[0001] 本发明属于单克隆抗体技术领域，具体涉及一种分泌华支睾吸虫单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

[0002] 华支睾吸虫是一种重要的食源性人兽共患寄生虫，人因食用未经充分烹饪、含有华支睾吸虫感染性囊蚴的鱼虾而患病。囊蚴在十二指肠内脱去囊壁，随后在胆汁的趋化下，幼虫会迁移至肝脏和胆管内。幼虫移行过程中不仅会对胆管造成物理性损害，而且它们释放的代谢物质（排泄分泌抗原）还能激发肝胆管系统产生炎症反应。华支睾吸虫感染患者临床可能出现营养不足、腹泻、黄疸及肝硬化等症状，病情严重者甚至可能发展为胆管上皮癌。

[0003] 鉴于华支睾吸虫对公共卫生安全和人类健康造成的极大威胁与危害，国际癌症组织将华支睾吸虫列为I类生物性致癌因子，我国将其列入24种人畜共患病之一。目前华支睾吸虫检测仍然采用相对费时费力且灵敏性低的粪便镜检法，不仅需要专业人士操作，而且无法满足居民居家自检的需求。

[0004] 当前，针对华支睾吸虫虽已有诸如酶联免疫吸附法与免疫层析法等快速检测技术，但这些方法的精确度受限于疾病特异的抗原‑抗体反应。在血清学检测中，常用的抗原主要来源于华支睾吸虫的排泄分泌物及虫体本身。然而，这些抗原不仅成分复杂，还面临着制备过程繁琐、生产周期长、批次间质量差异大等问题。更为棘手的是，这两种抗原特异性差，极大地限制了这些检测手段的实际应用。

[0019] 实施例1.杂交瘤细胞的制备依据CSTR1的重复单元制备多肽（KLH‑GGKAPPPESA）用于小鼠免疫，多肽由生工生物工程（上海）股份有限公司制备。

[0020] （1）首次免疫：将制备好的KLH‑GGKAPPPESA（100 μg）与等量的弗式完全佐剂混合，超声至水乳结合状态，多点皮下注射小鼠200 μL/只。14天后进行第二次免疫，计量与一免相同，尽量避开第一次接种部位。再次间隔14天后进行第三次免疫，流程同上。第四次免疫时，不添加佐剂，采用腹腔注射，10天后采集血清以检测抗体效价。

[0021] （2）小鼠血清效价的测定：KLH‑GGKAPPPESA多肽作为ELISA包被抗原检测免疫小鼠的血清抗体效价，并设立未免疫的小鼠血清为阴性对照。最后以P/N>2.1的最大血清稀释度为小鼠的血清效价（表1）。

[0022] 表1 免疫小鼠血清效价检测

[0023] （3）细胞融合。从液氮中取出SP2/0细胞，迅速放入37℃水浴中溶融化，然后转移到生物安全柜内离心去除上清，用1 mL DMEM基础培养基重悬，转入培养瓶中。加入适量完全培养基，轻轻混匀后培养箱中培养。培养一天后离心去上清，计数后4℃保存。处死实验小鼠，用75%酒精消毒，剪开腹部暴露腹膜，将基础培养液注射至小鼠腹腔，反复按压腹腔后吸出液体至离心管中。离心后去除上清，底部为饲养层细胞，用20% HAT完全培养基吹散，200 μL/孔铺于96孔板培养。选择CSTR1四免后抗体效价高于1: 5 000的小鼠，眼球采血，分离血清，‑20℃保存备用。

[0024] 随后用75%乙醇对小鼠消毒，取出脾脏研磨。用无菌网筛过滤，并用基础培养基冲洗，收集冲洗液离心，沉淀为脾细胞，用基础培养基重悬，计数后备用。选取对数生长期的SP2/0细胞与脾细胞按1: 5混合，离心去上清，轻轻敲散离心管底部沉淀，放入37℃水浴，加入预热的PEG 4000（60秒内完成），轻微晃动离心管，静置30秒。随后加入预热的基础培养液终止。用20% HAT完全培养基重悬细胞，铺至96孔板，置于37℃、5% CO2培养箱中培养。分别在第4、8天补充20% HAT DMEM完全培养基，全程观察细胞融合情况。

[0025] （4）阳性孔的筛选及克隆。在细胞融合后的第5天和第10天，分别收集细胞培养上清液，每孔100 μL加入96孔板，37℃孵育60分钟，洗涤3次后拍干。接着加入1: 5 000稀释的兔抗鼠二抗，每孔100 μL，同样37℃孵育60分钟，洗涤3次后拍干。然后每孔加入TMB 100 μL，避光显色15分钟，再加入终止液100 μL终止反应，实验中以SP2/0细胞上清液为阴性对照，酶标仪读取吸光度值，筛选出31‑B4‑C10细胞株效价最高（表2）。

[0026] 表2 细胞株上清效价间接ELISA检测

[0027] 选择OD值高的细胞进行扩大培养，一部分冻存，另一部分再次进行亚克隆。将检测出的阳性细胞孔中的液体吹打混匀后，转移至1.5 mL离心管中，离心去除上清。将细胞继续传代培养至25代，得到稳定的杂交瘤细胞系。最后一次培养时，待细胞为对数生长期时，进行细胞冻存，详细记录相关信息，液氮保存。

[0028] 31‑B4‑C10细胞株的保藏信息：一种分泌华支睾吸虫单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为CSTR1‑C3B4C10，已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO. 46128，保藏时间为2024年11月6日。

[0029] （5）单克隆抗体腹水制备及效价测定。对雌性Balb/c小鼠腹腔注射0.5 mL的IFA以6
激发免疫反应，9天后，再次腹腔注射0.5 mL的培养基（含2×10 杂交瘤细胞）。每日监测小鼠的精神状态及腹部体积变化。若小鼠腹部显著膨胀，则可用注射器收集腹水，以5 000 r离心20分钟以上，上清即为单克隆抗体，‑80℃保存备用。

[0030] 将腹水倍比稀释铺于96孔板，100 μL /孔，37℃包被60分钟，PBST洗板三次并拍干；入1: 5 000稀释HRP标记的兔抗鼠二抗，100 μL/每孔， 37℃孵育60分钟，PBST洗板三次并拍干；加入单组分TMB底物液，100 μL/孔，37℃避光显色10分钟；加入2 M 硫酸终止反应，100 μL /孔。阴性对照包被SP2/0细胞腹水，其余操作步骤相同。酶标仪读取结果，小鼠的
31‑B4‑C10腹水效价均达到1 ：32 000（图1）
（6）单克隆抗体亚类鉴定。收集注射单克隆抗体后的小鼠腹水，分别用IgG1、IgG2a、IgM、IgA抗体进行单抗亚类鉴定，该单抗为IgG1型。

[0031] 实施例2.构建基于单克隆抗体的人华支睾吸虫病即时检测试纸条即时检测试纸条包括样品垫、结合垫、NC膜和吸水垫，结合垫上喷涂有偶联时间分辨荧光微球的CSTR1抗原（EuNPs‑CSTR1）作为捕获探针，醋酸纤维膜上包括检测线（T‑Line）和质控线（C‑Line）分别喷涂小鼠抗人IgG和CSTR1单克隆抗体。当检测到阳性血清样品时，结合垫上的EuNPs‑CSTR1探针捕获血清中抗华支睾吸虫抗体，迁移至检测线，与小鼠抗人IgG结合，另一部分探针继续向前层析至质控线与CSTR1单抗结合。

[0032] CSTR1抗原氨基酸序列：（SEQ ID NO.1）GGKAPPPESAGGKAPPPESAGGKAPPPESAGGKAPPPESAGGKAPPPESAGGKAPPPESAGGKAPPPESAGGKAPPPESAGGKAPPPESAGGKAPPPESA;
CSTR1抗原基因序列：（SEQ ID NO.2）
GGCGGCAAGGCACCACCTCCTGAGTCAGCTGGCGGCAAGGCACCACCTCCTGAGTCAGCTGGCGGCAAGGCACCACCTCCTGAGTCAGCTGGCGGCAAGGCACCACCTCCTGAGTCAGCTGGCGGCAAGGCACCACCTCCTGAGTCAGCTGGCGGCAAGGCACCACCTCCTGAGTCAGCTGGCGGCAAGGCACCACCTCCTGAGTCAGCTGGCGGCAAGGCACCACCTCCTGAGTCAGCTGGCGGCAAGGCACCACCTCCTGAGTCAGCTGGCGGCAAGGCACCACCTCCTGAGTCAGCT；
时间分辨荧光微球与抗原的化学偶联。通过化学偶联法制备捕获探针。时间分辨荧光微球以14 000 g离心15分钟，去除保存液：将10 μL的EDC（1mg/mL）、10 μL的NHS（1 mg/mL）和100 μL的MES（0.05M）与EuNPs混合45分钟（黑暗，室温），确保EuNPs完全活化。通过14 
000 g离心20分钟，去除多余的EDC和NHS。加入PB缓冲液，超声分散6分钟，随后加入20μg CSTR1，室温下孵育3小时。以14 000 g离心15分钟，去除多余的耦联蛋白。加入200 μL封闭液（5% BSA）在4℃下封闭12小时。再次以14 000g离心15分钟，去除多余封闭液。最后，加入
400 μL微球保存液（0.05M PBS，含1% BSA和1% Pro Clin 300）保存于4℃，避光条件下。

[0033] 结合垫的制备。将标记好的捕获探针喷洒在玻璃纤维素上，在烘箱中烘干。

[0034] NC膜处理。将醋酸纤维素膜检测线包被有小鼠抗人IgG（2mg/mL），质控线包被CSTR1单克隆抗体（2mg/mL），在烘箱中烘干。

[0035] 组装。将样品垫、结合垫、NC膜、吸水垫依次贴在PVC底板上，裁切至合适宽度，室温避光保存。

[0036] 根据需要稀释样品，滴加样品室温反应10分钟，紫外光照下，阳性样本的检测线和质控线同时发出红色荧光；检测阴性样品时，仅有探针被截留在质控线上，质控线发出红色荧光。检测结果既可经过紫外照射后进行肉眼观察判读，也可经荧光读取器进行精准读值（图2）。

[0037] 实施例3.临床样本检测（1）特异性试验
采用其他寄生虫病人的血清进行试纸条的特异性实验，包括日本血吸虫、旋毛虫、弓形虫、鞭虫、囊虫、蛔虫、钩虫、包虫病人血清，用健康人的血清做为对照。结果表明，除华支睾吸虫病人血清外，其余寄生虫病人血清的试纸条检测结果均为阴性，说明试纸条特异性良好（图3）。

[0038] （2）敏感性性试验根据粪便样本中KK法观察到的感染强度（EPG=0、24、48、72、96、120、144、168、192、
216、240）将血清样本分为不同类别，并采用FIA检测各血清样本，评价其敏感性。每个反应按预定的最佳条件进行三次。采用其他9种寄生虫进行交叉反应试验，评估了FIA的特异性，并在最佳条件下对所有这些血清进行了三次试验。结果表明，低强度感染的血清样本也可以被试纸条准确检测出来，表明试纸条具有良好的灵敏性（图4）。

[0039] （3）试纸条检测混合感染血清为了验证荧光试纸条对华支睾吸虫和其他种类寄生虫混合感染血清的检测效果，使用已优化的试纸条分别检测9份混合感染血清，结果表明试纸条可以识别华支睾吸虫与其他种类寄生虫共感染的血清样本（图5）。

[0040] （4）试纸条保存期试验经过一系列试纸条的优化实验后，需对试纸条的保存期限进行测试，将试纸条置于室温（22‑28℃）避光保存。每隔15 d测试试纸条对阴性血清，弱阳性血清和强阳性血清的检测效果，结果表明室温避光条件下试纸条保存90 d以后仍可以检测出弱阳性样本（图6）（5）同时采用FI、和KK法对华支睾吸虫病流行区133份临床样本血清样本和对应的粪便样本进行检测，并对检测结果对比，评价FIA的临床应用性能。FIA检测血清样本的阳性率为44.36%（59/133）与粪便镜检结果一致（表3）。

[0041] 表3 EuNPs‑FIA检测效果与KK法和PCR法对比

[0042] 综上所述，本发明制备并鉴定出了一种针对华支睾吸虫CSTR1的单克隆抗体，在此基础上结合时间分辨荧光微球纳米材料建立的人华支睾吸虫病血清学即时检测方法特异性强，与其它种类寄生虫血清无交叉反应；灵敏度高，可检测低强度感染患者（EPG≥24）；准确性高，与传统粪便镜检法检测结果一致，特异性与灵敏性均为100%，为人华支睾吸虫病的快速检测提供了技术保障。