[0001] 本发明涉及污染修复技术领域，更具体地，涉及一种固定化菌剂及其在降解丁基黄原酸盐和苯甲羟肟酸污染中的应用。

[0002] 浮选作为矿石加工处理中最为有效且应用广泛的一种方法，该过程中不可避免地涉及到浮选药剂的使用。这类药剂在浮选时无法被完全使用，大部分仍会残留在水体之中，而浮选废水常未经处理便排放到周围环境当中，造成污染现象频发。

[0003] 其中，丁基黄原酸盐(BuX)和苯甲羟肟酸(BHA)是典型的两种浮选捕收剂，这类药剂通过调节矿物表面性质，从而将有价值的矿石从无价值的矿物中分离出来，达到浮选分离的目的。

[0004] 浮选过程中为提高目标金属回收率，常会过量添加这些药剂，但实际使用过程中仅需消耗部分药剂，多余的则会随浮选废水排出。现有的废水处理技术无法完全去除水体中高浓度的浮选药剂，导致选矿厂所排放的废水中BuX和BHA含量很高。水体中高浓度的BuX和BHA会引发水体恶臭、COD含量提高等问题，即便处于极低浓度水平，其存在也会对水生生物产生极大危害，如影响水生生物胚胎发育、使得鱼类畸形、抑制藻类生长等。受BuX和BHA污染的水体排放至环境中后会进一步污染周围河流，并被下游居民用于农业灌溉，对农业安全生产造成严重威胁。BuX和BHA也会影响人体健康。

[0005] 已有研究大多通过物理、化学方法对其进行去除，但从成本、环保、可再生性等方面综合考虑，生物修复的方法更为经济有效、生态友好。目前未有研究报道过微生物对BuX、BHA复合污染现象的修复。鉴于实际污染环境的复杂性，降解菌对污染物的降解效果极易受不良环境条件的影响而大大降低，因此如何提高降解菌对污染水体中BuX和BHA的生物利用度以提高功能微生物的修复效果，从而有效地修复BuX和BHA复合污染，对于保障农业安全生产以及人类健康都具有重要意义。

[0088] 下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

[0089] 丁基黄原酸盐(Butyl xanthate，BuX)，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司(Aladdin)，纯度>95％；苯甲羟肟酸(Benzohydroxamic acid,BHA)，购自美国Sigma‑Aldrich公司，纯度>99％；色谱级甲醇购自美国Sigma‑Aldrich公司；盐酸购自广州化学试剂有限公司，纯度为分析纯；其余试剂均为分析纯，购自天津大茂化学试剂公司。

[0090] 液体基础盐培养基(MSM)：K2HPO4 1.5g/L，KH2PO4 0.5g/L，(NH4)2SO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L和NaCl 1.0g/L，pH值约为7.0。

[0091] LB肉汤培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L和氯化钠5g/L，pH值约为7.0。

[0092] 营养琼脂培养基：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L，琼脂15g/L，pH值约为7.0。

[0093] 本研究用于分离降解菌的土壤样品取自广州韶关大宝山矿区。

[0094] 实施例1菌株的富集与分离纯化

[0095] 一、实验方法

[0096] 在250mL锥形瓶中装入100mL MSM培养基进行灭菌处理，待其冷却后分别加入BuX或BHA，使其初始浓度均达到10mg/L。向其中加入5g采集到的矿区(广州韶关大宝山矿区)污染土壤后，于35℃、150rpm的摇床中避光培养7d。培养至第7d时，以10％的接种量转接至新的MSM培养基中，逐步增加污染物浓度进行驯化，连续转接5次。

[0097] 取最后一次培养液均匀涂布在营养琼脂平板上，恒温培养48h后，挑取菌落反复进行划线，直至得到单菌落。将单菌接种至加有100mg/L BHA或BuX的MSM培养基中，摇床35℃、150rpm培养72h，检测其降解效果，并将菌株接种到试管斜面培养基中，于4℃冰箱中保存待用。

[0098] 二、实验结果

[0099] 经梯度驯化之后筛选到了一株能以BuX为唯一碳源的菌株，命名为W50，另一株能以BHA为唯一碳源的菌株则命名为HY21。两株菌能在短时间内分别实现对初始浓度为100mg/L的BuX或BHA的完全降解。

[0100] 实施例2菌株形态特征鉴定

[0101] 一、观察菌落特征

[0102] 1、实验方法

[0103] 将实施例1筛选到的菌株W50和HY21分别接种至营养琼脂平板上，倒置于35℃的培养箱中过夜培养，观察菌株的形状、大小、透明度、边缘及颜色等。

[0104] 2、实验结果

[0105] 过夜培养后观察两株菌的菌落形态，在营养琼脂平板上菌株W50呈圆形、淡黄色、半透明、表面光滑、中间凸起、质地粘稠(图1中的A)；菌株HY21呈现出乳白色、不规则、不透明、表面粗糙(图1中的B)。

[0106] 二、SEM观察菌体形态

[0107] 1、实验方法

[0108] 将菌株W50和HY21分别接种于LB肉汤培养基中培养，取培养至24h后的菌液800μL至1.5mL离心管中，8000rpm离心5min后弃去上清液。得到的菌体沉淀用无菌生理盐水进行洗涤，离心弃去上清，重复此操作3次。清洗过的菌体中加入1mL 2.5％戊二醛电镜固定液，涡旋混匀，于4℃冰箱中静置过夜。固定处理后经8000rpm离心5min，弃去上清液，收集菌体并用无菌生理盐水洗涤3次。随后进行梯度脱水，即分别加入30％、50％、70％、80％和90％的乙醇各一次，100％乙醇两次，每一次脱水处理都需静置15min，最后一次脱水处理后将菌体滴在盖玻片上放入冷冻干燥机中冻干，干燥后的样品经喷金处理后上机观察。

[0109] 2、实验结果

[0110] 利用SEM观察到菌株W50呈长杆状(1.5～3.0×0.5μm)，表面较为光滑(图2中的A)；菌株HY21呈短杆状(0.8～2.0×0.5μm)，表面粗糙(图2中的B)。

[0111] 三、菌株生理生化鉴定

[0112] 1、实验方法

[0113] 菌株W50和HY21的生理生化实验参考《常见细菌鉴定手册》和《Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology》进行。

[0114] 2、实验结果

[0115] 革兰氏染色结果显示两株菌均为革兰氏阴性菌，其中菌株W50甲基红试验、硝酸盐还原、淀粉水解、脲酶产生、硫化氢、乙酰甲基甲醇试验均为阴性，接触酶、氧化反应、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶试验为阳性，菌株无法利用丙二酸盐、乳糖、葡萄糖(表1)；

[0116] 表1菌株W50生理生化特性

[0117]

[0118] 注：“+”表示可以利用或阳性；“‑”表示可表示不利用或阴性。

[0119] 菌株HY21甲基红试验、硝酸盐还原、接触酶、淀粉水解、硫化氢、乙酰甲基甲醇试验均为阴性，氧化反应、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶试验、脲酶产生为阳性，菌株无法利用乳糖、葡萄糖，但可以利用丙二酸盐(表2)。

[0120] 表2菌株HY21生理生化特性

[0121]

[0122] 四、菌株分子生物学鉴定

[0123] 1、实验方法

[0124] PCR扩增:利用细菌通用引物27F(5’‑AGAGTTTGATCCTGGCTCAG‑3’)和1492R(5’‑GGTTACCTTGTTACGACTT‑3’)分别对菌株W50和HY21的16SrDNA片段进行扩增。

[0125] PCR反应体系：Taq Mixture，12.5μL；ddH2O，9.5μL；27F，1μL；1492R，1μL；DNA模板，1μL，总反应体系为25μL。

[0126] PCR反应条件：95℃，初始预热5min；熔断94℃，45s，退火55℃，45s，延伸72℃，1min 15s，循环32次，最后72℃保持10min。PCR扩增结束后，经1.5％琼脂糖凝胶电泳，检测扩增片段的大小和特异性，并在凝胶成像系统中照相，并将PCR扩增产物交由上海生工公司纯化回收并测序。

[0127] 系统发育树的构建：经生工公司测序获得两株菌的16S rDNA序列，将其提交至GenBank数据库中，并利用BLAST进行比对分析，利用ClustalX软件对匹配度高的相关序列进行同源性分析。采用MEGA 11.0软件中的邻接法(Neighborhood‑joining)进行关系分析，构建菌株的系统进化树。

[0128] 2、实验结果

[0129] 分别以菌株W50和菌株HY21的基因组DNA为模板，利用16S rDNA细菌通用引物对其进行PCR扩增，扩增后得到的产物电泳结果见图3，扩增产物送至上海生工生物科技有限公司进行纯化测序，分别得到16S rDNA测序结果，将分别将菌株W50和菌株HY21的16S rDNA测序结果提交到NCBI Genbank数据库中进行BLAST比对，利用BlAST对比分析结果中与目的菌株同源性较高的序列进行多序列联配，并通过邻接法(Neighborhood‑joining)分别构建了菌株W50和菌株HY21的系统发育树(图4和图5)。

[0130] 系统发育树结果显示，菌株W50的16S rDNA与Pseudomonas juntendi BML3NR 180457(Genbank登录号为：PP737842)同源性最高，且与该菌属(Pseudomonas)其它菌株也有较高的同源性，结合上述W50菌株生理生化鉴定结果，初步判断菌株W50属于假单胞菌属(Pseudomonas)；菌株HY21的16SrDNA与Cupriavidus basilensis strain N1129
(MN691130.1)同源性最高，且与该菌属(Cupriavidus)其它菌株也有较高的同源性，结合上述菌株HY21生理生化鉴定结果，初步判断菌株HY21属于贪铜菌属(Cupriavidus)

[0131] 将菌株W50和菌株HY21分别进行保藏：菌株W50命名为假单胞菌(Pseudomonas sp.)W50，于2024年7月31日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC NO.64924，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；菌株HY21命名为：贪铜菌(Cupriavidus sp.)HY21，并于2024年9月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏号为：GDMCC No：65117，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

[0132] 实施例3菌株HY21对BHA的降解效果

[0133] 一、实验方法

[0134] 在pH为5.5、温度为30.5℃、接菌量1.0(OD600，2％体积分数)降解条件下将菌悬液接种至50mL MSM培养基中。培养基中BHA浓度分别设置为50、100、150、200mg/L，将其放置于恒温振荡箱中150rpm振荡培养48h，待其降解至0、6、12、24、30、36、48h时取样，测定培养液中剩余的BHA的浓度。绘制菌株HY21对不同BHA初始浓度的降解动力学曲线。对照组未经接菌处理，每个处理组设置三个平行。

[0135] 检测BHA的浓度的方法为：

[0136] 1、样品前处理方法

[0137] 1mL待测培养液至1.5mL离心管中，8000rpm离心5min。取100μL上清液稀释100倍，溶剂为甲醇‑水(50/50，v/v)，最后经0.22μm微孔滤膜过滤，收集滤液至进样瓶中，使用LC‑MS/MS测定BHA含量。

[0138] 2、BHA的LC‑MS/MS检测方法

[0139] 利用AB Sciex 5500MD高效液相色谱‑串联质谱仪，建立了的LC‑MS/MS检测方法。

[0140] 色谱条件：色谱柱为Water Xbridge C18(3.0mm×50mm，5μm)；流动相A为水；流动相B为甲醇；柱流速为0.40mL/min；柱温为40℃；进样量为5μL；流动相梯度洗脱程序如下表3。

[0141] 表3流动相梯度洗脱程序

[0142]

[0143] 质谱条件：

[0144] 离子源：电喷雾离子源负离子(ESI‑)；电喷雾电压：‑4500V；雾化气温度：500℃；雾化气压力：55psi；辅助气压力：50psi；气帘气压力：35psi；碰撞器压力：6psi；扫描模式为：多重反应检测模式(MRM)。BHA的质谱参数见表4，其定量离子和定性离子色谱图如图4所示。

[0145] 表4

[0146]

[0147] 3、BHA标准曲线

[0148] 取10μL BHA标准溶液(1000mg/L)加至进样瓶中，用990μL色谱级甲醇进行稀释，从而获得浓度为10mg/L的BHA标准贮备液。按照梯度稀释法配制50、75、150、300、600、1200ng/mL的溶液，溶剂均为甲醇‑水(50/50，v/v)溶液。按照上文BHA的LC‑MS/MS检测方法，测定各浓度对应的峰面积，以测定的峰面积为Y，其对应的标准溶液浓度为X，绘制标准曲线“Y＝a+bX”。

[0149] 二、实验结果

[0150] BHA的定量离子(A)与定性离子(B)色谱图见图6。

[0151] 结果如图7所示，A图结果表明菌株HY21可以耐受50～200mg/L BHA浓度范围。目前已报道的一株克雷伯氏菌属BHA降解菌，经12d培养对初始浓度为100mg/L BHA的降解率仅达到85.04％(胡纯,王灿,龚文琪等.三种羟肟酸捕收剂的微生物降解研究[J].湖北农业科学,2013,52(11):2505‑2507)。与之相比菌株HY21能耐受更高浓度的BHA且对BHA的降解效率更高。

[0152] 实施例4菌株W50对BuX的降解效果

[0153] 一、实验方法

[0154] 向50mL已灭菌的MSM培养基中加入BuX，使其初始浓度分别达到100、300、500、700和1000mg/L，体系初始pH为7.0，接入2％ W50菌悬液(OD600＝1.0)，后将其置于35℃、150rpm恒温振荡器中避光培养12h。间隔2h取样测定BuX浓度，未接菌的处理作为空白对照，每组设置三个平行。

[0155] 检测BuX的浓度的方法为：

[0156] 1、样品前处理方法

[0157] 取1mL培养液至1.5mL离心管中，8000rpm离心5min。待离心结束后取300μL上清液稀释10倍得到待测溶液，立即用UV‑Vis测定BuX含量(以防止BuX降解)。

[0158] 2、BuX的检测方法

[0159] 测定待测溶液在301nm处的吸光值即可根据标准曲线算得溶液中BuX的含量。

[0160] 3、BuX标准曲线

[0161] 准确称取定量的BuX溶于纯水并定容于50mL，获得终浓度为1000mg/L的BuX标准储备液。将标准储备液逐级稀释，从而配制成浓度分别为0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、25.0mg/L的标曲溶液。通过测定各梯度的标曲溶液在301nm处的吸光值，以其为Y，对应的溶液浓度为X，制作标准曲线“Y＝a+bX”。

[0162] 二、实验结果

[0163] 结果显示如图8显示，菌株W50在BuX初始浓度为100～1000mg/L时均能在12h内将其完全降解，说明菌株W50能耐受极高浓度的BuX，且在降解过程当中未出现明显的滞后效应。浮选过程当中常会过量地添加BuX，使得其排出的浮选废水中BuX的含量很高，因此需要筛耐受高浓度BuX的菌株，而菌株HY21在高浓度的BuX废水中具有极好的应用前景。

[0164] 实施例5混合菌群的构建

[0165] 一、实验方法

[0166] 将实施例1分离得到的菌株W50和菌株HY21，通过十字交叉法在营养琼脂培养基上进行划线，划线后将培养基倒置放入35℃恒温培养箱中培养24h。观察交叉处菌株的生长情况，是否出现明显的抑菌圈。

[0167] 二、实验结果

[0168] 结果如图9所示，菌株W50和菌株HY21交叉划线结果显示，交叉处菌株生长状况良好，两菌株之间并未出现生长抑制现象，因此可以利用菌株W50和菌株HY21构建菌群。

[0169] 菌株W50和菌株HY21分别接种至LB培养基中过夜培养(150～180r/min，30～35℃培养12～24h)，待菌株生长至对数期时，4500rpm离心10min，获得菌体沉淀；菌体沉淀经无菌生理洗涤3次，用生理盐水重悬并调节OD600至1.0，以1:1(V/V)的比例混匀，即可得到混合菌群(即离菌群，FB)。

[0170] 实施例6单一或复合污染体系中菌群的降解效果

[0171] 一、实验方法

[0172] 分别配制只含有100mg/L BuX或BHA以及两者均包含的50mL MSM培养基，按2％体积比接入实施例5得到的混合菌群(即离菌群，FB)，将锥形瓶放入35℃、150rpm的恒温条件下振荡培养48h，间隔一定时间取样，测定不同时间点溶液中剩余BuX和BHA含量(方法同实施例3和4)。

[0173] 二、实验结果

[0174] 结果如图10显示，单一污染体系中混合菌群将初始浓度为100mg/L的BuX或BHA完全降解分别需要9h和30h，而复合体系中BuX和BHA全部降解所需时间有所延长，分别需要24h和48h。

[0175] 实施例7生物炭的制备及表征

[0176] 一、生物炭的制备

[0177] 将洗净且干燥好的玉米秸秆粉碎，制备成粉末后将其置于坩埚中，盖上坩埚盖，置于500℃马弗炉中，在氮气氛围下高温煅烧4h。煅烧后获得的生物炭还需经用0.1M HCl洗涤脱矿，再用去离子水洗涤，彻底去除残留的酸以及生物炭表面的灰分，最后将生物炭研磨成细粉末，过100目筛，121～130℃下灭菌20～30min，冷却至室温后，放置于干燥环境下备用。

[0178] 二、利用SEM对生物炭的表面进行扫描

[0179] 1、实验方法

[0180] 生物炭用无菌生理盐水进行洗涤，弃去上清，重复此操作3次。清洗过的菌剂中加入1mL 2.5％戊二醛电镜固定液，涡旋混匀，于4℃冰箱中静置20min。固定处理后弃去上清液，收集菌剂并用无菌生理盐水洗涤3次。随后进行梯度脱水，即分别加入浓度为30％、50％、70％、80％、90％(体积分数)的乙醇各一次，100％(体积分数)乙醇两次，每一次脱水处理都需静置15min，最后一次脱水处理后将菌体滴在盖玻片上放入冷冻干燥机中冻干，干燥后的样品经喷金处理后上机观察。

[0181] 2、实验结果

[0182] 通过SEM结果(图11)可以看到生物炭表面呈现出多孔结构，孔隙较大，且未发生明显的坍塌现象。这种结构特征能为微生物提供适合的生长环境，促使微生物在其表面定殖，也可增大生物炭的比表面积，为污染物吸附提供更多的活性位点。

[0183] 三、生物炭的FT‑IR扫描

[0184] 1、实验方法

[0185] 生物炭充分冷冻干燥后，加入适量的溴化钾粉末研磨混匀，压片后置于傅里叶红外光谱仪中，在4000～400cm‑1范围内进行扫描。

[0186] 2、实验结果

[0187] 生物炭的FT‑IR结果如12，在FT‑IR图中观察到多种官能团的红外吸收峰，如‑1 ‑1 ‑1 ‑13428cm (‑OH)、1576cm (‑C＝O)、1384cm (‑COOH)、以及1081cm (‑C‑O)，上述结果表明所制备的生物炭中含有丰富的含氧官能团，增加了生物炭吸附污染物的活性位点，并且可以为微生物提供营养物质，促进其生长和繁殖。

[0188] 实施例8固定化菌剂的制备及降解效果

[0189] 一、制备方法

[0190] 固定化菌剂(IB)的制备采用吸附‑包埋法，主要包括吸附、混匀和包埋，3个步骤：

[0191] 吸附：称取实施例7制备得到的生物炭0.5g装入锥形瓶，灭菌处理后待其冷却，将混匀的50mL混合菌群FB(实施例5得到的)倒入生物炭中，于35℃摇床中振荡吸附2h，作为吸附体系进行吸附；

[0192] 混匀：称取2g海藻酸钠溶于50mL水中，加热搅拌至其完全溶解后121℃灭菌20min。静置冷却至室温后，将吸附后的吸附体系倒入海藻酸钠溶液中，混合溶液置于磁力搅拌器上搅拌30min，使其充分混匀；

[0193] 包埋：混匀后的溶液使用注射器，匀速逐滴滴入0.02g/mL的CaCl2溶液中，进行包埋，得到固定化小球。包埋完毕后，固定化小球放入4℃冰箱中继续固化12h，12h后用无菌的生理盐水洗涤固定化小球3次，以除去其表面多余CaCl2；后续将固定化小球置于4℃冰箱保存，得到固定化菌剂。

[0194] 同时制备未添加细菌的固定化小球(SB)：即在吸附时直接将无菌生理盐水加入到生物炭中(代替实施例5得到的混合菌群FB)，其余步骤与固定化菌剂制备流程一致。

[0195] 二、固定化菌剂(IB)的表观特性

[0196] 1、实验方法

[0197] (1)、肉眼观察菌剂的形状，取部分菌剂称量其重量，并用游标卡尺测量菌剂的直径

[0198] (2)、传质效率测定：以10％比例将小球投加到10mL浓度为0.01％亚甲基蓝溶液中，放入30℃、150rpm恒温振荡器中振荡24h，观察固定化菌剂加入前后溶液在665nm处的吸光值变化

[0199] (3)、机械强度测定：在20mL纯水中加入10颗大小均匀的固定化菌剂，于220rpm/min震荡培养箱中振荡5d，观察菌剂的破裂情况。

[0200] 2、实验结果

[0201] 固定化菌剂成品如图13所示，其表观特性见表5。结果显示，固定化菌剂呈现规则球形，且具备高传质效率和机械强度。

[0202] 表5固定化菌剂的表观特性

[0203]

[0204] 三、SEM观察固定化菌剂(IB)表面形貌和内部结构

[0205] 1、实验方法

[0206] 对固定化菌剂(IB)用无菌生理盐水进行洗涤，弃去上清，重复此操作3次。清洗过的菌剂中加入1mL 2.5％戊二醛电镜固定液，涡旋混匀，于4℃冰箱中静置20min。固定处理后弃去上清液，收集菌剂并用无菌生理盐水洗涤3次。随后进行梯度脱水，即分别加入浓度为30％、50％、70％、80％、90％(体积分数)的乙醇各一次，100％(体积分数)乙醇两次，每一次脱水处理都需静置15min，最后一次脱水处理后将菌体滴在盖玻片上放入冷冻干燥机中冻干，干燥后的样品经喷金处理后上机观察，观察其表面形貌和内部结构。

[0207] 2、实验结果

[0208] 固定化菌剂的表面形貌特征如图14所示，其中，图A显示固定化菌剂的整体形态，呈现出规则的球形；图B为固定化菌剂的表面形貌，由于小球经乙醇梯度脱水后皱缩，其表面出现褶皱，但仍可以观察到大量的菌株被包埋在其中；图C和图D为通过对固定化菌剂横截面进行扫描从而观察其内部结构；在图C中可以看到小球内部存在大量蜂窝状孔洞，这种结构的存在可以提高载体的孔隙率和比表面积，降低扩散阻力，有利于氧气与营养物质的传输，为微生物的生长和代谢提供更好的微环境，进而加速其对污染物的降解；D图中观察到了大量细菌附着在载体内部的孔道中，这表明包埋的菌群在固定化载体中生长情况良好。

[0209] 四、FT‑IR分析固定化菌剂(IB)

[0210] 1、实验方法

[0211] 将未加菌群的固定化小球(SB)和固定化菌剂(IB)充分冷冻干燥后，分别与适量的1
溴化钾粉末研磨混匀，压片后置于傅里叶红外光谱仪中，在4000～400cm‑ 范围内进行扫描，得到FT‑IR图，分析其官能团的组成。

[0212] 2、实验结果

[0213] 由FT‑IR结果(图15)所示，3428cm‑1处的吸收峰是由O‑H伸缩振动产生的，生物炭与海藻酸钠结合后该峰的吸收强度增强，说明生物炭与海藻酸钠的‑OH基团之间产生了大量‑1的氢键。2972cm 处出现新峰归因于C‑H的伸缩振动，表明由于氢键形成的紧密连接，使生物‑1 ‑1
炭与海藻酸钠基质牢固地结合在一起。SB中1418cm 、1618cm 处的吸收峰为海藻酸钠的特‑1 ‑1
征峰，分别代表COO‑的对称和反对称拉伸振动，1081cm 和1034cm 则对应于海藻酸钠中‑C‑O的变形和‑C‑O‑C的振动。与IB相比，SB所具有的官能团在IB中均存在，且吸收峰的强度显著增强，这与材料复合过程中氢键的产生密切相关，说明材料结合良好。

[0214] 五、固定化菌剂(IB)对BuX和BHA的降解效果

[0215] 1、实验方法

[0216] 分别取制备得到的固定化菌剂(IB)2g和未包埋细菌的固定化小球(SB)2g，以及实施例5制备得到的游离菌群(FB)1mL，加入至50mL MSM培养基，培养基中BuX和BHA的浓度均为100mg/L，将其放置于35℃、150rpm摇床中振荡培养24h。待培养至12h和24h时取样，分别测定BuX和BHA的含量(方法同实施例3和4)，每组设置三个平行，对照组为不做接种处理且仅含100mg/L BuX和BHA的MSM培养基。

[0217] 2、实验结果

[0218] 结果如图16所示，污染物的降解速率由快到慢排序为：IB>FB>SB。IB组中100mg/L的BuX和BHA仅9h和30h便可完全降解，而FB组则需24h和48h才能分别将BuX和BHA全部降解，SB组48h的去除率分别仅有50.45％和22.25％。该结果表明固定化菌剂的制备显著提高菌群在复合污染体系中对BuX和BHA的降解速率。SB组污染物的浓度比CK组更低，也说明固定化材料对污染物存在一定的吸附作用。IB与SB两处理组相比较，表明IB中污染物浓度下降的原因主要以菌株的降解作用为主。

[0219] 实施例9海藻酸钠含量对固定化菌剂降解BuX和BHA效果的影响

[0220] 一、实验方法

[0221] 按照实施例1的方法制备固定化菌剂(IB)，具体方法如下：

[0222] 吸附：同实施例8；

[0223] 混匀：分别称取1g(即含量1％)、2g(即含量2％)、3g(即含量3％)和4g(即含量4％)海藻酸钠溶于50mL水中，加热搅拌至其完全溶解后121℃灭菌20min。静置冷却至室温后，将吸附后的吸附体系倒入海藻酸钠溶液中，混合溶液置于磁力搅拌器上搅拌30min，使其充分混匀；

[0224] 包埋：同实施例8。

[0225] 按照实施例6的方法制备检测得到的固定化菌剂对BuX和BHA的降解情况。

[0226] 二、实验结果

[0227] 在不同海藻酸钠含量下所制备的固定化菌剂其表观形态如图17所示，海藻酸钠含量为2％、3％、4％时所制备出的固定化小球均为规则的球形，但海藻酸钠含量增加会导致材料黏度增加，其制备难度也会随之上升，而海藻酸钠含量为1％时小球形状不规则，使用时极易破裂。

[0228] 根据图18中BuX和BHA的降解结果可知，海藻酸钠含量为1％和2％时，经12h培养对BuX的降解率均高于90％，反应至24h时即可降解80％以上的BHA。当海藻酸钠含量达到3％和4％时，BuX的降解率略有降低，分别为88.62％和88.99％，BHA降解率则显著降低至53.02％和49.14％。这表明海藻酸钠含量增加会导致固定化菌剂对两种污染物的降解效果变差，其原因可能是海藻酸钠含量增加造成小球的传质效率降低。

[0229] 因此，利用含量2％的海藻酸钠制备得到的固定化菌剂的表观形态和对污染物的降解效果最好。

[0230] 实施例9生物炭含量对固定化菌剂降解BuX和BHA效果的影响

[0231] 一、实验方法

[0232] 按照实施例8的方法制备固定化菌剂(IB)，具体方法如下：

[0233] 吸附：分别称取实施例7制备得到的生物炭0.5g(即含量0.5％)、1g(即含量1％)、1.5g(即含量1.5％)和2g(即含量2％)装入锥形瓶，灭菌处理后待其冷却，将混匀的50mL混合菌群FB(实施例5得到的)倒入生物炭中，再将锥形瓶放于35℃摇床中振荡吸附2h，作为吸附体系进行吸附；

[0234] 混匀：同实施例8；

[0235] 包埋：同实施例8。

[0236] 按照实施例6的方法制备检测得到的固定化菌剂对BuX和BHA的降解情况。

[0237] 二、实验结果

[0238] 不同生物炭含量的固定化菌剂其形态并无明显区别。

[0239] 从图19中可以看到，生物炭含量为0.5％时，BuX和BHA两种污染物的降解率均达到最高，分别为97.23％和96.32％。当生物炭含量超过0.5％时，污染物的降解率则显著下降。

[0240] 实施例9CaCl2浓度对固定化菌剂降解BuX和BHA效果的影响

[0241] 一、实验方法

[0242] 按照实施例8的方法制备固定化菌剂(IB)，具体方法如下：

[0243] 吸附：同实施例8；

[0244] 混匀：同实施例8；

[0245] 包埋：混匀后的溶液通过50mL注射器，分别匀速逐滴滴入0.02g/mL、0.03g/mL、0.04g/mL和0.05g/mL的CaCl2溶液中，进行包埋，得到固定化小球。包埋完毕后，固定化小球放入4℃冰箱中继续固化12h，12h后用无菌的生理盐水洗涤固定化小球3次，以除去其表面多余CaCl2；后续将固定化小球置于4℃冰箱保存，得到固定化菌剂。

[0246] 按照实施例6的方法制备检测得到的固定化菌剂对BuX和BHA的降解情况。

[0247] 二、实验结果

[0248] 结果如图20所示，CaCl2浓度对BuX的降解影响不大，但会显著影响BHA的降解。CaCl2浓度升高，BuX的降解率分别为94.28％、96.05％、95.87％和85.02％，BHA的降解率分别为97.63％、55.02％、83.37％和47.56％。综合两种污染物的降解效果考虑，2g/ml的CaCl2浓度最为合适。

[0249] 实施例10强酸及强碱下固定化菌剂降解能力

[0250] 一、实验方法

[0251] 利用pH计分别将MSM培养基的pH准确调节至5和9，向分装好的MSM培养基中加入BuX和BHA，使两种污染物的浓度均达到100mg/L。

[0252] 分别向50mL MSM培养基中加入2％(体积比)实施例5制备得到的游离菌群(FB)、2g实施例8制备得到的固定化菌剂(IB)、2g实施例8制备得到的未加菌的固定化小球(SB)，接种后将锥形瓶置于35℃恒温条件下，150rpm振荡培养48h，反应至不同时间点时取样测定BuX和BHA的浓度，每一个处理组设置三个平行，空白组为不经接菌处理的MSM培养基(CK)。

[0253] 二、实验结果

[0254] 如图21所示，IB在强酸或强碱环境下均能实现对BuX和BHA的高效降解。pH为5时，IB组中BuX、BHA全部降解仅需6h和24h；当pH提高到9时，其降解时间分别为12h和0h。

[0255] FB组在强酸或强碱环境下，也均能实现对BuX和BHA的较高效降解，FB在pH为5时仅需9h和30h就可以将复合体系中的BuX和BHA完全降解；pH到9时，培养至24h和48h时BuX和BHA的降解率分别只有58.21％和23.22％。

[0256] SB组，pH为5或9，其在48h时BHA的去除率分别为25.78％和18.46％，与之相比24h时BuX的去除率相差较大，前者中的BuX完全去除，同一时间后者中BuX的去除率仅为39.39％。

[0257] 该结果表明经吸附‑包埋法制备得到的固定化菌剂，在生物炭‑海藻酸钠载体的保护作用下，其在不良pH环境中对BuX和BHA的去除能力得以显著提升。

[0258] 实施例11高温及低温下固定化菌剂降解能力

[0259] 一、实验方法

[0260] 别向50mL MSM培养基中加入2％(体积比)实施例5制备得到的游离菌群(FB)、2g实施例8制备得到的固定化菌剂(IB)、2g实施例8制备得到的未加菌的固定化小球(SB)，空白对照(CK)不接菌，降解体系初始pH为7，恒温摇床的温度分别设置为20℃和40℃，随后将锥形瓶置于其中，150rpm转速下反应48h，间隔一定时间取样，观察溶液中BuX和BHA的浓度变化。

[0261] 二、实验结果

[0262] 由图22可知，无论是高温或低温条件，IB组都是最先将BuX和BHA全部降解。

[0263] IB对BHA的降解在40℃或20℃时均只需30h；40℃时IB经6h便可将BuX全部降解。高温虽能加速BuX的分解，但与CK相比，可知该过程中还是菌株对BuX的降解作用为主。当温度降至20℃时，低温会抑制BuX的分解，但IB仍能在9h内达到反应终点。

[0264] 40℃条件下FB降解至24h和8h时，BuX和BHA的降解率分别为96.61％和70.35％。而20℃时，相同时间内BuX和BHA的降解率显著下降，仅有57.1％和8.6％。

[0265] 以上结果说明高温或低温条件均能对游离菌群的活性产生明显的抑制作用，而制备得到的固定化菌剂提高了菌群对温度的耐受性，在实际污染场地的修复应用中具有广阔的发展前景。

[0266] 实施例12重金属胁迫下固定化菌剂的降解能力

[0267] 一、实验方法

[0268] 向BuX和BHA浓度均为100mg/L的50ml MSM培养基中加入Cd2+，使其浓度达到5mg/L，体系的初始pH为7，再将2％(体积比)实施例5制备得到的游离菌群(FB)、2g实施例8制备得到的固定化菌剂(IB)、2g实施例8制备得到的未加菌的固定化小球(SB)分别接入其中，35℃、150rpm条件下反应48h，每组三个重复，空白对照组(CK)不做其它接种处理，定时取样，测定溶液中剩余的BuX和BHA含量。

[0269] 二、实验结果

[0270] 由图23可知，Cd2+胁迫下，固定化菌株对污染物的降解效果明显优于游离菌群。当2+
溶液中Cd 浓度达到5mg/L时，9h IB对BuX的降解率即可达到99％以上，同一时间FB组的降解率只有37.6％。这种差异在BHA降解中更为明显，IB在30h时即可将溶液中100mg/L的BHA全部降解，而FB培养至48h时仅仅只能降解28.8％的BHA。

[0271] 实施例13固定化菌剂的循环利用

[0272] 一、实验方法

[0273] 将BuX和BHA加入至50mL初始pH为7的MSM培养基中，BuX、BHA的终浓度为100mg/L。称取2g固定化菌剂加入其中，封装好的锥形瓶随即放入35℃恒温摇床中振荡培养48h，间隔取样，记录BuX、BHA浓度随时间的变化情况。48h后将固定化小球从培养液中分离出来，并用无菌生理盐水洗涤3次后转接至新的培养基中，按上述条件再次进行培养，多次重复利用直至固定化小球破裂。

[0274] 二、实验结果

[0275] 结果图24所示，多次重复使用导致固定化小球内部结构疏松，包埋的活细胞数量不断减少，且固定化材料的活性位点被占据，降低了其对污染物的吸附能力，因此循环次数增加时，固定化菌剂完全降解污染物所需的时间也会有所增加。多次回收利用后固定化小球的机械强度逐渐下降，直到第5次循环后固定化小球破裂。但经5次循环利用，固定化小球仍能在48h内将初始浓度为100mg/L BuX和BHA全部降解，说明固定化处理后的菌群更为稳定，具备良好的循环利用能力。

[0276] 实施例14固定化菌剂的储存稳定性

[0277] 一、实验方法

[0278] 将实施例8制备的得到的固定化菌剂在4℃冰箱中保存至第0、10、30、50、70和90d，之后在35℃、150rpm培养条件下，将其接入BuX和BHA初始浓度均为100mg/L的50mL MSM培养基中(pH＝7)，待其反应至24h和48h时取样分别测定BuX和BHA的含量。

[0279] 二、实验结果

[0280] 储存至一定时间后的固定化菌剂对BuX和BHA的降解效果如图25所示。新鲜制备的固定化菌剂对BuX和BHA的降解率可达100％，经4℃保存70d后，仍能保持98％以上的降解率。当储存时间达到90d时，BuX的降解率仍保持在98％以上，对BHA的降解率则降低至84.3％。该结果表明经吸附‑包埋法制备得到的固定化菌剂置于低温环境中，经长时间储存后仍可保持良好的微生物活性。

[0281] 实施例15固定化菌剂对于复合污染土壤的修复

[0282] 1、模拟污染土壤的制备

[0283] 将供试土壤一分为二，一份不做处理(S1)，另外一份土壤(S2)中加入Cd(NO3)2溶2+
液，使Cd 终浓度达到5mg/kg，土壤置于通风处老化一个月。再向其中加入BuX和BHA，分次缓慢加入，并充分搅拌混匀，使得两组土壤中BuX和BHA的浓度均达到50mg/kg。得到的复合污染土壤均需避光老化两周。

[0284] 2、复合污染土壤修复

[0285] 将老化后的两组污染土壤S1和S2均分为四等份，每份200g土壤并将其装入500mL的塑料盒中。向每组土壤中分别加入5％(w/w)实施例8制备得到的固定化菌剂(IB)、5％(w/w)实施例8制备得到的未接菌的固定化小球(SB)、5％(V/V)实施例5制备得到的游离菌群(FB)，最后一份中加5％无菌水作为空白对照(CK)，每个处理组设置三个平行。在复合污染土壤修复期间定时补充水分，使其含水率保持在20％左右，修复至第0、3、5、7、14d时取样，具体分组见下表6。

[0286] 表6复合污染土壤修复分组

[0287]

[0288] 实施例15固定化菌剂对于复合污染土壤中BuX的去除效果

[0289] 一、实验方法

[0290] 检测实施例14各样本的土壤的BuX含量，具体方法如下：

[0291] 为防止BuX分解，取样后需尽快取部分土壤冷冻干燥。准确称取10g干燥后的土壤至50mL离心管中，向其中加入4mL氨水‑甲醇溶液(30/70，v/v)，2500rpm振荡8min以达到充分提取的目的。振荡后8000rpm离心10min，将上清液转移至新的离心管中，沉淀按照上述步骤再次进行提取，两次离心后将上清液合并。向合并后的上清液中加入50mg C18净化剂，涡旋1min使其充分吸附杂质，再8000rpm离心10min，取上清液过0.22μm滤膜，并利用甲酸调节滤液pH至10.5左右，参考实施例4的方法检测BuX。

[0292] 二、实验结果

[0293] 结果如图26所示，由于BuX自身不稳定且其结构较为简单，容易被某些土著微生物利用，因此CK组中BuX含量也会逐渐下降。修复至14d时，S1和S2中CK组BuX含量分别为2+
25.95、29.18mg/kg。S2中BuX含量更高是由于Cd 会与BuX螯合，抑制了BuX的自然降解，同时还加剧了对土著微生物的毒害作用，干扰其对BuX的利用。

[0294] 修复至14d时，S1和S2的FB组BuX含量分别为10.82和20.54mg/kg。由此可知，游离2+
菌群的添加确实促进了土壤中BuX的降解，但Cd 的存在会显著抑制游离菌群对BuX的降解效果。而SB组虽不受复合污染的胁迫，修复至14d后对BuX吸附基本达到饱和，此时BuX去除率达到60％左右。

[0295] 与以上各组相比，添加固定化菌剂的IB组在S1和S2中均能高效去除土壤中的BuX，14d后IB组BuX的去除率均达到90％以上。该结果表明通过吸附‑包埋的方法制备得到的固定化菌剂显著缓解了污染物对菌群的毒性效应，增强了菌群对环境的耐受性，加快了菌群对污染物的去除速率。

[0296] 实施例15固定化菌剂对于复合污染土壤pH的影响

[0297] 一、实验方法

[0298] 检测实施例14各样本的土壤pH，具体方法为：取2g已风干的土壤于50mL离心管中，按1：2.5(w/v)的比例向其中加入5mL不含CO2的去离子水。密封后置于振荡器上180rpm振荡30min，静置45min后用pH计测定上清液pH值，三次测样后取其平均值即为土壤pH。

[0299] 二、实验结果

[0300] 图27可知，初始土壤pH为弱酸性，S1中FB修复至14d时的pH高于CK组。S2中由于Cd2+存在，污染物自身分解受限的同时，菌群对污染物的去除也受到抑制，此时FB与CK的pH并无显著差别。IB组和SB组的土壤pH在整个修复过程中均不断上升，也说明生物炭的碱性在一定程度也可以中和弱酸性土壤，从而提高其pH值。

[0301] 实施例16固定化菌剂对于复合污染土壤酶活的影响

[0302] 一、土样的前处理

[0303] 检测实施例14各样本取样后将部分样品风干，过200目筛以待测定其酶活。

[0304] 二、固定化菌剂对于复合污染土壤过氧化氢酶活性的影响

[0305] 1、实验方法

[0306] (1)构建过氧化氢酶活性标准曲线：分别取0、1、2、3、4、5mL 0.3％(v/v)H2O2溶液于50mL容量瓶中，加入5mL硫酸(1.5mol/L)，用去离子水定容至刻度线，再加入1mL饱和钾铝矾溶液，混匀后在240nm处测定溶液吸光值。

[0307] (2)取2g前处理后的土样于50mL离心管中，准确移取40mL去离子水和5mL 0.3％ H2O2溶液加入其中，振荡器上200rpm振荡20min，之后立刻向其中加入1mL饱和钾铝矾溶液，混匀后将其过滤至含有5mL硫酸(1.5mol/L)的锥形瓶中。

[0308] (3)利用UV‑Vis测定滤液的OD240nm。

[0309] 该实验需设置无土和无基质对照。

[0310] 2、实验结果

[0311] 结果如图28所示，S1组中土壤过氧化氢酶活在整个修复过程中大致呈现出先降后升的趋势。第3d时，酶活均有所降低，说明BuX和BHA对土壤过氧化氢酶活产生抑制。固定化菌剂中的两种降解菌需要时间适应新的环境，之后其可以利用土壤中的BuX和BHA作为碳源来源，促进自身生长繁殖的同时，还可降低环境中污染物的含量。因此，3d后FB组和IB组过氧化氢酶活不断升高，修复至14d时，过氧化氢酶活分别达到了2.14和2.47mg/g。其中IB组的酶活变化最为显著，与CK相比，IB组土壤过氧化氢酶活提高了33.36％。SB组过氧化氢酶活升高可能是由于固定化材料对污染物的吸附，削弱了污染物对土著微生物活性的影响，提高了土壤过氧化氢酶活。

[0312] 二、固定化菌剂对于复合污染土壤脲酶活性的影响

[0313] 1、实验方法

[0314] (1)构建脲酶活性标准曲线：准确移取浓度为0.1mg/mL的氨标准溶液0、1、3、5、7、9、11、13mL于50mL容量瓶中，加水至20mL。随后向其中加入4mL苯酚钠溶液和1.5mL次氯酸钠溶液，混匀并静置20min，待其显色后定容至刻度线，在60min内测定其在578nm处的吸光值。

[0315] (2)称取1g前处理后的土样于50mL锥形瓶中，添加0.2mL甲苯以去除微生物对结果的干扰。静置15min后向锥形瓶中加入4mL柠檬酸盐缓冲溶液(pH为6.7)和2mL 10％(W/W)尿素溶液，混匀并放入37℃、150rpm的恒温振荡器中振荡24h。培养过后将其过滤，吸取0.2mL滤液至10mL比色管中，再依次加入0.8mL苯酚钠溶液和0.6mL次氯酸钠溶液，显色20min后用水定容到10mL。

[0316] (3)在60min内于578nm波长处测定溶液吸光值，

[0317] 同时设置无土和无基质对照以消除土样中原有氨对结果的影响。

[0318] 2、实验结果

[0319] 结果如图29所示，修复至14d时，S1组中CK、SB、FB和IB的脲酶活性分别为0.19、2+
0.40、0.42和0.41mg/(g·h)，均能提高土壤脲酶活性。S2中因菌群受到Cd 胁迫，FB组的脲酶活性仅为0.20mg/(g·h)，此时IB组的脲酶活性达到0.33mg/(g·h)，该结果表明固定化菌剂的添加有助于提高土壤脲酶活性，催化尿素水解促进土壤氮循环，提高土壤肥力。

[0320] 实施例17固定化菌剂对于复合污染土壤细菌群落结构的影响

[0321] 一、实验方法

[0322] 收集实施例14处理至第14d的24个土壤样品，并将其送往广州基迪奥生物科技有限公司进行16S rRNA扩增子测序，使用特异性引物(341F:5’‑CCTACGGGNGGCWGCAG‑3’；806R:5’‑GGACTACHVGGGTATCTAAT‑3’)对细菌16S rRNA基因的V3‑V4区进行PCR扩增。扩增产物经提取、纯化后，使用广州基地奥生物科技有限公司Illumina平台进行测序。

[0323] 二、实验结果

[0324] 1、土壤细菌群落多样性变化

[0325] 基于16S rRNA测序结果，对修复至14d时各处理组土壤细菌群落的Alpha多样性进行分析，其结果如表7所示。

[0326] 表7细菌的Alpha多样性指数：

[0327]

[0328] 注：表格内的数据为3个平行样本的平均值±标准差，同一列数据末尾标注相同字母即表示差异不显著(P>0.05)。

[0329] 香农多样性指数(Shannon)：一个综合衡量物种丰富度和个体分布均匀度的指标，常用于评估生态系统的多样性；辛普森多样性指数(Simpson)：侧重于反映物种相对丰富度的多样性指数，常用于描述物种间个体数量的差异；Chao1：一种基于样本数据估计未观察到物种数的方法，适用于样本量较小或物种分布不均匀的情况；丰富度覆盖估计(Abundance‑based Coverage Estimator,ACE)：一种基于样本中物种的个体数量分布来估计整个群落物种总数的方法；覆盖度(Coverage)：指样本中观察到的物种占实际物种总数的比例，用于评估样本的代表性和调查的完整性。

[0330] Coverage指数代表测序深度，其数值均大于0.98，说明该测序结果可以反映样本中微生物的真实情况。

[0331] S2中CK组的Chao1和ACE指数高于S1的CK组，而Shannon和Simpson指数则是S1中的2+
CK组更高。表明Cd 的存在加剧了生物毒性，无法耐受重金属胁迫的菌株无法存活，土著微生物的多样性下降，同时优势菌株的丰度也得以提升。

[0332] S1中SB、FB组与CK组相比多样性降低，但其Chao1和ACE指数上升，说明游离菌群和固定化菌剂的添加可以提高细菌群落的丰度。

[0333] S2中FB组的各项指数上升，说明游离菌群能耐受一定浓度的重金属，添加游离菌群可刺激了土著微生物的活性，使其多样性和丰度上升。

[0334] 接种固定化菌剂的处理组，其各项指数在S1中与其他组相比均为最高，表明制备固定化菌剂的材料为微生物提供了一个更为稳定的生长环境，而且外来菌群的添加可刺激土著细菌的生长，由两者结合制备得到的固定化菌剂有助于增加土壤细菌群落的多样性和丰度。

[0335] 2、Beta多样性分析

[0336] Beta多样性分析是通过对不同处理组中的细菌群落组成进行比较，以各处理组之间的距离来描述物种组成结构的相似性，距离越近说明其组成结构越相似。图30是基于各处理组的OUT计算Bray‑Curtis距离并绘制的PcoA图，其显示S1中，SB、FB两组相距接近，但与其他组距离较远，说明这两种处理方式可以改变土著微生物的群落结构，但这两种方式2+
处理后的土壤中细菌群落结构相差不大。S2中CK、SB、FB三者均相互靠近，说明Cd 胁迫下，向复合污染土壤中添加游离菌群或固定化菌剂对其原有的细菌群落结构影响较小。而S1和S2中的IB组均与其他组保持较远的距离，说明固定化菌剂的添加使土壤细菌群落结构产生明显变化。

[0337] 3、土壤细菌群落丰度变化

[0338] (1)门水平上

[0339] 结果如图31所示。在门水平上，S1和S2中各处理组中的细菌组成基本一致，其优势菌门包括变形菌门(Proteobacteria，20.6～42.49％)、拟杆菌门(Bacteroidota，14.23～32.42％)、放线菌门(Actinobacteriota，7.93～16.73％)、绿弯菌门(Chloroflexi，8.95～
13.36％)、酸杆菌门(Acidobacteriota，5.89～9.66％)、厚壁菌门(Firmicutes，3.26～
10.66％)。各优势菌门在不同处理组的占比略有不同，其中变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidota)是最主要的两种优势菌门。

[0340] 拟杆菌门(Bacteroidota)在CK、FB组中占比最高，S1、S2的CK组中该菌门分别占比25.42、32.42％，FB中占比为27.68、26.98％。而S1、S2的IB组中该菌门占比分别下降至
14.23、17.81％，添加固定化菌剂的处理组中变形菌门(Proteobacteria)成为了最主要的优势菌门，其占比分别达到了31.82和42.49％，相较于CK组，该菌门的相对丰度分别提高了
54.24和71.74％。综合上述结果，认为变形菌门(Proteobacteria)在BuX和BHA降解过程中起到了关键作用，而固定化菌剂的添加能显著提高土壤中该菌门的相对丰度。

[0341] (2)属水平上

[0342] 图32显示了属水平上不同处理组的土壤细菌群落中各菌属的相对丰度，其优势菌属主要包括变形菌门(Proteobacteria)的鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas，9.71～15.96％)、贪铜菌属(Cupriavidus，0.15～10.01％)、沙壤土杆菌属(Ramlibacter，0.86～
3.46％)和假单胞菌属(Pseudomonas，0.06～9.22％)、拟杆菌门(Bacteroidota)的黄色土源菌属(Flavisolibacter，12.5～27.84％)、厚壁菌门(Firmicutes)的芽孢杆菌属(Bacillus，2.04～9.47％)、放线菌门(Actinobacteriota)的小单孢菌属
(Micromonospora，1.87～6.11％)和链霉菌属(Streptomyces，0.69～1.78％)。

[0343] 如图33所示，S1、S2的FB组中假单胞菌属(Pseudomonas)所占比例分别仅有0.18、0.17％。与之相比，IB组假单胞菌属(Pseudomonas)的相对丰度显著增加，其在S1、S2中分别占比2.07、9.22％，该结果说明固定化菌剂通过将微生物包埋在一定区域空间内的方式，可有效防止所包埋的微生物流失到外界环境中，并显著提高其丰度。S1中各细菌群落之间竞
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争激烈，导致假单胞菌属(Pseudomonas)相对丰度偏低，而S2中由于Cd 的毒害作用使那些无法耐受重金属胁迫的菌株丰度下降，假单胞菌属(Pseudomonas)凭借对Cd的高耐受性成为了优势菌属，其相对丰度也得以进一步提高。

[0344] 对相对丰度排名前9的菌属进行聚类分析，除固定化菌剂含有的菌所在菌属的相对丰度有所提高，固定化菌剂的添加还可刺激某些土著细菌的生长，提高这些菌属在土壤细菌群落中的相对丰度。

[0345] 与CK相比，IB组的贪铜菌属(Cupriavidus)、小单孢菌属(Micromonospora)、链霉菌属(Streptomyces)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)的丰度均有所上升，其中贪铜菌属(Cupriavidus)的丰度变化最为显著。研究表明贪铜菌属的菌株在含N‑杂环结构的污染物降解过程中具备良好的应用效果，由此推测该菌属丰度的增加可能是出于对土壤中BHA的降解利用。

[0346] 小单孢菌属(Micromonospora)、链霉菌属(Streptomyces)同属于放线菌门(Actinobacteriota)，而放线菌做为植物根际促生菌(PGPR)之一，其对植物的促生和对土壤肥力的改善已得到广泛证实。

[0347] 大多数鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)细菌对芳香族化合物具备优良的降解能力，此外，相关研究表明该菌属也是一种极具应用潜力的PGPR，其通过调节植物生理代谢、招募有益的根际细菌来促进植物生长。

[0348] 综上所述，固定化菌剂可削弱污染物对土著微生物的毒害效应，为有益细菌提供合适的生长环境，使其成为了土壤中的优势菌属，而有益细菌的富集在一定程度上可改善土壤环境质量。