本发明涉及一种通过利用微生物发酵来生产外多糖的方法。更特 别地是，本发明涉及一种在含有至少一种碳源和至少一种有机氮源的 营养培养基中通过微生物发酵来生产外多糖的方法，其中所述碳源能 被所述微生物同化，所述有机氮源来源于蛋白质含量高的豆科植物。 在本申请的上下文中，术语外多糖表示由微生物产生的多糖。 高分子量的外多糖愈来愈多地用于数目众多的工业应用当中，这 些应用利用了这些外多糖在水性培养基中具有增稠、粘滞化、乳化、 稳定的特性。因此，由于黄原酸胶具有不寻常的流变特性，所以黄原 酸胶被用于以下不同的领域中：建筑业、绘画、造纸、纺织业、化妆 品、食品、农业、水处理、钻井、油回收等。 这些外多糖具有高分子量，最常见的是大于1×106g/mol(通过 凝胶渗透测定)，这些多糖由葡萄糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖、葡 糖醛酸、甘露糖醛酸、古洛糖醛酸这些单位形成，任选地与乙酸酯和 丙酮酸酯衍生物共同形成。这些多糖的特定结构以及特性被记载在例 如Whistler的《工业树胶的加工(Work Industrial Gums)》，第2 版中的XXI-XXIII章中(1973)。 所述多糖利于在水性营养培养基中通过微生物的需氧培养来生 产。 黄原酸胶可通过黄单胞菌属(Xanthomonas)的细菌来产生。同类 型的外多糖可以通过许多不同的微生物来生产，这些微生物包括土壤 杆菌属(Agrobacterium)、节杆菌属(Arthrobacter)、产碱杆菌属 (Alcaligenes)(琥珀酰聚糖)、假单胞菌属(Pseudomonas)(果聚糖)、 根瘤菌属(Rhizobium)、小核菌属(Sclerotium)(小核菌聚糖)中大部 分已知的微生物。 水性营养培养基除了含有各种生长元素外，通常含有碳源和氮源。 在工业发酵过程中，同时根据可利用性，成本和获得高产率的能力来 选择碳源和/或氮源。 在某些工业中，例如食品或化妆品工业，还需要附加的条件限制。 在这些领域中，选择的碳源和氮源还必须能够获得满足感官、感觉和 视觉条件需要的外多糖。 在常规使用的碳源和/或氮源中，找到能够同时满足上述所有条件 的碳源或氮源并不是一件容易的事。 例如，在微生物不能耗尽全部氮源的情况下，不可溶的残余产物 在发酵结束时仍然残留，这些残余物质一方面有利于污染菌株的生长， 另一方面在可能进行的灭菌和净化热处理过程中具有将外多糖着色的 危险，其中所述污染菌株在分离外多糖前能够降解未发酵的果汁。在 某些发酵过程中，建议使用酶来克服这一缺陷。其它发酵过程采用过 滤和/或离心步骤来克服这一缺陷。无论采用哪种方法，发酵结束后不 可溶的残余产物的去除都将导致生产成本的增加。 某些碳源和/或氮源具有显著延长发酵周期的缺点，发酵周期的延 长尤其容易导致污染，结果在分离外多糖前使得未发酵的果汁降解而 给生产造成损失。 如果要得到一种具有良好感官、感觉和视觉特性的外多糖，氮源 的性质是相当重要的。氮源的性质也决定外多糖的高产率。 已经发现来源于某些豆科植物如角豆的种子成分的某些氮源在微 生物发酵中是具有特别意义的有机氮源。这些成分被证明能够满足上 述所有的条件。 在来源于角豆的成分中，那些具有高蛋白含量的成分能产生特殊 意义的结果，尤其是在产率方面。以如上所述的“标准培养基”，例 如Whistler的《工业树胶的加工(Work Industrial Gums)》，第2 版中的XXI-XXIII章中(1973)中记载的培养基，作为对照发酵的培 养基，产率为0.3-0.4g/(kg.h)；以角豆来源成分作为发酵培养基， 产率大于0.4g/(kg.h)。 本发明的目的在于提供一种通过微生物发酵生产外多糖的简单和 经济的方法。 本发明的另一个目的在于提供一种通过避免上述污染问题的微生 物发酵生产外多糖的方法。 因此，本发明涉及一种通过微生物发酵生产外多糖的方法，其特 征在于所述发酵是在含有至少一种可被所述微生物同化的碳源和至少 一种来源于角豆成分的有机氮源的营养培养基中进行。 其它特别是与氮源选择有关的优点是发酵时间的缩短，发酵结束 时不可溶残余产物的抑制以及产率的提高。 另外，该方法使得得到的外多糖具有良好的感官、感觉和视觉特 性。 而且，通过该方法获得的外多糖仍然保留流变性质甚至该流变性 质在某些情况下还得到改进。 本发明的方法能够用于通过微生物发酵进行的任何外多糖的生 产。众多的微生物如细菌、酵母、真菌、藻类能够产生外多糖。还可 以包括以下微生物及其它： ·属于黄单胞菌属的细菌，更具体地是在《Bergey的食品细菌学 手册(Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology)》(第 8版-1974-Williams N.Wilkins Co.Baltimore)中记载的菌种如秋海 棠黄单胞菌(Xanthomonas begoniae)、野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)、胡萝卜黄单胞菌(Xanthomonas carotae)、常春藤黄 单胞菌(Xanthomonas hederae)、紫罗兰黄单胞菌(Xanthomonas incanae)、锦葵黄单胞菌(Xanthomonas malvacearum)、栖罂粟黄单 胞菌(Xanthomonas papavericola)、菜豆黄单胞菌(Xanthomonas phaseoli)、豌豆黄单胞菌(Xanthomonas pisi)、维管束黄单胞菌 (Xanthomonas vasculorum)、疱病黄单胞菌(Xanthomonas vesicatoria)、葡萄蔓黄单胞菌(Xanthomonas vitians)、天竺葵黄 单胞菌(Xanthomonas pelargonii)； ·属于节杆菌属(Arthrobacter)的细菌，更具体地是稳定节杆菌 (Arthrobacter stabilis)、粘节杆菌(Arthrobacter viscosus)； ·属于欧文氏杆菌属(Erwininia)的细菌； ·属于固氮杆菌属(Azotobacter)的细菌，更具体地是印度固氮杆 菌(Azotobacter indicus)这种菌种； ·属于土壤杆菌属(Agrobacterium)的细菌，更具体地是放射形土 壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)、发根病土壤杆菌 (Agrobacterium rhizogenes)、根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)； ·属于产碱杆菌属(Alcaligenes)的细菌，更具体地是粪产碱杆菌 (Alcaligenes faecalis)； ·属于假单胞菌属(Pseudomonas)的细菌，更具体地是甲烷假单胞 菌(Pseudomonas methanica)； ·属于棒状杆菌属(Corynebacterium)的细菌； ·属于芽孢杆菌属(Bacillus)的细菌，更具体地是多粘芽孢杆菌 (Bacillus polymyxa)； ·属于小核菌属(Sclerotium)的真菌，更具体地是Sclerotium glucanicum、齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)或Plectania occidentalis； ·属于曲霉属(Aspergillus)的真菌，更具体地是分解乌头酸曲霉 (Aspergillus itaconicus)、金色土曲霉(Aspergillus terreus)这 两种菌种； ·属于汉逊氏酵母属(Hansenula)的酵母菌，更具体地是碎囊汉逊 氏酵母(Hansenula capsulata)。 优选地，所述微生物是一种黄单胞菌属的细菌，更具体地是野油 菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)。 本发明主要涉及一种通过微生物发酵生产外多糖的方法，其特征 在于所述发酵是在一种含有至少一种可被所述微生物同化的碳源和至 少一种来源于角豆成分的有机氮源的营养培养基中进行。 角豆产生由豆荚和豆这两部分组成的果实。角豆，更具体地是角 豆的胚乳成分已经被广泛地开发成称作“角豆胶”的物质。与这种胚 乳成分密切相关的是胚芽，它是在分离角豆胶的过程中大量获得的副 产物。 在角豆的不同成分中，发现所有那些蛋白含量高的成分特别适用 于本发明的方法。 因此，角豆成分有利地具有至少45％的蛋白含量，优选地具有至 少50％的蛋白含量，更优选地具有至少60％的蛋白含量，其中所述百分 含量基于的是与干物质的干重。 所述的蛋白含量是通过测量在950℃下于氧气中燃烧释放的氮来 计算得出并通过在氦流中的电导率来测定。所用设备为LECO FP 428。 形成这些蛋白质的必需氨基酸的量与非必需氨基酸的量一样多。 本发明的一个具体技术方案包括采用角豆的成分，该角豆的蛋白 质有利地具有高含量的精氨酸、谷氨酰胺和/或谷氨酸以及赖氨酸。 在这一具体的技术方案中，精氨酸的含量有利地是9-20％，优选 地是在12-14％之间，其中百分含量基于的是氨基酸的总重量。 同样，谷氨酰胺和/或谷氨酸的含量有利地是在18-30％之间，优 选地是在22-27％之间，其中百分含量基于的是氨基酸的总重量。 赖氨酸的含量有利地是在18-30％之间，优选地是在12-14％之间， 其中百分含量基于的是氨基酸的总重量。 氨基酸的含量是通过对本技术领域技术人员来说常规和已知的方 法来测定的。 除了所述蛋白质外，所述成分同样还可含有脂类。通过在含有来 源于含有脂类之角豆成分的至少一种有机氮源的营养培养基中进行微 生物发酵而产生的所述外多糖，在感官、视觉和感觉方面的特性得到 了显著的改善。这些脂类同样抑制了预培养阶段中的泡沫形成。 有利地是，所述成分中的脂类含量至少为4％，优选地至少为5％， 甚至更优选地是在7至15％之间变化，其中所述的百分含量表示脂类 的重量与干物质重量之比。 脂类含量被降到总干物质的含量。在Soxhlet萃取器中通过采用 己烷进行萃取来测定。按照如下方式进行操作： -准确地称取大约10g，也可以是E克的角豆胚芽粉，将其装进 萃取器的料筒中，采用脱脂棉塞密封该料筒； -将150ml的己烷倒进250ml的圆底烧瓶中，该圆底烧瓶预先 称了瓶重(P0)； -将混合物萃取大约6小时； -利用旋转蒸发器将溶剂蒸发掉并且在150℃的烤箱中将剩余物 干燥1小时； -在干燥器中冷却后，称量含有剩余物的圆底烧瓶的重量，即P1 克。 脂肪物质也即脂类的含量通过以下公式计算： 脂肪物质的含量(％)＝100×(P1-P0)/E 这些脂类中存在的特征化合物当中，尤其要提到棕榈酸、硬脂酸、 油酸和亚油酸。 所述的角豆成分除了含有蛋白质和脂类外，还可以含有碳水化合 物。 根据本发明的一个特定技术方案，所述成分是角豆的胚芽。 在这个技术方案中，采用已知的常规方法，使所述成分首先释放 出它的胚乳成份。 所使用的角豆成分优选地是一种粉的形式。该粉通过常规的碾磨 技术如在以下类型的磨粉机中碾磨来得到： -平均分析粒度100目类型的圆筒磨粉机，也就是说含有至多1％ (质量)大于80目的颗粒和至多10％(质量)小于200目的颗粒的粉； -用于制备分析粒度更细的粉的针式磨粉机(pin mills)： o 200目类型，即一种不含大于80目的颗粒和含有至多60％(质 量)小于200目的颗粒的粉，和 o 175目类型，即一种含有至多1％(质量)大于80目的颗粒和至 多75％(质量)小于200目的颗粒的粉。 所述粉可以直接使用或通过利用合适的酶如碱性、酸性和/或中性 蛋白酶；脂酶；肌醇六磷酸酶；碱性、酸性和/或中性磷酸酶；淀粉酶 处理后使用。所述的酶处理通过已知的常规方法来进行。 所述粉的分析粒度可以在10和150微米之间波动。对于经过处 理的，该分析粒度更具体地是20至60微米，优选地是30至50微米。 借助由Malvern Instruments S.A.销售的MALVERN粒度分析仪， 通过激光粒度分析技术可以进行粒度测量分析。 同样可以想象出角豆成分本身的用途，即在分离了小板形式的胚 乳、或者甚至水性预分散液或预悬浮液形式的胚乳后的用途。 尽管本发明只被记载用于角豆，同样本发明也可以应用于其它的 豆科植物如瓜尔豆、肉桂、蒲公英(tara)。这些豆科植物只是用来 进行说明的而不起任何限定作用。 在本发明的另一个特定技术方案中，采用有机和无机氮源进行发 酵。 对于这种情况，无机氮源可以选自硝酸铵或硝酸钠、磷酸铵或硫 酸铵、硫酸镁、硫酸钾或硫酸钠，或以各种混合物的形式使用。 发酵培养基中的有机和任选的无机氮源浓度在1至80g/l之间， 优选地在3至50g/l之间，更优选地在5至30g/l之间。 发酵培养基同时还含有一种可被所述微生物同化的碳源。 作为培养基的基本碳源，可以使用葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、 海藻糖、甘露糖、蜜二糖(melobiose)、棉子糖、麦芽三糖、麦芽糖、 乳糖、乳果糖、甲基-β-吡喃半乳糖苷、甲基-α-吡喃半乳糖苷、纤维 二糖、龙胆二糖(gentobiose)、甲基-β-D-吡喃葡糖苷、甲基-α-D- 吡喃葡糖苷、七叶苷、核糖、阿拉伯糖、木糖、巴糖(palatinose)、 鼠李糖、岩藻糖、松三糖、D(+)阿糖醇、L(-)阿糖醇、木糖醇、 半乳糖醇、塔格糖、甘油、肌醇、甘露糖醇、麦芽糖醇、松二糖、山 梨醇、阿东糖醇、来苏糖、赤藓醇，优选地使用水解淀粉、淀粉水解 液，这些糖的混合物，以及至少含有这些糖中的一种糖的混合物。葡 萄糖和蔗糖是优选的糖。 可被同化的碳源的浓度在1至100g/l之间，优选地在15至80g/l 之间。 另外所述培养基还可含有微量元素如微量的矿盐以及维生素，核 苷酸和/或其它常规的添加剂如pH调节剂和消泡剂，其中所述的矿盐 是，例如硫酸盐、铁氯化物、氯化钙、氯化锰、氯化镁、氯化钠、氯 化钾、氯化镍、氯化钴、氯化锌或它们的混合物。 本发明通过微生物发酵生产外多糖的方法可以任选地在有酶存在 的条件下进行，其中所述酶例如是碱性、酸性和/或中性蛋白酶；多糖 酶；酰胺酶；肽酶，淀粉葡糖苷酶，磷酸酶；肌醇六磷酸酶。 然而，本发明的方法的一个重要优势在于可以在没有酶存在的条 件下进行发酵。令人非常惊奇地发现，在没有酶存在的条件下，所述 发酵方法的时间和产率都没有受到影响。另外，酶的抑制不影响不溶 性和未溶解的剩余产物在发酵结束时的积累，而剩余产物的积累会使 得培养基有利于污染菌株生长，该污染菌株在分离外多糖前能够降解 未发酵果汁。 所述微生物的纯培养可以按照常规方式进行。作为微生物领域的 技术人员能够进行条件的选择，具体地说进行培养温度和时间以及所 述微生物的维持培养基性质的选择。 为了保存所述微生物，优选地是要提供至少一个预培养步骤。预 培养应被理解为一种包括使细菌菌株生长和繁殖而没有外多糖产生的 步骤。 按照已知方式将所述微生物本身的接种物或所述微生物的中间培 养物接种到培养基中。 发酵可以在0至4巴之间的压力下进行。 所述发酵可以在15至100℃，优选地25至80℃，更优选地25 至35℃的温度下进行。 发酵培养基的pH可以是5至9，优选地6至8。可以根据情况， 利用碱如氢氧化钠、氢氧化钾或氨水，或者利用酸如硫酸、磷酸、盐 酸或硝酸来调节pH。 装在罐或发酵管道中的发酵培养基可以有利地进行搅拌和通气。 所述搅拌可以通过利用例如往复式搅拌器、回转式搅拌器，一种或多 种搅拌移动体或鼓泡柱来进行。 发酵时间通常是30个小时以上，一般是40至100小时。 产率以每千克未发酵果汁、每小时发酵产生的外多糖克数来表示。 采用本发明的方法，发现到产率提高了3至15％，优选地提高了5至 10％。 完成发酵后，可以从未发酵的果汁中回收外多糖并且按照已知方 法如过滤、浓缩、结晶或通过溶剂萃取来进行纯化。 本发明还包括通过本发明的方法获得的或能够获得的外多糖。特 别是包括由本发明的方法生产的黄原酸胶。 采用本发明的方法获得的黄原酸胶在1％的蒸馏水水溶液中具有高 透明度，即70至95％的等级或者甚至是80至95％的等级。所述水溶 液的透明度采用分光光度计在600nm下来测定。 下列实施例是为了说明本发明而不是限制本发明。 实施例 实施例1 该实施例描述了田野黄单胞菌的预培养阶段1和2。 预培养1： 预培养基的组成： 酵母抽提物 3g/l Oxoid 麦芽抽提物 3g/l Oxoid 大豆蛋白胨 5g/l Oxoid 蔗糖 1-10g/l Eurosucre pH用硫酸调到7 用饮用水适量至1升。 所有组分被溶解到1升的饮用水中，采用磁力搅拌器进行匀浆并 以112ml的份量分别分装到500ml的锥形瓶中。 所配制的培养基在120℃下高压蒸气灭菌30分钟。 所述菌株最初是以冷冻在-196℃下的试管的形式保藏，采用的是 液氮蒸汽冷冻的方法。 对于液氮冷冻这种情况，预培养是在含有下列组分的特定培养基 中进行： 麦芽抽提物 3g (从Oxoid获得) 酵母抽提物 3g (Oxoid) 大豆蛋白胨 5g (Oxoid) 葡萄糖 10g (从Oxoid获得) 泉水适量至1升。 为了配制培养基，将所有组分分散到泉水中。pH用10％的硫酸调 到6.5。所配制的培养基在高压锅中于120℃下灭菌20分钟。 回转搅拌器以220rpm和50mm的幅度进行搅拌，于28℃下培养 24小时后，将10％(体积)无菌的纯甘油添加到培养物中。然后将所 述培养物分装到容量为1ml至10ml，优选地为2ml至4ml的冷冻 试管中。 将这些试管保存在液氮蒸汽中。 用预先在空气中融解的冷冻试管接种预培养基1。所有或50％的冷 冻试管样品被无菌接种到500ml的锥形瓶中，该锥形中的培养基已按 照上述方法进行了高压灭菌。 将以这种方式接种的培养基在28℃下，通过回转搅拌器以220rpm 和50mm的幅度进行搅拌下培养24小时。 培养24小时后，我们获得了pH为7至7.5，粘度为50至500mPa.s 并且田野黄单胞菌的细菌量大于1010/ml的预培养物。 预培养2： 预培养物1被用来接种预培养基2。 预培养物2的培养基的组成： 蔗糖 10g/l Eurosucre 角豆胚芽粉 4g/l Meyhall AG Na2HPO4 3g/l Europhos 饮用水或软化水适量至1升 灭菌前用10％的硫酸将pH调到6.5。 所有组分被悬浮在1升的饮用水中并将pH调到6.5。将完全培养 基以112ml的份量分别分装到500ml的锥形瓶中并在120℃下高压 灭菌30分钟。 然后将这些锥形瓶接种上0.1ml至0.2ml的预培养物1。将这 些锥形瓶在28℃下，通过回转搅拌器以220rpm和50mm的幅度进行 搅拌下培养24至30小时。 培养24至30小时后，我们获得了pH为5.8至7.1，粘度为100至 1000mPa.s并且田野黄单胞菌的细菌量大于109/ml的预培养物。 实施例3 该实施例描述了按照两种发酵方式制备和获得外多糖，其中一种 方式是采用有机氮源，另外一种方式是采用混合的有机氮源和无机氮 源。 在该实施例中，包括了两个“预培养”步骤。这些步骤在500ml 锥形瓶中的100ml培养基(实施例1和2)中进行。 生产步骤是在20升发酵罐中进行的，其中15升是有利的，所述 生产步骤对应于细菌菌株产生多糖过程中的步骤。 预培养步骤1和2： 预培养步骤1和2以与实施例1和2相同的方式进行。 生产步骤： 培养基1： 最后的步骤是产生外多糖的步骤。 发酵罐1的培养基具有以下组成： 蔗糖 42g Eurosucre 角豆胚芽粉 6g Meyhall AG MgSO4.7H2O 0.25g Bittersalz Na2HPO4 2g Prolabo 有机消泡剂 0.5ml 饮用水或软化水适量至1升 分别制备含氮和碳水化合物的营养源。 营养源将合适克数的葡萄糖溶解在Mariotte锥形瓶中的qsp 3 l的软化水或饮用水中。用10％的硫酸将pH调低到5.2。Mariotte锥 形瓶中的所述溶液在120℃下高压灭菌45分钟。 角豆胚芽粉+盐将合适克数的角豆胚芽粉、30g的Na2HPO4、3.75 g的MgSO4.7H2O和7.5ml的消泡剂溶解在qsp 7l的软化水中。用 10％的硫酸将pH调到6。该混合物在120℃下原位灭菌45分钟。 1N的氢氧化钠40g的氢氧化钠颗粒被溶解在qsp 1l的蒸馏 水中。将所述溶液于Mariotte锥形瓶中在120℃下高压灭菌30分钟。 当所有组分的温度为28℃时，将它们在发酵罐中进行混合。然后 在该发酵罐中接种上合适量的预培养物2。 该发酵罐的发酵条件如下所述： 搅拌从0到20小时这一阶段为200rpm，然后为400rpm直到 发酵结束。 通气从0到18小时这一阶段为400l/h，然后从24小时直到 发酵结束为825l/h。 温度被调到28℃。 用1N的氢氧化钠将pH调到6.8。 压力为大气压。 培养基2： 可以作为培养基1的取代物的培养基2具有以下组成： 蔗糖 42g/l (Eurosucre) NH4NO3 1.15g/l (Atochem) MgSO4.7H2O 0.25g/l (Bittersalz) (NH4)2HPO4 0.217g/l (Europhos) 可溶解的角豆胚芽粉 36g/l (Meyhall AG) 有机消泡剂 0.2ml 软化水适量至1升 营养源将合适克数的葡萄糖溶解在大约3 l的软化水中。用 10％的硫酸将pH调低到5。在Mariotte锥形瓶中将所述溶液在120℃ 下高压灭菌30分钟。 氮+盐将17.25g的NH4NO3、3.75g的MgSO4.7H2O、3.22g的 (NH4)2HPO4、525克的可溶性角豆胚芽粉和3ml的消泡剂溶解在qsp 7 l的软化水中。用10％的硫酸将溶液的pH调到6。该混合物在120℃ 下原位灭菌45分钟。 1N的氢氧化钠40g的氢氧化钠颗粒被溶解在大约1 l的蒸馏 水中。在Mariotte锥形瓶中将所述溶液在120℃下高压灭菌30分钟。 所述可溶性的角豆胚芽粉是通过用软化水将粉稀释到6至15％来 制备的。该溶液可以不进行处理或在倾析前用碱性、酸性和/或中性蛋 白酶类的酶；脂酶；肌醇六磷酸酶；碱性、酸性和/或中性磷酸酶；淀 粉酶进行处理；如果需要，用一个水平旋转倾析器去除可能影响终产 物质量的杂质。 当所有组分的温度为28℃时，将它们在发酵罐(培养基1或2) 中进行混合。然后在该发酵罐中接种上合适量的预培养物2。 发酵罐2的发酵条件如下所述： 搅拌从0到20小时这一阶段为200rpm，然后为400rpm直到 发酵结束。 通气从0到24小时这一阶段为400l/h，然后从24小时直到 发酵结束为825l/h。 温度被调到28℃。 用1N的氢氧化钠将pH调到6.8。 压力为大气压或者压力范围为0.5至4巴。 发酵结果： 根据所研究的培养基，发酵时间的变化范围为45至65小时，可 被异丙醇沉淀的干物质的变化范围为20至30g/kg，并且基于碳源以 重量计的产率为50至70％。所获得的未发酵果汁具有一定的明亮度， 而对于采用其它任何氮源所获得的未发酵果汁从来没有观察到此现 象。