[0001] 本发明属于分析化学领域，具体涉及一种二硫化钼调制铁单原子的仿生纳米酶及其制备方法与应用。

[0002] 近年来，单原子纳米酶在分析化学以及电池能源催化领域得到了很大的重视及发展。单原子纳米酶相比于传统的纳米酶，具有原子利用率高、活性位点分散和结构易于调控等优点，其中，铁基单原子纳米酶的活性较高并有望取代贵金属纳米酶。目前，大多数单原子纳米酶具有与天然细胞色素P450类似的Fe‑Nx中心结构，虽然其取得了良好的催化活性，但是对于底物的选择性以及类酶活性的可重复性较低。在自然界中，亚硫酸盐氧化酶是一类广泛存在于动植物和真核细胞中的蛋白酶，参与将亚硫酸转化为硫酸盐的过程。在动物及高等植物体内，研究人员发现亚硫酸盐氧化酶还具有过氧化物酶活性，这是由于这一类的亚硫酸盐氧化酶具有双活性因子：含有Fe‑N4结构的血红素b5和含有Mo‑O‑S2结构的钼辅因子Moco。

[0003] 乙酰胆碱酯酶是一种特异性催化乙酰胆碱的强大水解酶，在各种器官和中枢与外周神经系统中都有表达，同时，乙酰胆碱酯酶作为一种常用的生物标志物，在农药中毒、肝脏疾病及老年痴呆等研究领域发挥着重要作用。乙酰胆碱酯酶不仅参与生物的呼吸和运动系统，对哺乳动物的高级大脑功能也至关重要，如学习和记忆等。一些环境化学物质，如有机磷(OP)和氨基甲酸酯农药，会针对性结合在乙酰胆碱酯酶的催化三联体位点，从而抑制该酶，造成永久性的神经损伤甚至生物体死亡。基于此，乙酰胆碱酯酶可在体外参与构建生物传感器，通过抑制效应检测环境中的农药残留。相比于目前农药残留检测使用的常规方法：气相色谱法、高效液相、色谱法与色谱‑质谱联用法等，基于乙酰胆碱酯酶开发的传感器具有高灵敏度、高选择性、操作简单、检测速度快及成本低等优势。随着对乙酰胆碱酯酶的深入研究，其许多潜在功能逐渐被人们发现并加以应用，特别是在临床新药的研发上。其中包括新开发的天然胆碱酯酶抑制剂，如加兰他敏、石杉碱甲等，这些天然生物碱可充当胆碱酯酶可逆抑制剂，并参与神经系统疾病、泌尿系统和免疫系统疾病的辅助治疗。因此，基于乙酰胆碱酯酶的生物传感器也在新药的评估和测试领域起到了不可或缺的作用。

[0004] 此外，生物传感器的信号输出方法一般分比色法、荧光法、电化学法和色谱法等，其中比色法对仪器的依赖程度低、操作简单并且分析速度快。然而，面对实际复杂的检测环境，对于比色传感器的要求进一步提高，紫外可见分光光度计无法满足日常实时的检测需要，因此纸基比色传感器凭借以下优点获得了广阔的应用前景：

[0005] 1.低成本，纸张作为传感器的基底材料具有低成本、易获取的特点，可以大规模制备，降低传感器的成本。

[0006] 2.灵活性，纸张具有良好的柔韧性和可塑性，可以方便地进行加工和制备，适用于各种形状和尺寸的传感器设计。

[0007] 3.生物相容性，纸张作为传感器基底具有良好的生物相容性，可以用于生物传感器的制备，实现对生物分子的检测。

[0008] 4.环保可持续，纸张作为可再生资源，制备纸基传感器具有较低的环境影响，符合可持续发展的要求。

[0080] 以下结合附图和技术方案，进一步说明本发明的具体实施方式。

[0081] 实施例1：利用二硫化钼调制铁单原子的仿生纳米酶FeN5‑MoS2的制备。

[0082] (1)在搅拌下将5mL硝酸(65wt％)加入含有1克(NH4)6Mo7O24·4H2O的20mL水溶液中，随后将上述溶液转移到50mL内衬特氟纶的高压釜反应，反应温度为180℃，反应时间为20小时，离心洗涤产物，干燥后得MoO3；

[0083] (2)MoO3分散于体积比为9:1的去离子水和乙醇的混合溶液，将50mM NH4Fe(SO4)2·12H2O溶液缓慢注入20mM MoO3溶液中，NH4Fe(SO4)2·12H2O溶液与MoO3溶液的体积比为1:1.25，然后将混合物转移到70℃水浴中3小时，冷却后通过离心洗涤获得MoO3@FeOOH；

[0084] (3)将3mL 25％氨水加入20mL含100mg MoO3@FeOOH的水溶液中，在室温下搅拌悬浮液3小时，洗涤干燥后得HoMoO3@FeOOH；

[0085] (4)在搅拌下将含有70mg六氯三聚膦睛(HCCP)和158mg双酚硫(BPS)的10mL甲醇溶液逐滴加入到含有50mg HoMoO3@FeOOH的40mL甲醇溶液中，随后滴入三乙胺(TEA)，三乙胺溶于甲醇溶液中的浓度为1.7mM，室温反应12小时，离心洗涤后真空干燥12小时获得HoMoO3@FeOOH@PZS；

[0086] (5)将收集到的HoMoO3@FeOOH@PZS在管式炉中煅烧2小时，煅烧加热速率为2℃‑1min ，煅烧温度为750℃，然后将碳化黑粉分散在0.5M盐酸溶液中，搅拌12小时后离心洗涤获得FeN5‑MoS2。

[0087] 本发明利用限域合成法，通过PZS限制铁和钼元素的扩散，经过酸洗后得到单层二硫化钼和FeN5单原子。其合成步骤见图1。

[0088] FeN5‑MoS2材料的透射电子显微镜图见图2，图2显示出材料形貌为无明显颗粒的空心纳米棒。

[0089] FeN5‑MoS2材料的球差矫正的高角环形暗场扫描透射电子显微镜图像见图3，图3显示出测量到0.25nm晶格间距，对应于二硫化钼的(102)晶面。此外，还观察了孤立的亮点(黄色圆圈突出)，显示铁以单原子的形式分散。

[0090] FeN5‑MoS2材料的X射线衍射图谱见图4，图4证明二硫化钼的晶体结构为宽间距薄层，铁掺杂在无定形碳中。

[0091] FeN5‑MoS2材料的元素分布图见图5，图5显示出由于PZS的限制作用，各个元素在高温热解条件下分布均匀。

[0092] FeN5‑MoS2材料中Mo和Fe的质量分数分别为4.03％和0.28％。

[0093] FeN5‑MoS2材料各元素的X射线光电子图谱见图6和图7，其中铁的价态介于+2和+3价之间，钼的价态主要以+4价为主，与硫元素结合的二硫化钼以1T相的形式存在。

[0094] FeN5‑MoS2材料的同步辐射结果见图8。图8显示出Fe主要与N进行配位，配位数为5，Mo主要与S进行配位，配位数为2，证明了二硫化钼调制铁单原子的仿生纳米酶FeN5‑MoS2的活性中心结构。

[0095] 基于密度泛函理论对材料的反应自由能计算见图9，图9表明二硫化钼的引入可以为FeN5活性中心提供更多电子，加速H2O2的分解和终产物水的脱吸附。

[0096] FeN5‑MoS2材料的电荷密度差分图像见图10，图10展现出与天然酶类似，二硫化钼充当电子供体，FeN5作为电子受体。

[0097] 实施例2：FeN5‑MoS2的类过氧化物酶活性探究。

[0098] 首先，将3μL 10mM 3,3'，5,5'‑四甲基联苯胺(TMB)和3μL 50mM H2O2依次加入288μ‑1L醋酸‑醋酸钠缓冲液(20mM，pH 4.0)中。然后将6μL 1mg mL FeN5‑MoS2加入溶液中并均匀混合。在室温下孵育10分钟后，离心溶液，将上清液输送至紫外‑可见光谱仪中，记录吸收光谱。

[0099] FeN5‑MoS2材料的类过氧化物酶活性见图11，图11反映出材料主要以过氧化物酶活性为主。

[0100] 实施例3：FeN5‑MoS2的类过氧化物酶活性最佳条件探究。

[0101] 将3μL 10mM 3,3'，5,5'‑四甲基联苯胺(TMB)和3μL 50mM H2O2依次加入288μL缓冲液中。然后将6μL FeN5‑MoS2加入溶液中并均匀混合。孵育10分钟后，离心溶液，将上清液输送至紫外‑可见光谱仪中，记录吸收光谱。通过改变缓冲液pH、孵育温度、FeN5‑MoS2浓度来进行类过氧化物酶活性最佳条件探究。

[0102] FeN5‑MoS2的类过氧化物酶活性最佳条件见图12，图12反映出最佳催化条件为pH＝‑14，孵育温度为25℃，FeN5‑MoS2材料终浓度为20μg mL 。

[0103] 实施例4：FeN5‑MoS2的稳态动力学研究。

[0104] 首先，将3μL 10mM 3,3'，5,5'‑四甲基联苯胺(TMB)和3μL 50mM H2O2依次加入288μ‑1L醋酸‑醋酸钠缓冲液(20mM，pH 4.0)中。然后将6μL 1mg mL FeN5‑MoS2加入溶液中并均匀混合。在室温下孵育10分钟后，离心溶液，将上清液输送至紫外‑可见光谱仪中，记录吸收光谱。通过改变H2O2(5、10、20、50、100、250和500μM)或TMB(5、10、25、50、75、100、200和400μM)的浓度来进行FeN5‑MoS2的稳态动力学研究。

[0105] FeN5‑MoS2的稳态动力学参数见图13，图13反映出材料对于底物具有较好亲和力，同时催化速率也较高。

[0106] 实施例5：在构建生物传感器之前，对乙酰胆碱酯酶进行了定量检测。

[0107] 首先，将3μL 30mM乙酰胆碱加入15μL含有不同浓度乙酰胆碱酯酶的磷酸盐缓冲液中，并立即混合溶液。然后，将混合物在37℃下孵育30分钟以备测量。随后，向测量溶液中加‑1入270μL醋酸‑醋酸钠缓冲液、3μL 10mM TMB、3μL 50mM H2O2和6μL 1mg mL FeN5‑MoS2。最后，将所得溶液在室温下保存10分钟，并记录溶液在652nm处的紫外吸光度。

[0108] 乙酰胆碱酯酶的检测见图14，图14得出乙酰胆碱酯酶的最低检测限为0.045mU ‑1 ‑1mL ，线性检测范围为1‑75mU mL 。

[0109] 实施例6：乙酰胆碱酯酶检测系统抗干扰能力。

[0110] 将3μL 30mM乙酰胆碱加入15μL含有不同浓度干扰物质(木瓜蛋白酶、溶菌酶、葡萄2+ +
糖氧化酶、胰蛋白酶、谷氨酸、丝氨酸、牛血清白蛋白、Ca 、K)的磷酸盐缓冲液中，并立即混合溶液。其中，干扰物质是乙酰胆碱酯酶浓度的50‑100倍。然后，将混合物在37℃下孵育30分钟以备测量。随后，向测量溶液中加入270μL醋酸‑醋酸钠缓冲液、3μL10mM TMB、3μL 50mM ‑1
H2O2和6μL 1mg mL FeN5‑MoS2。最后，将所得溶液在室温下保存10分钟，并记录溶液在652nm处的紫外吸光度。

[0111] 乙酰胆碱酯酶检测系统抗干扰能力见图15，由图15可以看出含有乙酰胆碱酯酶的溶液颜色和含有其他干扰物质的溶液有明显区别，紫外吸收峰信号强度明显降低，展现出良好的抗干扰能力，特异性好。

[0112] 实施例7：FeN5‑MoS2应用于啶虫脒的检测和天然生物碱的区分。

[0113] (1)加入30μL农药或生物碱和15μL 200mU mL‑1乙酰胆碱酯酶，37℃下孵育15min；

[0114] 其中，所述生物碱包括：溴新斯的明neostigmine、盐酸小檗碱berberine、毒扁豆碱physostigmine、苦参碱、吴茱萸碱，通过溴新斯的明作为阳性对照组来评估天然生物碱(盐酸小檗碱、毒扁豆碱、苦参碱、吴茱萸碱)的最大抑制率，此时，待测物质需加入30μL 1mmol不同的生物碱；

[0115] (2)向体系中加入乙酰胆碱，37℃下孵育30min；

[0116] (3)向体系中加入240μL(pH＝4)的醋酸‑醋酸钠缓冲液、3μL 10mM的3,3’,5,5’‑四‑1甲基联苯胺(TMB)、3μL 50mMH2O2和6μL 1mg mL 的FeN5‑MoS2纳米酶材料，37℃下孵育
10min；

[0117] (4)按步骤(1)至步骤(3)，但不加入待测目标化合物制备不含有待检目标化合物的溶液A；按照步骤(1)至步骤(3)，但同时不加入待测目标化合物和乙酰胆碱制备溶液B；

[0118] (5)使用紫外分光光度计记录步骤(3)中的溶液在652nm处的吸光度值，记为Ai；记录步骤(4)中的溶液A和B在652nm处的吸光度值，依次记为A和A0；

[0119] 根据测得数据，依据公式抑制率(％)＝(Ai‑A)/(A0‑A)×100，绘制拟合曲线。

[0120] 啶虫脒(acetamiprid)检测见图16，由图可得啶虫脒的检测限为6ng mL‑1，线性范‑1围为0.01‑100μg mL 。对生物碱的区分见图17，可以看出对于不同的生物碱，乙酰胆碱酯酶和FeN5‑MoS2构建的传感器检测出不同的半抑制浓度IC50。

[0121] 实施例8：FeN5‑MoS2在纸基比色传感器检测啶虫脒中的应用。

[0122] (1)将滤纸片裁剪成直径1cm大小的圆片，在20μg mL‑1FeN5‑MoS2乙醇溶液中浸泡1min；

[0123] (2)将浸泡过的滤纸片烘干，得到纸基比色传感器；

[0124] (3)将15μL含有200mU mL‑1的乙酰胆碱酯酶和不同浓度的啶虫脒在37℃下孵育10min，随后加入5μL的4mM的乙酰胆碱，在37℃下孵育30min后将上述混合物滴到纸基比色传感器上，37℃再次孵育30min；

[0125] (4)将含2mM TMB和10mM H2O2的30μL醋酸‑醋酸钠缓冲液滴到纸基比色传感器上，等待10min显色；

[0126] (5)使用手机拍照，通过微信小程序进行比色。

[0127] FeN5‑MoS2在纸基比色传感器检测啶虫脒中的应用见图18，其检测限为52ng mL‑1，‑1线性范围为0.1‑100μg mL ，能够满足实际条件简单环境中对啶虫脒的灵敏度检测。

[0128] 以上只通过说明的方式描述了本发明的某些示范性实施例，毋庸置疑，对于本领域的普通技术人员，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以用各种不同的方式对所描述的实施例进行修正。因此，上述附图和描述在本质上是说明性的，不应理解为对本发明权利要求保护范围的限制。