[0001] 本申请涉及基因检测领域，特别是涉及一种用于BRAF基因ddPCR检测的试剂盒。

[0002] 肿瘤分子靶向治疗是以肿瘤相关的特异性分子作为靶点，这个靶点可以是蛋白分子或者核酸片段，或是其他基因产物，然后利用靶标分子的特异性抑制剂、封闭剂或者药物进行治疗的手段。分子靶标治疗的策略可以从肿瘤细胞自身、供应肿瘤组织营养的血管生成以及维护肿瘤组织生长和转移的微环境三方面入手。

[0003] 目前上市的肿瘤分子靶向药物主要为单克隆抗体和小分子化合物。单克隆抗体通常利用大分子抗体与靶点结合，以阻断细胞外信号分子与靶点的结合，激活抗体依赖的细胞毒作用，或是激活补体途径或与细胞膜受体结合对抗膜借导的生长控制作用，从而达到治疗的效果。例如，单抗药物赫赛汀对高表达HER-2的乳腺癌患者的治疗具有非常积极的作用。赫赛汀与HER-2受体结合，导致肿瘤细胞生长信号被阻断，肿瘤细胞生长得到抑制；同时，赫赛汀与过度表达HER-2受体的细胞表面结合，诱导NK细胞和巨噬细胞释放各种活性因子溶解肿瘤细胞。酪氨酸激酶是促进蛋白质酪氨酸残基发生磷酸化的一种蛋白激酶，在细胞生长、分化、增值方面有重要作用。小分子化合物通常是信号传导抑制剂，能够特异性地阻断肿瘤生长、增殖过程中所必需的信号传导通路，从而达到治疗的目的。例如，表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶阻断剂吉非替尼，能抑制EGFR跨膜细胞表面受体上酪氨酸激酶的自身磷酸化，从而阻止细胞增殖，促进凋亡。

[0004] 靶向药物应在医生的指导下科学使用，一般单独使用或和化疗药物联合使用。临床上若显示癌细胞已经产生耐药性，应停止使用靶向药物或者更换治疗方案。靶向药物通常有相对应的靶基因或靶蛋白，因此靶向药物的选择需要针对患者的基因分型或者蛋白表达状态。

[0005] BRAF基因位于人染色体7q34，长约190kb，是RAS/RAF/MEK/MRK/MAPK信号转导通路重要的转导因子，主要通过有丝蛋白激酶通路中的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶来发挥作用。该酶将细胞表面的受体和RAS蛋白通过MEK和ERK与核内的转录因子相连接，启动多种因子参与调控细胞内多种生物学事件，如细胞生长、分化和凋亡等。研究表明在非小细胞肺癌、结直肠癌、黑色素瘤、甲状腺癌等恶性肿瘤中存在BRAF基因突变，其中第15号外显子V600E点突变最常见，1799位的T颠换位A，导致其编码的缬氨酸变为谷氨酸，约占所有突变的90％以上，该突变导致BRAF蛋白被异常激活。有研究表明，带有BRAF基因V600E突变的结直肠癌患者接受西妥昔单抗或帕尼单抗，不论单药还是和标准化疗联合，很大程度上不能产生治疗应答。因此2017年V1版结直肠癌NCCN推荐对KRAS/NRAS基因野生型的IV期患者在确诊时进行BRAF基因检测。此外，BRAF V600E还有对应的靶向药物治疗方案。2017年V1版黑色素瘤NCCN指南推荐维罗菲尼和达拉菲尼作为BRAF V600突变抑制剂。2017年V8版非小细胞肺癌NCCN推荐BRAF V600E对应的靶向治疗药物有达拉菲尼，曲美替尼和维罗菲尼。

[0006] 微滴式数字PCR(缩写ddPCR)属于第三代PCR技术，是一种新的绝对定量技术，通过极度稀释实现理论上的单分子扩增，然后用终点法PCR和泊松分布计算出样本的原始浓度。相对于qPCR，ddPCR能够检测含量极低的核酸序列，检测限可低至0.001％，且无需标准品即可对靶分子起始量进行绝对定量。由于ddPCR技术采用的是终点PCR法，不依赖于扩增效率，能克服PCR抑制剂的影响，因此所适用的样本范围更广，对样本质量的要求也相对较低。高准确度、精密度和重复性使得ddPCR在低频基因突变检测、基因拷贝数检测等领域具有极大潜力，可用于肿瘤诊断、用药指导和疗效监测，促进肿瘤个体化治疗发展。

[0007] 现有的肿瘤基因检测技术主要包括qPCR，ARMS，一代测序、FISH、IHC、NGS等。这些方法检测步骤繁琐，有些灵敏度低，且存在很多弊端。例如：FISH以及IHC的检测结果需要有经验的技术人员进行鉴定，测试结果受人为影响大；全基因组或外显子组的检测，虽然检测内容丰富，但成本高，检出的绝大多数信息与用药指导无关；二代高通量靶向捕获测序检测步骤繁琐，工作量较大，检测周期较长，仅检测1-2个基因位点突变信息的费用较高；qPCR依据扩增效率判定结果，容易受PCR抑制剂的影响，对检测样本的质量要求较高。因此需要一种更加便捷、快速、准确、经济的检测手段，获取临床相关的基因信息。

[0008] 目前尚没有BRAF基因采用ddPCR检测的相关研究和报道，也没有任何相关的试剂盒。因此，亟需研发一种特别针对BRAF基因的ddPCR检测的试剂盒，以方便临床检测和试验。

[0033] 下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。

[0034] 实施例

[0035] 本例用于BRAF基因ddPCR检测的试剂盒，如图1所示，包括盒体1、盒盖11和内衬2，内衬2设置于盒体1内，盒盖11用于盖合盒体1，将内衬2整体封装在盒体1内，内衬包括以下模块，ddPCR Mix试剂模块21，设有相应的孔位，用以放置ddPCR Mix试剂；P-WT-HEX探针模块22，用以放置P-WT-HEX探针；P-V600E-FAM探针模块23，用以放置P-V600E-FAM探针；引物模块24，用以放置上游引物和下游引物的引物混合物；限制性内切酶模块25，用以放置限制性内切酶；质控品模块26，设有相应的孔位，其中独立的封装有阴性质控品、1％阳性质控品和0.1％阳性质控品。

[0036] 其中，阴性质控品为BRAF基因V600E野生型核酸，1％阳性质控品为含有1％的BRAF基因V600E突变的核酸，0.1％阳性质控品为含有0.1％的BRAF基因V600E突变的核酸。阴性质控品、1％阳性质控品和0.1％阳性质控品都是由Horizon Discovery公司定制的基因组DNA。

[0037] P-WT-HEX探针为Seq ID No.1所示序列，其3’端具有MGB-NFQ基团修饰，5’端有HEX荧光报告基团修饰，

[0038] Seq ID No.1：5’-GTCTAGCTACAGTGAAATCTCGAT-3’。

[0039] P-V600E-FAM探针为Seq ID No.2所示序列，其3’端具有MGB-NFQ基团修饰，5’端有FAM荧光报告基团修饰，

[0040] Seq ID No.2：5’-GTCTAGCTACAGAGAAATCTCGAT-3’。

[0041] 上游引物为Seq ID No.3所示序列，下游引物为Seq ID No.4所示序列；

[0042] Seq ID No.3：5’-TACTACACCTCAGATATATTTCTTCA-3’

[0043] Seq ID No.4：5’-CACAAAATGGATCCAGACAACTGTTCAA-3’。

[0044] 本例中，限制性内切酶为BamHI和HindIII ddPCR Mix试剂为Bio-Rad公司的2×ddPCR supermix for probes试剂。引物混合物中，上游引物和下游引物的浓度分别为450nM；两个探针浓度各为250nM。

[0045] 本例的试剂盒，使用方法如下：

[0046] 1)按照常规方法提取样本的基因组DNA，建议使用商业试剂盒，按照说明书步骤进行提取，本例不做具体限定。

[0047] 2)ddPCR反应体系配制，按照表1所示，配制PCR反应体系，将配制好的mix溶液转移至样本制备区，14μL/管进行分装；

[0048] 表1 ddPCR反应体系

[0049]PCR反应组分 体积(μL)
2×ddPCR Mix 10
P-WT-HEX 1
P-V600E-FAM 1
引物混合物 1
限制性内切酶 1
Total 14

[0050] 3)添加模板，需保证样本基因组DNA总量为20ng及以上，通常添加6μL基因组DNA，构成总量为20μL/管的ddPCR反应体系。

[0051] 4)ddPCR检测阶段，该阶段在ddPCR检测区完成，按照ddPCR操作说明书进行，其中本例试剂盒的PCR扩增条件如表2所示。

[0052] 表2 ddPCR反应条件

[0053]

[0054] 本例对阴性质控品、1％阳性质控品和0.1％阳性质控品进行了检测，检测结果如图2所示。图2中，A01通道是空白对照，以水为模板；C02为阴性对照组，以阴性质控品为模板；E01是弱阳性对照组，以0.1％阳性质控品为模板；F01是强阳性对照组，以1％阳性质控品为模板；D03是受检样本，以CC170528的gDNA为模板。从图2可知，以A01，C02为参照，突变型探针的荧光阈值划定为3700，野生型探针的荧光阈值划定为2800。图2的结果说明本例试剂盒的特异性很好，能明显区分出野生型微滴和突变型微滴。

[0055] 图3是检测样本及质控品突变率展示图，可以看出，A01和C02没有检出突变率，因此以0为基线，E01检出说明本例试剂盒的检测下限为0.1％，高于0.1％的突变率都是可信的，F01检出说明本例试剂盒检测操作无误，D03检出说明该受检样本突变率为4.4％，准确可信。

[0056] 以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

[0057]