技术领域
[0001] 本实用新型属于医疗器械领域，涉及一种EGFR外显子基因突变的检测试剂盒。
相关背景技术
[0002] 近年来，非小细胞肺癌治疗领域里程碑式的改变是针对表皮生长因子受体 (epidermal growth factor receptor,EGFR)基因突变阳性的晚期患者采用EGFR- 酪氨酸激酶抑制剂进行治疗。常用的EGFR-TKI包括吉非替尼和厄洛替尼，是目前患者最有效的靶向药物尽管对初始EGFR-TKI治疗应答良好，但大部分患者在平均治疗10个月后会出现对此类药物的耐药。
[0003] 一些研究报道显示，使用EGFR-TKI治疗进展的肿瘤中，50％的病人存在 EGFR基因20号外显子第790位点的突变，即T790M基因突变。因此通过检测 EGFR T790M基因存不存在突变，可以筛选出靶向药物治疗有效的肿瘤患者，实现肿瘤病人的个体化治疗，从而提高靶药的治疗效果，延长患者生存期。而对于存在突T790M基因变的患者，则能提示患者尽早的更换治疗方案，减少不必要的治疗费用和毒副作用。
[0004] CN 202519263 U公开了一种对病人新鲜组织以及石蜡切片中EGFR外显子基因突变检测试剂盒，其试剂盒主要包括的试剂为、EGFR第18号、19号、20 号以及21号外显子特异性测序引物瓶、装有酶混合物的试剂瓶、加样器吸头、电泳分离检测试剂瓶等，但是其不能将提取和检测同时完成，需要额外进行提取后再进行检测，过程复杂。
[0005] 目前临床检测基因突变的检测试剂原料需多方配备，实验过程分步进行，耗时较长，容易污染，准确性不高，而且检测的样品大多数为肿瘤组织和非肿瘤组织，很少有针对治疗前样品(如血液)的检测试剂盒，因此发明一种针对血液样品T790M基因突变快速检测的试剂盒对于临床上非小细胞肺癌治疗方案的制定具有十分重要的意义。实用新型内容
[0006] 本实用新型的目的在于提供一种EGFR外显子基因突变的检测试剂盒，该试剂盒的盒体中设置有一个隔离墙，能够将检测过程中所用的试剂与枪头，收集管等耗材分离开来，这样保证了实验所用的耗材不会受试剂挥发等导致的污染，从而有助于实验准确性的提高。
[0007] 为达到此实用新型目的，本实用新型采用以下技术方案：
[0008] 一方面，本实用新型提供一种EGFR外显子基因突变的检测试剂盒，包括盒体1以及与盒体相连的翻盖式盒盖2，所述盒体内具有耗材储存单元、检测单元和提取单元，所述耗材储存单元与所述检测单元和提取单元用隔离墙18隔开。
[0009] 根据本实用新型，所述耗材储存单元包括PCR管3、加样器吸头7和DNA 收集管17。
[0010] 根据本实用新型，所述PCR管3具有至少1个，例如可以是1个、2个、3 个、4个或5个，优选为1-3个，进一步优选为1个。
[0011] 根据本实用新型，所述加样器吸头7至少有6个，例如可以是6个、7个、 8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个，优选为6-10个，进一步优选为6个。
[0012] 根据本实用新型，所述DNA收集管17至少有1个，例如可以是1个、2 个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，优选为1-3个，进一步优选为1个。
[0013] 根据本实用新型，所述试剂盒设置了至少8个凹槽用于放置所述耗材储存单元的PCR管3、加样器吸头7和DNA收集管17。
[0014] 根据本实用新型，所述检测单元包括EGFR第20号外显子正向引物瓶4、 EGFR第20号外显子反向引物瓶5、装酶混合物的试剂瓶6、电泳分离检测试剂瓶8、去离子水瓶9和醋酸钠溶液瓶10；
[0015] 其中，所述酶混合物为dNTPs、Mg2+、2×Buffer和Taq酶的组合。
[0016] 根据 本实用新 型，所述 EGFR 第20号 外显子正向 引物 为 5’-TCTTCACCTGGAAGGGGTCC-3’；
[0017] 所述EGFR第20号外显子反向引物为 5’-CAGACCGCATGTGAGGATCC-3’。
[0018] 根据本实用新型，所述试剂盒设置了6个凹槽用于放置所述检测单元的 EGFR第20号外显子正向引物瓶4、EGFR第20号外显子反向引物瓶5、装酶混合物的试剂瓶6、电泳分离检测试剂瓶8、去离子水瓶9和醋酸钠溶液瓶10。
[0019] 根据本实用新型，所述提取单元包括提取试剂瓶、蛋白酶K瓶15和乙醇瓶 16。
[0020] 根据本实用新型，所述提取试剂瓶有至少4个，例如可以是4个、5个、6 个、7个、8个、9个或10个，优选为4-6个，进一步优选为4个。
[0021] 根据本实用新型，所述提取试剂瓶包括提取试剂A瓶11、提取试剂B瓶12、提取试剂C瓶13和提取试剂D瓶14；
[0022] 其中，所述提取试剂A瓶11包括盐酸胍的裂解液；所述提取试剂B瓶12 包括盐酸胍和氯化钠的组合；所述提取试剂C瓶13包括Tris-HCl、水和乙醇的组合；所述提取试剂D瓶14包括Tris-HCl和EDTA的组合。
[0023] 根据本实用新型，所述试剂盒设置了至少6个凹槽用于放置所述提取单元的提取试剂A瓶11、提取试剂B瓶12、提取试剂C瓶13、提取试剂D瓶14、蛋白酶K瓶15和乙醇瓶16。
[0024] 根据本实用新型，所述试剂瓶均为封闭无菌试剂瓶，可为平底、圆底或锥形底，在此不做特殊限定。
[0025] 根据本实用新型，所述试剂瓶中的试剂的浓度都为本领域检测EGFR外显子检测的常规浓度，本领域技术人员可以根据检测的需要进行选择，在此不做特殊限定。
[0026] 根据本实用新型，所述试剂盒还包括说明书。
[0027] 本实用新型中，所述试剂盒的具体使用方法如下：
[0028] 1、提取血液中的样本
[0029] (1)取一个加20μL蛋白酶K到1.5mL离心管中，加入血液样品，加200μL 的提取试剂A，涡旋震荡15s；
[0030] (2)将步骤(1)混合物56℃温育10min，直到裂解完全并快速离心；
[0031] (3)加200μL乙醇(100％)，涡旋15s，快速离心；
[0032] (3)转移混合液到DNA收集管，6000g或8000rpm，离心1min，换新管，弃掉旧的收集管；
[0033] (4)加500μL提取试剂B，涡旋15s，6000g或8000rpm，离心1min，弃旧管换新管；
[0034] (5)加500μL提取试剂C，涡旋15s，全速(20000g或14，000rpm)离心 1min，换新管，全速(20000g或14000rpm)空管离心3min；
[0035] (6)100μL提取剂D温室孵育5min，6000g或8000rpm，离心1min。
[0036] 2、PCR反应
[0037] 反应体系：将各反应物质按照如下反应体系进行配比：模板DNA取80-100ng 提取的DNA、EGFR第20号外显子引物各1μL、酶混合物12.5μL、灭菌去离子水补至25μL。
[0038] 反应条件：将反应体系中各物质在中混合，按照如下程序反应：95℃5min， 1个循环；95℃30s→60℃30s→72℃40s，35个循环；72℃7min 1个循环→4℃保温。
[0039] 3、纯化鉴定
[0040] (1)每个PCR管加入50μL 100％乙醇，震荡混匀，室温避光放置15min， 12000g，4℃离心30min；
[0041] (2)用移液枪吸尽上清，每管加入70μL 70％乙醇，12000g，4℃离心15min；
[0042] (3)用移液枪吸尽上清，室温挥发净酒精，加入溶解DNA，溶解后的样品需要在95℃变性4min，迅速置冰中冷却4min后，上样电泳；
[0043] (4)对上样的结果进行分析。
[0044] 相对于现有技术，本实用新型具有以下有益效果：
[0045] (1)本试剂盒结构简单、设计合理、使用方便、检测过程所用的试剂均单独分管包装，避免了试剂间的相互污染；
[0046] (2)本试剂盒添加了提取单元，能够检测的同时提取，无需再单独进行提取，方便快捷，且在检测病人血液样品EGFR基因第20外显子突变时具有敏感性高、特异性强、耗时短等优点；
[0047] (3)本试剂盒的盒体中设置有一个隔离墙，能够将检测过程中所用的试剂与枪头，收集管等耗材分离开来，这样保证了实验所用的耗材不会受试剂挥发等导致的污染，从而有助于实验准确性的提高。
具体实施方式
[0051] 下面通过具体实施方式来进一步说明本实用新型的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本实用新型，不应视为对本实用新型的具体限制。
[0052] 实施例1试剂盒的组装
[0053] 如图1所示，本实用新型提供一种EGFR外显子基因突变的检测试剂盒，包括盒体1以及与盒体相连的翻盖式盒盖2，所述盒体内具有耗材储存单元、检测单元和提取单元，所述耗材储存单元与所述检测单元和提取单元用隔离墙18 隔开；
[0054] 所述耗材储存单元包括PCR管3、加样器吸头7和DNA收集管17；
[0055] 所述试剂盒设置了至少8个凹槽用于放置所述耗材储存单元的PCR管3、加样器吸头7和DNA收集管17，所述PCR管3具有1个，所述加样器吸头7 有6个，所述DNA收集管17有1个；
[0056] 所述试剂盒设置了6个凹槽用于放置所述检测单元的EGFR第20号外显子正向引物瓶4、EGFR第20号外显子反向引物瓶5、装酶混合物的试剂瓶6、电泳分离检测试剂瓶8、去离子水瓶9和醋酸钠溶液瓶10；
[0057] 所述检测单元包括EGFR第20号外显子正向引物瓶4、EGFR第20号外显子反向引物瓶5、装酶混合物的试剂瓶6、电泳分离检测试剂瓶8、去离子水瓶 9和醋酸钠溶液瓶10；
[0058] 其中，所述酶混合物为dNTPs、Mg2+、2×Buffer和Taq酶的组合；
[0059] 所述EGFR第20号外显子正向引物为 5’-TCTTCACCTGGAAGGGGTCC-3’；
[0060] 所述EGFR第20号外显子反向引物为 5’-CAGACCGCATGTGAGGATCC-3’；
[0061] 所述提取单元包括提取试剂瓶、蛋白酶K瓶15和乙醇瓶16，所述提取试剂瓶有4个；
[0062] 所述试剂盒设置了6个凹槽用于放置所述提取单元的提取试剂A瓶11、提取试剂B瓶12、提取试剂C瓶13、提取试剂D瓶14、蛋白酶K瓶15和乙醇瓶16；
[0063] 所述提取试剂瓶包括提取试剂A瓶11、提取试剂B瓶12、提取试剂C瓶 13和提取试剂D瓶14，其中，所述提取试剂A瓶11包括盐酸胍的裂解液；所述提取试剂B瓶12包括盐酸胍和氯化钠的组合；所述提取试剂C瓶13包括 Tris-HCl、水和乙醇的组合；所述提取试剂D瓶14包括Tris-HCl和EDTA的组合。
[0064] 实施例2试剂盒的组装
[0065] 与实施例1相比，除试剂盒采用如下结构外，其它与实施例1相同。
[0066] 所述试剂盒设置了至少16个凹槽用于放置所述耗材储存单元的PCR管3、加样器吸头7和DNA收集管17，所述PCR管3具有3个，所述加样器吸头7 有10个，所述DNA收集管17有3个；
[0067] 根据本实用新型，所述试剂盒设置了至少10个凹槽用于放置所述提取单元的提取试剂A瓶11、提取试剂B瓶12、提取试剂C瓶13、提取试剂D瓶14、蛋白酶K瓶15和乙醇瓶16，所述提取试剂A瓶11有2个，所述所述提取试剂 B瓶12有2个、所述提取试剂C瓶13有2个、所述提取试剂D瓶14有2个。
[0068] 实施例3试剂盒的使用
[0069] 1、提取血液中的样本
[0070] (1)取一个加20μL蛋白酶K到1.5mL离心管中，加入血液样品，加200μL 的提取试剂A，涡旋震荡15s；
[0071] (2)将步骤(1)混合物56℃温育10min，直到裂解完全并快速离心；
[0072] (3)加200μL乙醇(100％)，涡旋15s，快速离心；
[0073] (3)转移混合液到DNA收集管，6000g或8000rpm，离心1min，换新管，弃掉旧的收集管；
[0074] (4)加500μL提取试剂B，涡旋15s，6000g或8000rpm，离心1min，弃旧管换新管；
[0075] (5)加500μL提取试剂C，涡旋15s，全速(20000g或14，000rpm)离心 1min，换新管，全速(20000g或14000rpm)空管离心3min；
[0076] (6)100μL提取剂D温室孵育5min，6000g或8000rpm，离心1min。
[0077] 2、PCR反应
[0078] 反应体系：将各反应物质按照如下反应体系进行配比：模板DNA取80-100ng 提取的DNA、EGFR第20号外显子引物各1μL、酶混合物12.5μL、灭菌去离子水补至25μL。
[0079] 反应条件：将反应体系中各物质在中混合，按照如下程序反应：95℃5min，1个循环；95℃30s→60℃30s→72℃40s，35个循环；72℃7min 1个循环→4℃保温。
[0080] 3、纯化鉴定
[0081] (1)每个PCR管加入50μL 100％乙醇，震荡混匀，室温避光放置15min， 12000g，4℃离心30min；
[0082] (2)用移液枪吸尽上清，每管加入70μL 70％乙醇，12000g，4℃离心15min；
[0083] (3)用移液枪吸尽上清，室温挥发净酒精，加入溶解DNA，溶解后的样品需要在95℃变性4min，迅速置冰中冷却4min后，上样电泳；
[0084] 4、产物测序
[0085] 使用ABI公司试剂进行测序反应，结果如图2和图3所示；
[0086] 从图2和图3可以看出，与正常样品相比，突变样品箭头指示处的碱基存在突变，可见，本发明试剂盒可以准确的检测EGFR外显子基因突变。
[0087] 综上所述，本试剂盒添加了提取单元，能够检测的同时提取，无需再单独进行提取，方便快捷，且在检测病人血液样品EGFR基因第20外显子突变时具有敏感性高、特异性强、耗时短等优点。
[0088] 申请人声明，本实用新型通过上述实施例来说明本实用新型的详细结构特征，但本实用新型并不局限于上述详细结构特征，即不意味着本实用新型必须依赖上述详细结构特征才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本实用新型的任何改进，对本实用新型所选用部件的等效替换以及辅助部件的增加、具体方式的选择等，均落在本实用新型的保护范围和公开范围之内。
[0089] 以上详细描述了本实用新型的优选实施方式，但是，本实用新型并不限于上述实施方式中的具体细节，在本实用新型的技术构思范围内，可以对本实用新型的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本实用新型的保护范围。
[0090] 另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本实用新型对各种可能的组合方式不再另行说明。
[0091] 此外，本实用新型的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本实用新型的思想，其同样应当视为本实用新型所公开的内容。
