[0001] 本发明属于高分子化学、生物材料及农业害虫防控技术领域，具体涉及一种基于树枝状聚酰胺胺的基因转染载体及其制备方法与应用。

[0002] 我国害虫防治工作面临抗药性、残留和食品安全等问题。利用双链RNA核酸分子(double‑stranded RNA,dsRNA)来防治害虫的策略，能够特异、高效地降低特定基因的表达，从而调控害虫的生长发育和危害行为，对害虫的高效、绿色防控具有重要意义。同时dsRNA杀虫分子可在环境中自然降解、不易使害虫产生抗药性的优点，是害虫绿色防控的理想来源之一。然而，对于多数害虫尤其是鳞翅目害虫，dsRNA被害虫细胞或组织吸收，抑制了dsRNA的杀虫效果，目前实验室常用注射的方式将dsRNA杀虫分子导入害虫体内，操作繁琐，对精密仪器和技术人员要求高，限制了dsRNA的市场化。

[0003] 近年来，纳米技术在农业领域呈现出巨大的应用潜力，其中利用纳米载体的靶向传输与控释功能，递送核酸药物dsRNA到昆虫体内，打破昆虫体内的器官基底膜、细胞膜的屏障和肠道围食膜屏障，促进细胞吸收外源核酸分子，提高外源核酸分子的作用效率。因此，基于纳米载体开发的核酸导入体系有望提升dsRNA杀虫分子的作用效率，简化dsRNA导入流程，助力该杀虫分子的市场化。

[0004] 树枝状聚合物分子内部存在着大量空腔、携带大量的表面官能团，能够广泛应用于生物医药领域，尤其是聚酰胺‑胺型树枝状聚合物因其高效安全低毒的特点已经在基因转染中被广泛研究和应用。为获得更好的转染效果和生物相容性，制备了基于树枝状聚合物表面化学共价修饰氟化物的基因转染载体。氟化物修饰基团可以起到稳定结合核酸物质，有效保护核酸物质并且促进载体/核酸药物复合物的细胞摄取，确保核酸药物复合物高效作用于细胞内靶标。因此，这类部分氟化物表面修饰的超支化聚合物具有高效转染、低细胞毒性、简易的合成方法及高产率等优点，建立氟化物表面修饰的超支化聚合物纳米载体递送外源核酸药物dsRNA的害虫防控体系尤为重要，对农药减量控害和害虫绿色防控技术的发展具有积极意义。

[0021] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，树枝状聚酰胺胺PAMAM(G0‑G4)从威海晨源分子新材料有限公司购买，所用原料均为市售商品。

[0022]   分子量 端NH2个数G0 517 4
G1 1430 8
G2 3256 16
G3 6909 32
G4 14215 64

[0023] 实施例1含七氟树枝状聚磺酰胺的制备

[0024] 树枝状聚酰胺胺PAMAM(G3)(0.3517g,0.05mmoL)与乙烯基磺酰氟(0.11g,1mmoL)在DMF溶液50℃反应合成含磺酰氟树枝状聚合物，最后再与七氟丁胺(0.1991g,1mmoL)在TBD为催化剂、EtOH为溶剂，50℃条件下通过磺酰氟点击聚合反应合成含氟树枝状聚酰胺胺1 19
(PAMAM*7F20)。对PAMAM*7F20进行核磁共振氢谱(H NMR)，氟谱( F NMR)，凝胶渗透色谱
1
(GPC)表征。H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ7.94(q,J＝7.6,5.5Hz,49H),3.11‑2.97(m,117H),
2.73‑2.58(m,174H),2.58‑2.47(m,157H),2.42(p,J＝5.4,4.5Hz,69H),2.19(t,J＝7.0Hz,
19
121H). F NMR(377MHz,D2O)δ‑80.71(s,3F),‑118.89(s,2F),‑128.19(s,2F)。数均分子量(Mn)为17649，分子量分布(PDI)为1.64。

[0025] 树枝状聚酰胺胺PAMAM(G3)(0.3517g,0.05mmoL)与乙烯基磺酰氟(0.1265g,1.15mmoL)在乙醇溶液50℃反应合成含磺酰氟树枝状聚合物，最后再与七氟丁胺(0.2289g,
1.15mmoL)在TBD为催化剂、EtOH为溶剂，50℃条件下通过磺酰氟点击聚合反应合成含氟树
1 19 1
枝状聚酰胺胺(PAMAM*7F23)。对PAMAM*7F23进行 H NMR， F NMR和GPC表征。H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ7.94(q,J＝7.6,5.5Hz,56H),3.11‑2.97(m,131H),2.73‑2.58(m,
19
196H),2.58‑2.47(m,176H),2.42(p,J＝5.4,4.5Hz,77H),2.19(t,J＝7.0Hz,136H). F NMR(377MHz,D2O)δ‑80.91(s,3F),‑118.91(s,2F),‑128.2(s,2F)。PAMAM*7F23的Mn为18409，PDI为1.53。

[0026] 树枝状聚酰胺胺PAMAM(G3)(0.3517g,0.05mmoL)与乙烯基磺酰氟(0.154g,1.4mmoL)在甲醇溶液50℃反应合成含磺酰氟树枝状聚合物，最后再与七氟丁胺(0.2787g,
1.4mmoL)在TBD为催化剂、EtOH为溶剂，50℃条件下通过磺酰氟点击聚合反应合成含氟树枝
1 19 1
状聚酰胺胺(PAMAM*7F28)。对PAMAM*7F28进行H NMR，F NMR和GPC表征。H NMR(400MHz,DMSO‑d6)δ7.94(q,J＝7.6,5.5Hz,62H),3.11‑2.97(m,146H),2.73‑2.58(m,218H),2.58‑
19
2.47(m,196H),2.42(q,J＝5.4,4.5Hz,86H),2.19(t,J＝7.0Hz,133H). F NMR(377MHz,D2O)δ‑80.92(s,3F),‑118.91(s,2F),‑128.21(s,2F)。PAMAM*7F28的Mn为19609，PDI为
1.88。

[0027] 实施例2载体携带dsRNA细胞水平和活体水平实验

[0028] 研究了实施例1合成的PAMAM‑7F系列携带dsRNA控虫分子进入细胞的情况。预先用红色荧光染料标记dsRNA以便后续通过荧光显微镜对dsRNA示踪。单独dsRNA害虫防治分子难以进入鳞翅目细胞，是导致鳞翅目昆虫RNAi效率低的重要机制。针对该机制，利用实施例1合成的PAMAM*7F系列与dsRNA核酸药物组装形成纳米载体/dsRNA复合体药物，构建dsRNA高效递送系统，在PAMAM，PAMAM*7F20和PAMAM*7F23的作用下，能够有效促进dsRNA进入鳞翅目害虫模式的Sf9细胞(图1)，单独的dsRNA分子作为对照组，不能进入Sf9细胞(图1,A和A’)。dsRNA分子可通过载体PAMAM，PAMAM*7F20和PAMAM*7F23的携带进入细胞(图1，B‑D,B’‑D’)，说明该系列树枝状聚合物具有一定的携带dsRNA核酸药物、促进核酸药物进入害虫细胞的能力；随着7F含量的增加，携带进入细胞能力越强(PAMAM*7F23>PAMAM*7F20>PAMAM)(图1E)，其中PAMAM*7F23最好，说明7F端基个数对运载基因能力有很大的影响。在利用PAMAM，PAMAM*7F20和PAMAM*7F23促进dsRNA分子进入鳞翅目细胞后，进一步利用3个载体和dsRNA沉默鳞翅目昆虫草地贪夜蛾Sf9细胞表达基因，并选取易于检测基因沉默效率的绿色荧光蛋白基因(Green Fluorescent Protein，GFP)为靶标基因，通过GFP荧光强度的下降程度来定量检测RNAi效率。单独的dsRNA干扰GFP后，绿色荧光24h内未下降(图2)，延长处理时间至72h仍未见绿色荧光明显下降，表明Sf9细胞内GFP基因正常表达，单独dsRNA分子处理Sf9害虫细胞，对靶标基因的RNAi效率低。利用PAMAM，PAMAM*7F20和PAMAM*7F23携带dsRNA后，24h发现绿色荧光蛋白大幅下降，表明3个载体能够大幅促进dsRNA对靶标基因GFP的沉默效果，延长处理时间至72h，绿色荧光强度仍然被有效降低至较低水平，表明通过3个载体携带dsRNA处理Sf9细胞后，对靶标基因的沉默效率高且持效期长(图2A)。分别在处理细胞后0h,24h，48h和72h GFP荧光强度来量化靶标基因GFP的沉默效率，通过不同纳米载体携带dsRNA干扰GFP基因导致细胞内GFP荧光下降程度(图2B)：单独dsRNA处理的对照组细胞GFP荧光较强，几乎未见下调。相反，添加3个纳米载体的处理组细胞GFP荧光发生了不同程度下调，其中，PAMAM*F23*dsRNA组细胞GFP荧光下调最多，这表明3个纳米载体均不仅能够递送核酸药物dsRNA进入昆虫细胞效率(图1)，而且能够有效提升靶标基因的沉默效率，而PAMAM*7F23纳米载体的提升效果最好(图2‑3)。

[0029] 在发现研究实施例1合成的PAMAM*7F23在细胞水平能够高效提升dsRNA入细胞效率和RNAi效率的基础上，进一步考察在活体水平PAMAM*7F23是否能够增强dsRNA的基因干扰效率和害虫防治水平。选取鳞翅目主要的水稻害虫二化螟的幼虫为试虫，将PAMAM*7F23/dsRNA复合物通过表面点滴的方法处理幼虫体表，24h后，用70％的乙醇和蒸馏水将幼虫各清洗三次，以去除虫体表面残存的PAMAM*7F23/dsRNA复合物。PAMAM*7F23/dsRNA复合物处理后幼虫体内可检测到dsRNA红色荧光信号(图3,B‑B’)，而dsRNA单独处理幼虫体内没有检测到dsRNA荧光信号(图3,A‑A’)；表明PAMAM*7F23显著提升dsRNA进入活体害虫体内。进一步研究了活体水平PAMAM*7F23载体对dsRNA沉默靶标基因和防治害虫的效果。选取二化螟幼虫生长发育关键基因表皮蛋白基因CsLCP16/17为靶标基因合成dsRNA害虫控制分子，利用PAMAM*7F23/dsRNA复合物处理害虫体表，对照组为：仅蒸馏水处理害虫体表、仅用抑制害虫生长发育的dsRNA分子处理害虫体表、仅用对害虫生长发育无害的dsEGFP分子处理害虫体表、仅用PAMAM*7F23纳米材料处理害虫体表、用PAMAM*7F23\dsEGFP复合体处理体表。处理组为PAMAM*7F23\dsRNA复合体处理体表。对照组二化螟幼虫均钻入水稻取食，大于20％的对照组害虫钻蛀水稻蛀食水稻，导致水稻茎秆空心甚至断裂(图3,C‑I)。相反，处理组PAMAM*7F23/dsRNA复合物二化螟害虫后，害虫全部失去钻柱水稻行为，水稻茎秆完好无损(图3，C和J)。本发明设计的PAMAM*7F23\dsRNA复合物在活体水平100％抑制了害虫对水稻的蛀蚀危害，有助于二化螟的绿色防控、保障粮食作物水稻安全生产。

[0030] 虽然，已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。