位，而其死亡率为第二位，每年约有23万人死于肝癌，占全世界肝癌死亡人数的55％。世界卫生组织指出：癌症患者如果能早期发现，治愈率可达到80％。然而肝癌早期无明显临床症状，发展快且易转移，目前临床上早期筛查HCC的主要指标是血清甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)水平和影像学B超监测，但是一部分 HCC患者血清AFP长期保持低水平(<20ng/ml)，而B超在检测和进一步判断结节的特征时有一定的局限性，一旦发下大多已是中晚期，临床治疗效果不佳。但目前临床上未有十分有效的早期检测方法，因此建立高灵敏，经济，简便的分子技术筛查方法尤为重要。

[0003] 许多研究表明，肝癌中存在多种肿瘤相关基因启动子异常甲基化现象。这些基因(包括细胞周期调控、血管形成、凋亡等基因)启动子区DNA甲基化的紊乱直接影响细胞周期和信号传导途径，细胞生长、分化、增殖、凋亡等相继异常，在肿瘤发生发展中发挥重要作用。

[0004] RASSF相关区域家族1A基因(ras-association domain family 1A,RASSF1A) 位于染色体3p 21.3区的抑癌基因，该基因在多种实体瘤组织中因启动子高甲基化而表达沉默，是迄今为止在肿瘤组织中甲基化程度最高的基因之一。肝细胞癌中RASSF1A基因启动子甲基化状态，发现正常对照RASSF1A基因启动子无异常甲基化改变，85％的癌组织标本和70％癌旁组织中该基因启动子异常甲基化，由此认为RASSF1A基因启动子甲基化是肝细胞癌发生的早期事件。 RASSF1A能直接参与细胞周期的调控，在体内和体外抑制细胞生长，并参与诱导细胞凋亡。因此，RASSFIA基因异常甲基化有望作为一种高危人群预警和早期诊断的重要候选指标之一。

[0005] p16基因又叫MTS(multiple tumor suppressor 1)基因，是体内重要的抑癌蛋白，通过与cyclinD1竞争结合细胞周期素依赖激酶CDK4而抑制CDK4的激酶活性，阻止细胞从G1期进入S期，抑制细胞的无限增殖及恶性转化。其失活可导致细胞过度增殖，细胞周期加速，使DNA在未被修复前过早地进入S期，导致肿瘤发生。p16基因启动子区域的CpG岛异常甲基化在肿瘤发生组织增生和化生阶段就已出现，且该甲基化通过肿瘤患者血清标本即可检测。许多研究也观察到HCC组织中高频率的P16基因启动子甲基化修饰。在合并有乙肝或者丙肝病毒感染的HCC、肝硬化、慢性肝炎患者中检测发现，P16基因启动子甲基化修饰分别为72.7％、29.4％、23.5％。所有启动子甲基化的组织均显示P16表达缺失，P16基因甲基化与表达缺失存在显著相关性。

[0006] 随着技术上的快速发展，肿瘤标志物发展成为继影像诊断、病理诊断之后的肿瘤诊断治疗新的领域，对肿瘤的诊断、监测和治疗产生了重大影响。但因肿瘤具有异质性，对于癌细胞已经发生转移的患者而言，仅仅检测某个部位的肿瘤组织并不能反映患者的整体情况，但对所有的肿瘤组织都检测也不切实际，组织活检也具有一定的滞后性。早期肝癌由于常常无特殊症状而几乎不被医生和患者察觉，用常规的诊断方法也难以早期发现和早期定性诊断，加之一些肿瘤标记物仅能作为肝癌的初筛或辅助诊断提示而不能确诊，因此肝癌的早期诊断较为困难。“液体活检”(Liquid Biopsy)技术是当前肿瘤研究领域的热点之一，它是一种非侵入式的血液测试，只需要通过体外无创抽血即可对全身肿瘤信息进行检测，规避了传统方式需要手术、穿刺活检的局限性，是检测肿瘤和癌症、辅助治疗的突破性技术。液体活检技术主要包括CTC和ctDNA已经外泌体检测。循环肿瘤DNA也称为ctDNA，是从肿瘤细胞释放到血液循环系统中的游离DNA 片段。由于ctDNA的浓度与肿瘤的进展高度相关，因此可以通过ctDNA来进行肿瘤的分期、预后评估以及动态监测。ctDNA的液体活检是指针对ctDNA进行基因组学、转录组学和表观遗传学等方面的基因检测。该方法不仅取样简单，还能更全面的掌握肿瘤的信息。ctDNA可来自于任何裂解的肿瘤细胞，更能反映出肿瘤细胞整体的基因变异信息。ctDNA基因检测技术可用于无创式肿瘤早期筛查、辅助诊断分型、用药指导、预后判定及动态监测等方面。

[0007] DNA分子中CpG位点的甲基化是基因表达的重要调节因素，以往研究发现，与正常细胞相比，肿瘤细胞呈现出基因组整体甲基化水平降低和抑癌基因启动子CpG岛甲基化水平升高的趋势。研究发现，在肿瘤发生的早期，在同一类型的肿瘤细胞中可检测到稳定和一致的特征性DNA甲基化改变，这种改变常导致相应的抑癌基因失活，因此可作为肿瘤早期诊断的理想标志物。数字PCR (dPCR)技术则为第三代PCR，与Q-PCR技术不同，数字PCR采用绝对定量的方式，不依赖于标准曲线和参照样本，直接检测目标序列的拷贝数。比传统 qPCR更加出色的灵敏度和特异性、精确性的优势。目前，ddPCR技术已经在科研领域得到广泛应用，在临床领域才刚刚起步。

[0008] 现有的试剂盒组分过于繁杂，实验过程中容易造成试剂混乱，交叉污染，导致实验失败，浪费时间和成本，因此，提供一种基于ddPCR技术对RASSF1A 基因和P16基因甲基化进行筛查的试剂盒具有重要的临床意义和广阔市场前景。实用新型内容

[0009] 针对现有技术的不足及实际的需求，本实用新型提供一种肝癌早期筛查的数字PCR试剂盒，所述试剂盒将检测相同基因甲基化所需的所有试剂放入同一冻存管，按功能分区，避免交叉污染，操作简单，节约成本，实现对RASSF1A 基因和p16基因联检，提高检测准确度，试剂与微滴发生卡分别包装，适应不同存储条件。

[0010] 为达此目的，本实用新型采用以下技术方案：

[0011] 第一方面，本实用新型提供一种肝癌早期筛查的数字PCR试剂盒，所述试剂盒由盒体A1和盒体B15组成；所述盒体A1和盒体B15分别独立放置；所述盒体A1与翻盖式盒盖2相连，盒体A1内部设置有挡板4，所述挡板4根据试剂功能的不同将盒体A1划分为相互独立的区域；所述盒体B15与抽拉式盒套 18相嵌。

[0012] 本实用新型中，与盒盖相连的侧面记为后侧面，与所述后侧面相对的侧面为前侧面，所述前侧面面对后侧面的左边为左侧面，所述前侧面面对后侧面的右边为右侧面。盒体A1中存放试剂并存于-20℃，盒体B15存放微滴发生卡可常温贮存，盒体A1和盒体B15可分开贮存，适应不同存储条件，避免存储方式不当影响实验结果。其中，按试剂功能不同，将盒体A1内部分为不同的独立区域，利用挡板将不同类型的试剂分隔开，便于操作人员区分，防止拿错试剂影响实验结果，降低时间成本和经济成本。盒体B15与抽拉式盒套相嵌，降低环境中灰尘进入盒体，减少对微滴发生卡污染，虽然微滴发生卡自带封装袋，但打开封装袋过程会使灰尘散落在微滴发生卡表面，影响实验精度。

[0013] 本实用新型中，具体将盒体A1内部分为不同的功能区域，例如可以是预混液区、标准品区和辅助试剂区等，再根据每个区的划分将试剂放入功能区中，如RASSF1A基因甲基化检测预混液和P16基因甲基化检测预混液置于预混液区，阴性质控、阳性质控和无RNA酶的纯水置于标准品区，微滴发生油和质控液置于辅助试剂区，若试剂可分为4个功能则可将盒体A1分为4个区域，或试剂可分为2个功能则可将盒体A1分为2个区域，以此类推。

[0014] 优选地，所述挡板4的数量为1-4个，例如可以是1个、2个、3个或4个。

[0015] 优选地，所述相互独立的区域数量为2-5个，例如可以是2个、3个、4个或5个。

[0016] 本实用新型中，根据试剂种类的不同，可以将盒体分为若干独立的功能区域，可有效区分不同试剂，防止拿错试剂影响实验时间和成本。

[0017] 优选地，所述盒体A1内部放置海绵衬垫3，所述海绵衬垫3上设有圆孔，圆孔内含有反应试剂的试剂容器。

[0018] 本实用新型中，盒体A1内设置有海绵衬垫，海绵衬垫上设有圆孔，根据试剂容器的大小可调节圆孔的尺寸，使试剂容器牢固地固定在试剂盒相应位置，防止运输过程中的破裂，同时在使用时一目了然，使用便捷。海绵衬垫的位置可选但并不局限地设置在盒底，只要满足使容器固定在指定位置即可。

[0019] 优选地，所述挡板4的数量为2个。

[0020] 优选地，所述相互独立的区域数量为3个。

[0021] 优选地，所述相互独立的区域从左到右分别为预混液区5、标准品区6和辅助试剂区7。

[0022] 优选地，所述预混液区5的圆孔分别设置RASSF1A基因甲基化检测预混液管8和P16基因甲基化检测预混液管9。

[0023] 优选地，所述RASSF1A基因甲基化检测预混液管8内含有用于检测 RASSF1A基因甲基化的全部预混液；所述RASSF1A基因甲基化检测预混液包括ddPCR supermix、RASSF1A基因甲基化检测特异性引物对、RASSF1A基因甲基化特异性探针、内参基因引物对、内参探针和无RNA酶的纯水。

[0024] 优选地，所述P16基因甲基化检测预混液管9内含有用于检测P16基因甲基化的全部预混液；所述P16基因甲基化检测预混液包括ddPCR supermix、P16 基因甲基化检测特异性引物对、P16基因甲基化特异性探针、内参基因引物对、内参探针和无RNA酶的纯水。

[0025] 优选地，所述RASSF1A基因甲基化检测预混液管8和P16基因甲基化检测预混液管9的装液体积均为900μL。

[0026] 本实用新型中，挡板数量为2个，将盒体A1分为三个区域，其中预混液区放置两个冻存管，预混液中包含除了模板之外的所有试剂，分别针对RASSF1A 基因和P16基因进行预混液的配置，实现两个基因的联检，提高试剂盒的特异性和精度；使用时只需将模板加入预混液中即可进行反应，减少因多次加试剂导致的试剂浪费，节省实验成本；2个基因的甲基化检测预混液完全独立，因此可以防止配液及加样时反应管之间的交叉污染，使得检测操作更为简单方便。

[0027] 优选地，所述标准品区6的圆孔分别设置阳性质控管10、阴性质控管11和无RNA酶的纯水管12。

[0028] 本实用新型中，标准品区放置阴性质控、阳性质控和无RNA酶的纯水，方便操作人员分别进行阳性对照、阴性对照和无模板对照，对照品均放置于标准品区，放置对照组与实验组混淆，提高效率。

[0029] 优选地，所述辅助试剂区7的圆孔分别设置质控液瓶13和微滴发生油瓶14。

[0030] 本实用新型中，质控液10用来补足微滴发生卡空孔，因为数字PCR微滴生产需要8个孔，当检查实验不够8孔时，需要质控液补上剩余没有反应液的空孔，试剂盒中配置质控液方便操作人员便捷的取用，提高效率。

[0031] 优选地，所述试剂盒体A1中的RASSF1A基因甲基化检测预混液管8、P16 基因甲基化检测预混液管9、阳性质控管10、阴性质控管11和无RNA酶的纯水管12均为1.5mL旋盖螺帽冻存管。

[0032] 本实用新型中，RASSF1A基因甲基化检测预混液管8、P16基因甲基化检测预混液管9、阳性质控管10、阴性质控管11和无RNA酶的纯水管12均为1.5mL 旋盖螺帽冻存管，方便取用，即盛放足够的试剂液体，也能降低取样损失，同时，小体积的冻存管使用方便，节省空间。

[0033] 优选地，所述阳性质控管10含有RASSF1A基因和P16基因的甲基化片段；所述阳性质控管10的装液体积为40μL。

[0034] 优选地，所述阴性质控管11含有RASSF1A基因和P16基因的非甲基化片段；所述阴性质控管11的装液体积为40μL。

[0035] 优选地，所述微滴发生油瓶14的体积为10mL；所述微滴发生油瓶14内所装微滴发生油的体积为7mL。

[0036] 优选地，所述质控液瓶13的体积为5mL；所述质控液瓶13内所装质控液的体积为2mL。

[0037] 优选地，所述盒体B15内部设置微滴发生卡槽16和海绵托架17；所述微滴发生卡槽16之间由海绵托架17支持；所述微滴发生卡槽16的数量为2-5个；所述海绵托架17的数量为
1-4个。

[0038] 本实用新型中，微滴发生卡单独放置于盒体B的微滴发生卡槽内，可直接存放于常温，卡槽数量可以是2个、3个、4个或5个，根据微滴发生卡的数量可适应性调整。

[0039] 优选地，所述抽拉式盒套18的左右两侧各设置有手指孔19，所述手指孔呈半圆形；所述微滴发生卡槽16内放置微滴发生卡20，每个微滴发生卡槽(16) 内微滴发生卡(20)的数量为1-5个；所述每个微滴发生卡20卡外包装有密封袋21；所述密封袋21开口处设有密封条22。

[0040] 本实用新型中，所述抽拉式盒套的左右两侧各设置有手指孔，方便开关盒体B，微滴发生卡槽中的微滴发生卡数量可以是1个也可以是多个，微滴发生卡外包装有密封袋，密封袋开口设有密封条，保证微滴发生卡的洁净，防止外部环境对微滴发生卡的影响。

[0041] 与现有技术相比，本实用新型具有如下有益效果：

[0042] (1)本实用新型基于一种新的检测方法数字PCR而设计，盒体A和盒体B 可分开贮存，适应不同存储条件，避免存储方式不当影响实验结果，按试剂功能不同，将盒体A1内部分为不同的独立区域，利用挡板将不同类型的试剂分隔开，便于操作人员区分，防止拿错试剂影响实验结果，降低时间成本和经济成本；

[0043] (2)本实用新型的试剂盒协同检测两种肝癌标志物的甲基化DNA来诊断肝癌、提高肝癌检出率，分别针对RASSF1A基因和P16基因进行预混液的配置，实现两个基因的联检，提高试剂盒的特异性和精度；使用时只需将模板加入预混液中即可进行反应，减少因多次加试剂导致的试剂浪费，节省实验成本；2个基因的甲基化检测预混液完全独立，因此可以防止配液及加样时反应管之间的交叉污染，使得检测操作更为简单方便。

[0052] 为更进一步阐述本实用新型所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本实用新型的技术方案，但本实用新型并非局限在实施例范围内。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

[0053] 实施例1试剂盒的组装

[0054] 1、试剂盒结构

[0055] 本实用新型提供一种肝癌早期筛查的数字PCR试剂盒，具体结构如下：

[0056] 所述试剂盒由盒体A1和盒体B15组成；所述盒体A1和盒体B15分别独立放置；所述盒体A1与翻盖式盒盖2相连，盒体A1内部设置有挡板4，所述挡板4根据试剂功能的不同将盒体A1划分为三个相互独立的区域，分别为预混液区5、标准品区6和辅助试剂区7；

[0057] 所述预混液区5的圆孔分别设置RASSF1A基因甲基化检测预混液管8和 P16基因甲基化检测预混液管9；所述标准品区6的圆孔分别设置阳性质控管10、阴性质控管11和无RNA酶的纯水管12；所述辅助试剂区7的圆孔分别设置质控液瓶13和微滴发生油瓶14；

[0058] 所述盒体B15与抽拉式盒套18相嵌，抽拉式盒套18的左右两侧各设置有手指孔19，所述手指孔呈半圆形；盒体B15内部设置微滴发生卡槽16和海绵托架17；所述微滴发生卡槽16之间由海绵托架17支持；所述微滴发生卡槽16的数量为3个；所述海绵托架17的数量为2个；

[0059] 所述微滴发生卡槽16内放置微滴发生卡20，每个微滴发生卡槽16内微滴发生卡20的数量为1-5个；所述每个微滴发生卡20外包装有密封袋21；所述密封袋21开口处设有密封条22。

[0060] 2、引物探针组合的设计，具体序列如下表1所示：

[0061] 表1引物探针的序列

[0062]

[0063]

[0064] 3、试剂盒内试剂组成见表2.

[0065] 表2试剂盒内试剂组成

[0066]

[0067]

[0068] 其中，阳性质控和阴性质控的核苷酸序列如表3所示：

[0069] 表3阳性质控和阴性质控的核苷酸序列

[0070]

[0071]

[0072] 将以上组分、说明书以及微滴发生卡放入试剂盒体中。

[0073] 实施例2RASSF1A基因和P16基因甲基化检测

[0074] 采用实施例1中的试剂盒进行RASSF1A基因和P16基因甲基化检测，包括如下步骤：

[0075] (1)模板DNA的提取

[0076] ①血浆分离：用EDTA抗凝管收集人5mL-10mL外周血；对血液样本进行离心，1600g，10分钟；将收集的血浆样本小心转移至2mL离心管中；4℃条件下对血浆样本进行离心，
16000g，10分钟；将收集的血浆样本小心转移至新的 2mL离心管中；收集完成的血浆样本至于-20℃保存；

[0077] ②游离DNA的提取：采用DNA抽提试剂提取外周血游离DNA，进行DNA 质量监控，选取OD260/OD280在1.6-2.0的游离DNA；

[0078] ③DNA修饰：由步骤②中获得的游离DNA，以ZYMO RESEARCH生物公司试剂盒EZ DNA Methylation-DirectTM KIT(D5020)说明书进行亚硫酸盐修饰，使得DNA中未发生甲基化的5’胞嘧啶转化为尿嘧啶，而发生甲基化的5’胞嘧啶不发生改变，最后得到Bis-cfDNA。

[0079] (2)配置体系

[0080] 将2uL模板加入18uL对应基因的甲基化检测预混液中，得到20uL反应体系，同时进行阳性质控、阴性质控检测和无模板质控检测，无模板质控检测使用RNase Free dH2O代替模板进行同样条件下的扩增。

[0081] (3)制备微滴

[0082] 在DG8TM微滴发生卡上相对应的孔中加入20μl步骤(2)配置的PCR反应液，70μl微滴发生专用油，盖上微滴发生卡密封垫，放入QX200微滴发生器内进行反应，将处理好的微滴缓慢转移到96孔板上，将96孔板放在热封仪上，盖上热封膜进行封膜，封好膜之后应该在30分钟内进行PCR反应，或者放于4℃冰箱4小时之内进行PCR，可在任意一台96孔PCR仪上完成，注意升降温速度≤2.5℃/s。

[0083] (4)dd PCR扩增

[0084] a)95℃预变性5min；

[0085] b)95℃变性15s，60℃退火30s，40个循环；

[0086] c)98℃延伸10min；

[0087] (5)数据读取

[0088] 将之前完成PCR的96孔板放入plate holder中组装好，注意板斜角方位，组装好之后轻轻地平稳放入微滴读取仪中；打开QuantaSoft软件，建议每次实验之前做一次系统清洗，若一周以上未使用建议先做一次填充油路再做系统清洗。之后对96孔板中样品信息进行设置，主要是提供实验名称、实验类型以及探针信息等，完成后即可运行仪器，结束后结果会被自动分析，人工核实后保存结果。

[0089] (6)结果判定

[0090] 1)本发明试剂盒有效性的判定方法为：a)阳性对照：在FAM通道有信号，在HEX通道无信号；若FAM通道无信号，提示操作过程有误，请仔细核对说明书中的步骤，重新检测，见图6；

[0091] b)阴性对照：在FAM通道无信号，在HEX通道有信号；若FAM通道有信号，则提示试剂可能被污染，请排除污染后重新检测，见图7；

[0092] c)无模板对照：FAM和HEX通道均无信号；若无模板质控检测出信号，提示可能存在环境污染，请排除污染后重新检测，见图8。

[0093] 2)待测样本结果判定：(1)阳性：FAM通道阳性微滴数≥1个；(2)阴性： FAM通道阳性微滴数<1。可根据信号散点图和突变频率自行判断阴阳性结果，也可通过推荐判定标准由软件自动完成阴阳性判定。

[0094] 图4为RASSF1A基因甲基化检测结果，通过在探针结合不同荧光基团，获得多重数字PCR的两个检测体系，其中FAM标记为RASSF1A基因甲基化阳性的液滴分布在靠近纵坐标轴的位置，HEX标记的为内参基因β-actin基因甲基化阳性的液滴分布在靠近横纵坐标轴的位置，FAM和HEX同时标记为含有 RASSF1A基因和β-actin基因阳性的液滴位于坐标平面45°角的位置，所有不包含目的扩增模板的液滴未能进行有效的扩增，均位于坐标平面的左下侧；本图中FAM标记为RASSF1A基因甲基化阳性液滴数为和HEX标记的为内参基因β-actin基因甲基化阳性液滴数均大于1个，说明该标本的RASSF1A基因表现为甲基化。

[0095] 图5为p16基因甲基化检测结果，通过在探针结合不同荧光基团，获得多重数字PCR的两个检测体系，其中FAM标记为p16基因甲基化阳性的液滴分布在靠近纵坐标轴的位置，HEX标记的为内参基因β-actin基因甲基化阳性的液滴分布在靠近横纵坐标轴的位置，FAM和HEX同时标记为含有RASSF1A基因和β-actin基因阳性的液滴位于坐标平面45°角的位置，所有不包含目的扩增模板的液滴未能进行有效的扩增，均位于坐标平面的左下侧；本图中FAM标记为 RASSF1A基因甲基化阳性液滴数为和HEX标记的为内参基因β-actin基因甲基化阳性液滴数均大于1个，说明该标本的p16基因表现为甲基化。

[0096] 综上，本实用新型通过ddPCR技术，配合特异性的甲基化检测引物和探针序列，协同增效，能够实现核苷酸的绝对定量和稀有等位基因的检测，可确定低至单拷贝的待检靶分子的绝对数目，微滴技术让数字PCR成本更低，且更实用，针对ctDNA等微量物质的检测效果明显优于新一代测序技术，本实用新型基于一种新的检测方法数字PCR而设计，盒体A和盒体B可分开贮存，适应不同存储条件，协同检测两种肝癌标志物的甲基化DNA来诊断肝癌、提高肝癌检出率，分别针对RASSF1A基因和P16基因进行预混液的配置，实现两个基因的联检，提高试剂盒的特异性和精度；使用时只需将模板加入预混液中即可进行反应，减少因多次加试剂导致的试剂浪费，节省实验成本；2个基因的甲基化检测预混液完全独立，因此可以防止配液及加样时反应管之间的交叉污染，使得检测操作更为简单方便。

[0097] 申请人声明，本实用新型通过上述实施例来说明本实用新型的详细方法，但本实用新型并不局限于上述详细方法，即不意味着本实用新型必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本实用新型的任何改进，对本实用新型产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本实用新型的保护范围和公开范围之内。