技术领域
[0001] 本实用新型涉及一种荧光定量PCR检测UBE2S的肝细胞癌预后评估制剂盒，属于肝细胞癌分子标志物技术领域。
相关背景技术
[0002] 肝癌是一种在世界范围内危害人类健康的恶性肿瘤，每年全球的新发和死亡病例约50％发生在中国。大多数原发性肝癌(70％-90％)为肝细胞癌。肝细胞癌患者术后5年内的复发转移率高达70％，术后5年生存率为30％-50％。可见肝细胞癌的预后很差，存在肿瘤转移和复发的风险。因此，寻找肝细胞癌预后判断的方法极为重要。
[0003] UBE2S是泛素结合酶家族成员，以泛素活化酶依赖性方式与泛素形成硫醇酯键。UBE2S可延长泛素连接酶底物上的泛素链，以促进有丝分裂的退出。免疫组织化学分析显示UBE2S在乳腺癌中高度表达，敲低UBE2S后，可抑制乳腺癌细胞的恶性特征，如迁移和侵袭等。蛋白质印迹和免疫组织化学实验发现UBE2S在口腔鳞状细胞癌中过表达，并且与原发性肿瘤大小显着相关。还发现Akt1可使UBE2S磷酸化，增强其稳定性，敲减UBE2S后可抑制NHEJ介导的DNA修复，并使得胶质母细胞瘤细胞对化疗更敏感。然而，UBE2S在肝细胞癌中的作用，特别是对肝细胞癌预后判断的作用，尚未见报道。
[0004] 肝细胞癌的预后是指预见患有肝细胞癌的病人的各种情况，如经治疗后从肝细胞癌疾患中全面康复的可能性，经治疗后复发和转移的可能性，研究显示，肝细胞癌患者的预后与诊断时间、疾病严重程度、治疗方案等各种情况具有相关性。业内认为，对肝细胞癌病人疾病的恶性程度和预后较为准确的判断有利于实施相对个性化的治疗方案，如评估为良好预后的患者，建议定期回访检查，必要时进行治疗，可以避免采用将可能引起严重副作用的危险的干预治疗方法，另一方面，对于被评估为较差预后的患者，拟建议后续进行积极检查和治疗，等等。因此，肝细胞癌患者预后判断的相关标志物的发现则显得非常重要。
[0005] 目前，应用于肝细胞癌预后判断的检测标志物产品包括：检测PIK3C2A蛋白、miR-19a、miR-425等。但由于肿瘤的异质性，为实现个体化治疗和精准治疗，需要发现和寻找更多可用于肝细胞癌预后判断的制剂盒。而关于荧光定量PCR检测UBE2S的肝细胞癌预后评估制剂盒更是未见报道。
实用新型内容
[0006] 本实用新型的目是克服现有技术的不足，提供一种荧光定量PCR检测UBE2S的肝细胞癌预后评估制剂盒。本实用新型的荧光定量PCR检测UBE2S的肝细胞癌预后评估制剂盒，可以荧光定量PCR检测UBE2S在肝细胞癌的mRNA表达量，从而简单、方便地判断出肝细胞癌患者的预后状况，为患者制定有利于实施的、相对个性化的治疗方案，具有操作简单、灵敏性高、特异性强等特点，且检测结果准确、客观、快捷。
[0007] 本实用新型解决上述技术问题的技术方案如下：一种荧光定量PCR检测UBE2S的肝细胞癌预后评估制剂盒，包括：
[0008] 盒体，所述盒体的上端开口；
[0009] 盒盖，所述盒盖设在所述盒体的上端用以将所述盒体的上端开口封闭；
[0010] 横隔板，所述横隔板与所述盒体的底面平行并将所述盒体的内部分隔为上盒体和下盒体；所述盒体的一个侧面设有用于取放冰袋的开口，所述开口处设有能开合所述下盒体的门体；
[0011] 竖隔板，所述竖隔板设有四个，均垂直设于所述横隔板上，所述竖隔板将所述上盒体的内部分隔为位于中央的内盒体和位于所述内盒体四个侧面分别独立的冰袋槽；
[0012] 以及固定板，所述固定板设于所述内盒体的内部，其底部与所述横隔板相抵触，四个侧面分别与所述竖隔板相抵触，所述固定板上开设有多个用于放置制剂瓶的通孔。
[0013] 本实用新型的原理：
[0014] 本实用新型的制剂盒是针对荧光定量PCR检测UBE2S，所需要的各个制剂需要冷藏保存。本实用新型的制剂盒的盒体为长方体形，其盒体内部由横隔板分隔为上盒体和下盒体；上盒体内部由竖隔板分隔为位于内盒体和位于内盒体四个侧面分别独立的冰袋槽；上述四个冰袋槽和下盒体分别环绕内盒体的四周和底部，且都可以放置冰袋，从而对内盒体形成了全方位的低温冷藏环境。无论是运输过程还是使用过程中，都能随时保持内盒体里的制剂瓶处于低温冷藏状态，这样，既可以保证制剂瓶里存储的制剂的稳定性，防止因高温造成制剂变质等现象的发生，减少制剂的挥发，减少气溶胶的产生，避免交叉污染，还能确保操作者进行检测时检测结果的准确性，降低实验误差。
[0015] 在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
[0016] 进一步，所述盒体与所述盒盖通过合页铰接。
[0017] 采用上述进一步的有益效果是：盒体和盒盖通过合页铰接，结构简单，易于打开或关闭盒盖。
[0018] 进一步，所述盒体和所述盒盖均采用隔热材料。
[0019] 采用上述进一步的有益效果是：盒体和盒盖均采用隔热材料，可以减少制剂盒里放置的制剂瓶与外界的热量交换，从而使得制剂盒的保温效果更佳。
[0020] 更进一步，所述隔热材料为橡胶。
[0021] 采用上述更进一步的有益效果是：盒体和盒盖采用橡胶材料，不但可以隔热，还可以起到减震缓冲的作用。
[0022] 采用上述更进一步的有益效果是：盒体和盒盖采用橡胶材料，不但可以隔热，还可以起到减震缓冲的作用。
[0023] 进一步，所述盒体的外侧面设有第一卡扣槽，所述盒盖的边缘对应设有可与所述第一卡扣槽相匹配卡接的第一卡扣。
[0024] 采用上述进一步的有益效果是：盒体和盒盖通过第一卡扣槽和第一卡扣进行卡接，可以灵活方便地实现盒盖的开合。
[0025] 进一步，所述横隔板上设有多个用于热传导的导温孔。
[0026] 采用上述进一步的有益效果是：关闭下盒体上的门体，放置于下盒体中的冰袋会和横隔板发生热传递。在横隔板上设有导温孔，利于热传导，降低横隔板的热传递阻碍程度。而且，固定板的底部与横隔板相抵触，如此，下盒体里放置的冰袋所散发的冷气就能直接、顺畅地穿过横隔板后对固定板里放置的制剂瓶进行冷却降温，制冷效果更佳。
[0027] 进一步，所述竖隔板包括两个互相平行的、与所述上盒体的两个相对的侧面垂直固定连接的第一竖隔板和两个设置在两个第一竖隔板之间并分别与上述第一竖隔板垂直固定连接的第二竖隔板。
[0028] 采用上述进一步的有益效果是：两个第一竖隔板和两个第二竖隔板结合在一起，形成环绕内盒体的四个独立的冰袋槽。在这四个冰袋槽里分别放置冰袋，可以从内盒体的四个侧面对内盒体里放置的制剂瓶进行冷却降温。
[0029] 进一步，所述固定板的材质为泡沫或者海绵。
[0030] 采用上述进一步的有益效果是：泡沫材料由于其质轻、坚固、吸震、低吸潮、易成型及良好的耐水性、绝热性、价格低等特点，被广泛地应用于包装、保温、防水、隔热、减震等领域，是当今世界上应用最广泛的塑料之一。可应用于电器、仪器仪表、工艺品和其它易损贵重物品的防震包装以及快餐食品的包装等方面。
[0031] 海绵，是一种多孔材料，具有良好的吸水性，能够用于清洁物品。人们常用的海绵由木纤维素纤维或发泡塑料聚合物制成。另外，也有由海绵动物制成的天然海绵，大多数天然海绵用于身体清洁或绘画。另外，还有三类其他材料制成的合成海绵，分别为低密度聚醚(不吸水海绵)、聚乙烯醇(高吸水材料，无明显气孔)和聚酯。海绵材料的弹性和耐用性优异，具有良好的保温、减震和隔热性能。
[0032] 进一步，所述通孔的数量为12个，分别用于放置1瓶装有荧光定量检测UBE2S的mRNA表达量的上游引物的制剂瓶、1瓶装有荧光定量检测UBE2S的mRNA表达量的下游引物的制剂瓶、1瓶装有荧光定量检测内参基因β-actin的mRNA表达量的上游引物的制剂瓶、1瓶装有荧光定量检测内参基因β-actin的mRNA表达量的下游引物的制剂瓶、6瓶装有SYBR Premix Ex TaqTMⅡ的棕色制剂瓶、1瓶装有ROX Reference Dye的棕色制剂瓶和1瓶装有双蒸水的制剂瓶。
[0033] 采用上述进一步的有益效果是：本申请的发明人通过对TCGA数据库中肝细胞癌的mRNA测序结果进行统计分析，共纳入369例肝细胞癌的数据，发现UBE2S表达在肝细胞癌和正常组织中差距显著，且UBE2S高表达的患者，总生存率降低。随后采用荧光定量PCR的方法在肝细胞癌组织和癌旁组织中检测UBE2S表达，分析该基因高表达与肝细胞癌患者预后的相关性，确定了该基因在肝细胞癌组织和癌旁组织中的表达差异，从而得出该基因可以应用于肝细胞癌预后评估中。
[0034] 本实用新型是基于荧光染料检测的即用型PCR制剂盒，可以对mRNA反转录后cDNA靶序列进行实时定量PCR分析，操作者只需准备模板cDNA既可进行1000次荧光定量PCR检测，并且即用型的预配液使加样操作步骤大大简化，避免了交叉污染，降低实验误差。
[0035] 本实用新型设置上述制剂瓶，可以荧光定量PCR检测UBE2S在肝细胞癌的mRNA表达量，从而可以简单、方便地判断出肝细胞癌患者的预后状况，为患者制定有利于实施的、相对个性化的治疗方案。一方面，对于被评估为预后良好的患者，避免采用可能引起严重副作用的、危险的干预治疗方法；另一方面，对于被评估为预后较差的患者，后续进行积极检查和治疗，降低复发转移的可能性，延长生存时间。而且，装有SYBR Premix Ex TaqTMⅡ和ROX TMReference Dye的制剂瓶设置为棕色，这是因为SYBR Premix Ex Taq Ⅱ和ROX Reference Dye需要避光冷藏保存。此外，本实用新型的制剂盒可以整体套装在一个不透明的袋子里，起到双重避光的效果。
[0036] 更进一步，所述荧光定量检测UBE2S的mRNA表达量的上游引物如SEQ ID NO.1所示，所述荧光定量检测UBE2S的mRNA表达量的下游引物如SEQ ID NO.2所示。
[0037] 其中，上游引物F:5'-gcgccaatggcgagatctg-3'(SEQ ID NO.1)；
[0038] 下游引物R:5'-ggtggatcagcaggcacttg-3'(SEQ ID NO.2)。
[0039] 更进一步，所述荧光定量检测内参基因β-actin的mRNA表达量的上游引物如SEQ ID NO.3所示，所述荧光定量检测内参基因β-actin的mRNA表达量的下游引物如SEQ ID NO.4所示。
[0040] 其中，上游引物F:5'-gaagagctacgagctgcctga-3'(SEQ ID NO.3)；
[0041] 下游引物R：5'-cagacagcactgtgttggcg-3'(SEQ ID NO.4)。
[0042] 更进一步，所述1瓶装有荧光定量检测UBE2S的mRNA表达量的上游引物的制剂瓶为1mL,所述1瓶装有荧光定量检测UBE2S的mRNA表达量的下游引物的制剂瓶为1mL,所述1瓶装有荧光定量检测内参基因β-actin的mRNA表达量的上游引物的制剂瓶为1mL，所述1瓶装有荧光定量检测内参基因β-actin的mRNA表达量的下游引物的制剂瓶为1mL、所述6瓶装有SYBR Premix Ex TaqTMⅡ的棕色制剂瓶每瓶均为4mL，所述1瓶装有ROX Reference Dye的棕色制剂瓶为1mL,所述1瓶装有双蒸水的制剂瓶为15mL。
[0043] 采用上述更进一步的有益效果是：上述制剂瓶里放置的各个制剂的量，可以用于1000次荧光定量PCR检测。
[0044] 进一步，所述开口与所述门体通过合页铰接。
[0045] 采用上述进一步的有益效果是：开口和门体通过合页铰接，结构简单，易于打开或关闭开口。
[0046] 术语解释
[0047] 1.术语“生物标志物”
[0048] 在本实用新型中，术语“生物标志物”是其在组织或细胞中的表达水平与正常或健康细胞或组织的表达水平相比发生改变的任何基因或蛋白。
[0049] 2.术语“预后”
[0050] 在本实用新型中，术语“预后”用来预测本实用新型的肝细胞癌的进展(包括复发、转移性扩散及耐药性)的可能性。术语“预后”用来说明患者在经过主要肿瘤的切除术后无癌症复发下生存特定期间的可能性。这种预测是通过对任一特定患者选择最适宜的疗法而在临床上可用来确定治疗。这种预测可在患者对治疗养生，例如能否易于对手术做出积极反应，或患者在手术结束后能否长期存活的判断成为宝贵的工具。术语“预后良好”或“良好预后”可表示为临床结果的积极临床结果的可能性的提高，术语“不良预后”或“预后不良”可表示为临床结果的积极临床结果的可能性的降低。
[0051] 3.术语“高表达”、“低表达”
[0052] “高表达”、“低表达”均是相对于正常人相应组织中的表达水平而言。
[0053] 本实用新型的有益效果是：
[0054] 1.本实用新型的荧光定量PCR检测UBE2S的肝细胞癌预后评估制剂盒，可以荧光定量PCR检测UBE2S在肝细胞癌的mRNA表达量，从而简单、方便地判断出肝细胞癌患者的预后状况，为患者制定有利于实施的、相对个性化的治疗方案，具有操作简单、灵敏性高、特异性强等特点，且检测结果准确、客观、快捷。
[0055] 2.本实用新型的荧光定量PCR检测UBE2S的肝细胞癌预后评估制剂盒，无论是运输过程还是使用过程中，都能随时保持内盒体里的制剂瓶处于低温冷藏状态，这样，既可以保证制剂瓶里存储的制剂的稳定性，防止因高温造成制剂变质等现象的发生，减少制剂的挥发，减少气溶胶的产生，避免交叉污染，还能确保操作者进行检测时检测结果的准确性，降低实验误差。
[0056] 3.本实用新型是基于荧光染料检测的即用型PCR制剂盒，可以对mRNA反转录后cDNA靶序列进行实时定量PCR分析，操作者只需准备模板cDNA既可进行1000次荧光定量PCR检测，并且即用型的预配液使加样操作步骤大大简化，避免了交叉污染，降低实验误差。
[0057] 4.本实用新型的荧光定量PCR检测UBE2S的肝细胞癌预后评估制剂盒，结构科学合理，使用安全方便，体积小巧灵便，市场前景广阔，适合规模化生产。
具体实施方式
[0069] 以下结合附图对本实用新型的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本实用新型，并非用于限定本实用新型的范围。
[0070] 实施例1：荧光定量PCR检测UBE2S的肝细胞癌预后评估制剂盒
[0071] 如图1-图4所示，一种荧光定量PCR检测UBE2S的肝细胞癌预后评估制剂盒，包括：
[0072] 盒体1，所述盒体1的上端开口；
[0073] 盒盖2，所述盒盖2设在所述盒体1的上端用以将所述盒体1的上端开口封闭；
[0074] 横隔板3，所述横隔板3与所述盒体1的底面平行并将所述盒体1的内部分隔为上盒体4和下盒体5；所述下盒体5的一个侧面设有用于取放冰袋的开口11，所述开口11处设有能开合所述下盒体5的门体12；
[0075] 竖隔板6，所述竖隔板6设有四个，均垂直设于所述横隔板3上，所述竖隔板6将所述上盒体4的内部分隔为位于中央的内盒体7和位于所述内盒体7四个侧面分别独立的冰袋槽8；
[0076] 以及固定板9，所述固定板9设于所述内盒体7的内部，其底部与所述横隔板3相抵触，四个侧面分别与所述竖隔板6相抵触，所述固定板9上开设有多个用于放置制剂瓶的通孔10。
[0077] 本实用新型的制剂盒是针对荧光定量PCR检测UBE2S，所需要的各个制剂需要冷藏保存。本实用新型的制剂盒的盒体为长方体形，其盒体内部由横隔板分隔为上盒体和下盒体；上盒体内部由竖隔板分隔为位于内盒体和位于内盒体四个侧面分别独立的冰袋槽；上述四个冰袋槽和下盒体分别环绕内盒体的四周和底部，且都可以放置冰袋，从而对内盒体形成了全方位的低温冷藏环境。无论是运输过程还是使用过程中，都能随时保持内盒体里的制剂瓶处于低温冷藏状态，这样，既可以保证制剂瓶里存储的制剂的稳定性，防止因高温造成制剂变质等现象的发生，减少制剂的挥发，减少气溶胶的产生，避免交叉污染，还能确保操作者进行检测时检测结果的准确性，降低实验误差。
[0078] 其中，所述盒体1与所述盒盖2通过合页13铰接。盒体和盒盖通过合页铰接，结构简单，易于打开或关闭盒盖。
[0079] 所述盒体1和所述盒盖2均采用隔热材料。盒体和盒盖均采用隔热材料，可以减少制剂盒里放置的制剂瓶与外界的热量交换，从而使得制剂盒的保温效果更佳。
[0080] 所述隔热材料为橡胶。盒体和盒盖采用橡胶材料，不但可以隔热，还可以起到减震缓冲的作用。
[0081] 所述盒体1的外侧面设有第一卡扣槽14，所述盒盖2的边缘对应设有可与所述第一卡扣槽14相匹配卡接的第一卡扣15。盒体和盒盖通过第一卡扣槽和第一卡扣进行卡接，可以灵活方便地实现盒盖的开合。
[0082] 所述横隔板3上设有多个用于热传导的导温孔16。关闭下盒体上的门体，放置于下盒体中的冰袋会和横隔板发生热传递。在横隔板上设有导温孔，利于热传导，降低横隔板的热传递阻碍程度。而且，固定板的底部与横隔板相抵触，如此，下盒体里的冰袋所散发的冷气就能直接、顺畅地穿过横隔板后对固定板里放置的制剂瓶进行冷却降温，制冷效果更佳。
[0083] 所述竖隔板6包括两个互相平行的、与所述上盒体4的两个相对的侧面垂直固定连接的第一竖隔板61和两个设置在两个第一竖隔板61之间并分别与上述第一竖隔板61垂直固定连接的第二竖隔板62。两个第一竖隔板和两个第二竖隔板结合在一起，形成环绕内盒体的四个独立的冰袋槽。在这四个冰袋槽里分别放置冰袋，可以从内盒体的四个侧面对内盒体里放置的制剂瓶进行冷却降温。
[0084] 所述固定板9的材质为泡沫或者海绵。泡沫或海绵均具有良好的保温、减震和隔热性能。
[0085] 所述通孔10的数量为12个，分别用于放置1瓶装有荧光定量检测UBE2S的mRNA表达量的上游引物的制剂瓶、1瓶装有荧光定量检测UBE2S的mRNA表达量的下游引物的制剂瓶、1瓶装有荧光定量检测内参基因β-actin的mRNA表达量的上游引物的制剂瓶、1瓶装有荧光定量检测内参基因β-actin的mRNA表达量的下游引物的制剂瓶、6瓶装有SYBR Premix Ex TaqTMⅡ的棕色制剂瓶、1瓶装有ROX Reference Dye的棕色制剂瓶和1瓶装有双蒸水的制剂瓶。本实用新型是基于荧光染料检测的即用型PCR制剂盒，可以对mRNA反转录后cDNA靶序列进行实时定量PCR分析，操作者只需准备模板cDNA既可进行1000次荧光定量PCR检测，并且即用型的预配液使加样操作步骤大大简化，避免了交叉污染，降低实验误差。本实用新型设置上述制剂瓶，可以荧光定量PCR检测UBE2S在肝细胞癌的mRNA表达量，从而可以简单、方便地判断出肝细胞癌患者的预后状况，为患者制定有利于实施的、相对个性化的治疗方案。
[0086] 所述1瓶装有荧光定量检测UBE2S的mRNA表达量的上游引物的制剂瓶为1mL,所述1瓶装有荧光定量检测UBE2S的mRNA表达量的下游引物的制剂瓶为1mL,所述1瓶装有荧光定量检测内参基因β-actin的mRNA表达量的上游引物的制剂瓶为1mL，所述1瓶装有荧光定量检测内参基因β-actin的mRNA表达量的下游引物的制剂瓶为1mL、所述6瓶装有SYBR Premix Ex TaqTMⅡ的棕色制剂瓶每瓶均为4mL，所述1瓶装有ROX Reference Dye的棕色制剂瓶为1mL,所述1瓶装有双蒸水的制剂瓶每瓶均为15mL。
[0087] 所述荧光定量检测UBE2S的mRNA表达量的上游引物如SEQ ID NO.1所示，所述荧光定量检测UBE2S的mRNA表达量的下游引物如SEQ ID NO.2所示。
[0088] 其中，上游引物F:5'-gcgccaatggcgagatctg-3'(SEQ ID NO.1)；
[0089] 下游引物R:5'-ggtggatcagcaggcacttg-3'(SEQ ID NO.2)。
[0090] 所述荧光定量检测内参基因β-actin的mRNA表达量的上游引物如SEQ ID NO.3所示，所述荧光定量检测内参基因β-actin的mRNA表达量的下游引物如SEQ ID NO.4所示。
[0091] 其中，上游引物F:5'-gaagagctacgagctgcctga-3'(SEQ ID NO.3)；
[0092] 下游引物R：5'-cagacagcactgtgttggcg-3'(SEQ ID NO.4)。
[0093] 所述1瓶装有荧光定量检测UBE2S的mRNA表达量的上游引物的制剂瓶为1mL,所述1瓶装有荧光定量检测UBE2S的mRNA表达量的下游引物的制剂瓶为1mL,所述1瓶装有荧光定量检测内参基因β-actin的mRNA表达量的上游引物的制剂瓶为1mL，所述1瓶装有荧光定量检测内参基因β-actin的mRNA表达量的下游引物的制剂瓶为1mL、所述6瓶装有SYBR Premix Ex TaqTMⅡ的棕色制剂瓶每瓶均为4mL，所述1瓶装有ROX Reference Dye的棕色制剂瓶为1mL,所述1瓶装有双蒸水的制剂瓶为15mL。上述制剂瓶里放置的各个制剂的量，可以用于
1000次荧光定量PCR检测。
[0094] 所述开口11与所述门体12通过合页13铰接。开口和门体通过合页铰接，结构简单，易于打开或关闭开口。
[0095] 实施例2：TCGA数据库分析
[0096] 利用TCGA可视化数据库GEPIA(Gene Expression Profiling Interactive Analysis)分析UBE2S在369例肝细胞癌样本和50例正常样本中的表达水平，结果如图5所示。
[0097] 由图5可知，UBE2S在肝细胞癌组织中的表达高于正常组织。
[0098] 采用Kaplan-Meier生存分析法，分析UBE2S在TCGA数据库肝细胞癌样本中表达与预后的关系，依据UBE2S表达值的中位数，将样本分成高低表达两组。结果如图6所示。
[0099] 由图6可知，UBE2S高表达的患者，其总生存率显著降低。
[0100] 实施例3：荧光定量PCR检测UBE2S在肝细胞癌和癌旁样本中的表达
[0101] 3.1组织来源
[0102] 66例肝细胞癌组织和21例配对的癌旁组织均来自于桂林医学院附属医院肝胆外科。手术时间为2010年12月-2012年12月，随访时间截止到2016年4月。
[0103] 3.2RNA提取
[0104] (1)取冻存于液氮中的肝细胞癌组织和癌旁组织，置于预冷的研钵中研磨成粉末，然后加入1mL裂解液Trizol，室温静置5min，得到裂解物。
[0105] (2)将裂解物移入1.5mL离心管中，加入0.2mL氯仿，用力振荡离心管，室温放置10min，然后12000rpm离心15min，取上层水相到另一新的1.5mL离心管中。
[0106] (3)加入与上层水相等体积的预冷异丙醇，颠倒混匀，置于冰上裂解10min，然后12000rpm离心15min，弃上清，加入1mL 75％(v/v)乙醇，振荡1min，12000rpm离心5min，弃乙醇，室温静置5min，待乙醇挥发后，加入30μL的DEPC水，提取得到总RNA。用Nanodrop2000紫外分光光度计测量总RNA的纯度及浓度，于-80℃冷藏保存。
[0107] 3.3逆转录
[0108] 对步骤2.2提取的总RNA进行逆转录反应。
[0109] 每个样本取500ng总RNA作为模板RNA，先加入2μL的5×gDNA Eraser Buffer、1μL的gDNA Eraser，再加入无RNA酶水至总体积为10μL。于42℃放置2min，去除基因组DNA。之后往上述反应液中加入4μL的5×PrimerScript Buffer 2、1μL的PrimerScript RT Enzyme MixI、1μL的RT Primer Mix，再加入无RNA酶水至总体积为20μL，37℃，反应15min，85℃，反应5s，得到逆转录的cDNA，4℃冷藏保存。
[0110] 3.4荧光定量PCR扩增检验
[0111] 采用本实用新型的荧光定量PCR检测UBE2S的肝细胞癌预后评估制剂盒，反应体系为：
[0112]
[0113] 荧光定量PCR扩增程序为：
[0114]
[0115] 3.5结果判断
[0116] 以β-actin为内参基因，对UBE2S进行归一化处理，以确保在相等数量的样本中比较UBE2S的表达量。UBE2S基因相对表达量＝2-△Ct，其中△Ct＝肝细胞癌组织UBE2S基因Ct值-肝细胞癌组织β-actin基因Ct值，得出UBE2S基因表达量相对于内参基因表达量的变化倍数。
[0117] 3.6统计学方法
[0118] 采用3次以上的重复实验，结果以(平均值±标准差)的方式来表示，使用SPSS 20.0统计软件进行统计分析，肝细胞癌组织和癌旁组织两者之间的差异采用t检验，当P<
0.05时，具有统计学意义。
[0119] 3.7结果
[0120] 结果如图7所示。
[0121] 由图7可知，UBE2S在肝细胞癌组织中高表达。经统计学分析，UBE2S基因在肝细胞癌组织中的表达显著高于在癌旁组织中的表达(P＝0.0365)，与实施例2中TCGA数据库分析结果一致。
[0122] 实施例4：UBE2S高表达的临床意义
[0123] 使用GraphPad Prism 7.0软件，进行Kaplan-Meier生存分析。依据UBE2S表达值的中位数，将样本分成高表达和低表达两组。结果图8所示。
[0124] 由图8可知，当检测结果中UBE2S表达数据为表达值中位数以上，则为UBE2S高表达；检测结果中UBE2S表达数据为表达值中位数以下，则为UBE2S低表达。UBE2S高表达与肝细胞癌患者总生存率的降低显著相关，预后为高死亡率；术后复发、转移几率高，建议患者后续进行积极检查和治疗。UBE2S低表达与肝细胞癌患者总生存率的升高显著相关，预后为低死亡率；术后复发、转移几率低，预后较为乐观，但需患者定期回访检查，必要时进行治疗。
[0125] 图8所示结果，与实施例2中TCGA数据库分析结果一致。
[0126] 实施例5：采用受试者工作曲线(ROC)评估UBE2S用于预测肝细胞癌患者手术后生存时间的价值
[0127] 使用GraphPad Prism 7.0软件，以UBE2S表达为变量，根据不同的阈值对患者术后生存5年时间预测的灵敏度和特异性绘制出ROC曲线，并计算AUC(曲线下面积)。
[0128] ROC曲线全称为受试者工作特征曲线(Receiver Operator Characteristic Curve)，又称为接收者操作特性曲线，主要用于临床生化诊断试验。ROC曲线是反映真阳性率(灵敏度，又称敏感性，sensitivity)和假阳性率(1-特异性，specificity)连续变量的综合指标，是用构图法揭示灵敏度和特异性的相互关系。它通过设定一系列不同的分界值(阈值或临界值，cut-off value，是划分诊断试验结果正常与异常的界值)作为连续变量，从而计算出一系列灵敏度和特异性，再以灵敏度为纵坐标、1-特异性为横坐标绘制的曲线，曲线下面积(AUC)越大，诊断准确性越高。在ROC曲线上，最靠近坐标图左上方的点为灵敏度和特异性均较高的临界值。ROC曲线AUC值在1.0和0.5之间。在AUC＞0.5的情况下，AUC越接近于
1，说明诊断效果越好。AUC在0.5-0.7时有较低准确性，AUC在0.7-0.9时有一定准确性，AUC在0.9以上时有较高准确性。
[0129] 结果如图9所示。
[0130] 由图9可知，当UBE2S在最佳阈值(灵敏度+特异度-1得到的最大值)时，预测肝细胞癌患者术后生存5年的灵敏度为79.66％(95％置信区间为：67.17％-89.02％)，特异性为85.71％(95％置信区间为：42.13％-99.64％)，ROC曲线下面积AUC为0.8402，p＝0.0034。
AUC大于0.7，具有临床诊断意义。
[0131] 以上所述仅为本实用新型的较佳实施例，并不用以限制本实用新型，凡在本实用新型的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本实用新型的保护范围之内。
