[0001] 本发明涉及一种与鸡蛋壳质量性状相关的STON1基因分子标记引物及其应用，属于生物技术领域。

[0002] 单核苷酸多态性（SNP），是指在基因组上单个核苷酸的变异，在遗传物质传递过程中可以稳定遗传给后代，因此可以作为分子标记进行群体选育和保种。鸡蛋蛋壳质量是鸡蛋重要品质性状之一。正常的鲜蛋表面光滑，蛋壳坚固完整，颜色均匀，大小一致，手感良好，互相碰撞时产生清脆的声音而不易破裂。软壳蛋蛋壳薄软易破损，蛋内品质差，直接影响鸡蛋的收捡、存放、运输、孵化或食用，给养殖造成较大的经济损失。软壳蛋的产生受多种因素的影响，除营养管理和饲养管理外，遗传对软壳蛋发生率的影响也不容忽视。软壳蛋比例性状的遗传力是0.308，属于高遗传力性状，如果育种中不加以选择，将会导致群体内快速扩散软壳蛋不良基因，直接影响鸡蛋的商品性和种蛋孵化成功率，进而降低收益。但是软壳蛋高发于鸡产蛋期的中后期，难以在早期对鸡群进行选育，而开产后进行选种将造成极大的饲养成本浪费。借助分子标记对鸡进行早期选种，准确高效且快速地选育出低软壳蛋产出率的鸡群，并提高群体鸡蛋品质整齐度是目前育种工作的目标之一。研究发现，人STON1基因表达量偏高会导致高雄激素血症和肥胖，STON1基因在患有多囊卵巢综合症的女性中表达量偏高。相较于正常体型的小鼠，肥胖体型的小鼠的卵巢和脂肪细胞中均发现了STON1基因表达量偏高，而肥胖是造成繁殖性能衰减的原因之一。这些研究都揭示了STON1基因与繁殖存在密切联系，但是尚未见鸡STON1基因的研究报道。

[0013] 以下实施例适用于鸡的育种，所举鸡的品种不限于下述实施例。

[0014] 实施例1本实施例测量了隐性白洛克鸡开产后软壳蛋表型性状，利用第二代测序技术进行全基因组SNP基因分型，通过全基因组关联分析筛选得到与蛋壳质量性状显著相关的STON1基因分子标记，结果如图1所示。

[0015] 本实施例通过以下实验对与蛋壳质量性状相关的STON1基因分子标记进行鉴定和应用。

[0016] 1.表型测定和基因型检测（1）实验材料及36周龄软壳蛋表型测定
选取隐性白洛克鸡2301只，在相同的饲养条件下饲养，整个过程采用自由采食和饮水，开产后记录每只鸡产蛋数和蛋类型。36周龄时，统计每只鸡的软壳蛋比例，作为鸡蛋壳质量的表型数据。

[0017] （2）基因组DNA的提取对待测个体采用翅下静脉采血，抗凝处理后裂解，经蛋白酶K消化后，用饱和氯化钠方法提取，TE溶解之后‑20℃保存。

[0018] （3）PCR扩增以上述提取的基因组DNA为模板，对包含3号染色体上第7867409位碱基处位点的片段进行扩增。

[0019] 上游引物：5’‑CCACTGCACTTGCTCAACAT‑3’（SEQ ID NO:1）下游引物：5’‑CATCCAGCTGAATCAAAGCA‑3’（SEQ ID NO:2）
反应体系终浓度25 μl计，
待测DNA 50 ng，
2 x Accurate Taq Master Mix 12.5 μl，
上游引物 1 μl，
下游引物 1 μl，
灭菌水 补充至 25 μl。

[0020] PCR扩增的反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸60sec，共30循环；72℃延伸2min；4℃保存；取10μl用于琼脂糖检测，扩增得到单一目的条带长度为538bp的扩增产物，且含鸡3号染色体第7867409位碱基位点的SNP分子标记。扩增产物序列如下：SEQ ID NO:3
CCACTGCACTTGCTCAACATTCCATGAATCTGGAAGGCAACAGGGATGGGGAGTGCAACTTCTCGGTCAGTGATGGGATGTTCTGAGCAAAAAGGCAAACAACGAAAAAAGGCACAAAAGGATTCAGGCGAAAAAGGGGCAAAAGGCACAAAAAGGCAGCAGTCCTTTGTTTGCAAAGTCCTTATAAATGGTCTGGTCTTTGTGTGGTTTCACAAGGTAACAACACGTTGTGCACATTCGACACTACTGCACAGTCTTATCTACCCCTGAGCATCCAGGGTCCCTCATCTTAGGGTCACCTCGGTCCATCTCAGCAGCAGAACATGAGCTGGCATCCTCCCCTTATCTTTGTTGCCCCCGGCAACCGTGTGTAGGCAGCAGGGAGTCCTTCAGAGTCTCCCTCAGGCCTCTCAAGCAACTTCTGAGACAAAAAACTTCTTTGTATACGCTCACAGGGGTGCAACAGCATCCTCGTGCAACAGCAGGCGTTGGTTTCTGTTAAACTCAGAGGTGACGGATGCTTTGATTCAGCTGGATG
SEQ ID NO:4
CCACTGCACTTGCTCAACATTCCATGAATCTGGAAGGCAACAGGGATGGGGAGTGCAACTTCTCGGTCAGTGATGGGATGTTCTGAGCAAAAAGGCAAACAACGAAAAGAGGCACAAAAGGATTCAGGCGAAAAAGGGGCAAAAGGCACAAAAAGGCAGCAGTCCTTTGTTTGCAAAGTCCTTATAAATGGTCTGGTCTTTGTGTGGTTTCACAAGGTAACAACACGTTGTGCACATTCGACACTACTGCACAGTCTTATCTACCCCTGAGCATCCAGGGTCCCTCATCTTAGGGTCACCTCGGTCCATCTCAGCAGCAGAACATGAGCTGGCATCCTCCCCTTATCTTTGTTGCCCCCGGCAACCGTGTGTAGGCAGCAGGGAGTCCTTCAGAGTCTCCCTCAGGCCTCTCAAGCAACTTCTGAGACAAAAAACTTCTTTGTATACGCTCACAGGGGTGCAACAGCATCCTCGTGCAACAGCAGGCGTTGGTTTCTGTTAAACTCAGAGGTGACGGATGCTTTGATTCAGCTGGATG
（4）Sanger测序和基因分型
分别将各个样本的PCR产物进行Sanger测序，获得的不同基因型测序峰图如图2所示。

[0021] 2.相关性分析选取2301只36周龄软壳蛋表型记录清晰的隐性白洛克母鸡个体进行相关性分析。
采用R 4.2统计绘图软件的ANOVA检验函数进行统计检验，选择两两之间平均值比较模式对试验鸡群的基因型和软壳蛋性状进行统计检验，P<0.05表明差异显著。结果如表1所示，三种基因型鸡的软壳蛋比例差异显著（P<0.05）。A/A基因型个体的软壳蛋比例为1.02％，低于G/G基因个体的1.78％（P<0.05）和A/G基因型个体的1.46％（P<0.05）。A/G基因型个体软壳蛋比例低于G/G基因型个体（P<0.05）。结果表明鸡STON1基因分子标记与鸡软壳蛋性状表型显著相关，可根据实际育种目标，选育A/A基因型个体以选育软壳蛋比例低的鸡，降低软壳蛋的产出率，提高选育效率。

[0022] 表1 STON1基因分子标记基因型和蛋壳质量表型统计分析

[0023] 注：同列数据肩标相同字母表示差异不显著，肩标不同字母表示差异显著（P<0.05）。

[0024] 实施例2不同品种基因型频率
步骤一、血液样品采集
使用翅下静脉采血法采集北京油鸡、大骨鸡、大围山微型鸡、文昌鸡、武定鸡、瓢鸡、胡须鸡、藏鸡、茶花鸡、福建河田鸡、溧阳鸡、杏花鸡、广西三黄鸡、白来航蛋鸡和科宝肉鸡15个品种的血液样品‑20℃保存备用。

[0025] 步骤二、提取基因组 DNA取步骤一得到的组织样品，采用Omega的组织基因组 DNA提取试剂盒提取基因组 DNA，具体方法参照 Omega 提供的标准操作流程。

[0026] 步骤三、基因型的检测以步骤二得到的基因组DNA为模板，采用F核苷酸序列(SEQIDNO:1)和R核苷酸序列(SEQIDNO:2)组成的引物对进行PCR扩增和 Sanger 测序得到个体的 G/G 基因型、G/A 基因型和 A/A基因型。

[0027] 白来航蛋鸡是常见的商业蛋鸡品种，产蛋率高，蛋壳质量较好。北京油鸡、大骨鸡、大围山微型鸡、文昌鸡、武定鸡、瓢鸡、胡须鸡、藏鸡、茶花鸡、福建河田鸡、溧阳鸡、杏花鸡和广西三黄鸡是知名的中国地方鸡品种。科宝肉鸡是市场上较为流行的商业化肉鸡品种，对于蛋品质性状选育程度较低。其中，中国地方鸡未经过长期选育，产蛋量较低，但是蛋壳质量较好，群体中A等位基因频率高于科宝肉鸡。白来航蛋鸡作为最常见的良种蛋鸡，对蛋品质性状进行了长期选育，产蛋量较高，蛋壳质量较好，群体中A等位基因频率高于科宝肉鸡。这些结果均能证实该 SNP 位点可以作为鸡蛋壳质量的分子标记。见表2，
表2. STON1基因分子标记在不同品种中的等位基因频率分布

[0028] 除上述实施外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。