[0001] 本发明涉及微生物技术领域，尤其是指一株高产细菌素的抑菌性植物乳杆菌及其应用。

[0002] 乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)属乳酸菌科，兼性厌氧、革兰氏阳性，是公认安全的微生物之一。乳酸菌包括多个属，比如乳杆菌属、片球菌属等，且大部分都是有益菌，具有调节生理机能、改善肠道生态平衡和功能等重要的生理功能。

[0003] 细菌素(bacteriocin)，又称抗菌肽，是细菌在代谢活动中由产生的一种蛋白质或生物活性多肽，这些多肽或蛋白质具有一定的抑菌活性，可以抑制致病菌的生长，绝大部分细菌都能产生一种甚至多种细菌素。细菌素属于基因编码产生，且不容易产生耐药性，在大多数有效抑菌浓度下对动物无毒害作用，其抗菌活性强、天然无危害等作用使得细菌素成为潜在的抗生素替代品。

[0004] 产细菌素的乳酸菌可以刺激有益微生物的生长并抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特氏菌、志贺氏菌等有害或者致病微生物的生长繁殖，调节宿主的防御机制，在结肠中形成定植，增强营养物质的可用性。产细菌素的乳酸菌可通过营养物质或粘附部位的竞争影响肠道微生物群，改变肠道微生物群的组成，改善肠道微环境。产细菌素乳酸菌不仅可以调节肠道菌群纠正生态失调，还可以作为天然抗菌化合物，治疗或者维持一些重要的人类疾病，如结肠感染、炎症性肠病、肥胖和结直肠癌等。因此，进一步挖掘具有高效抑菌作用的产细菌素乳酸菌，并分析评价其肠道益生活性，对推进乳酸菌调节肠道微生态并干预或治疗疾病等应用具有重要的作用。

[0047] 下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

[0048] 下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例涉及的原料若无特别说明，均为普通市售品，皆可通过市场购买获得。

[0049] 下面结合图示和实施例对本发明作进一步详细描述：

[0050] 实施例1：本发明植物乳杆菌ZW1的分离和鉴定

[0051] 1)菌株分离

[0052] 取发酵梨汁样本1g加至9mL生理盐水中，振荡使之充分混匀，梯度稀释后取10‑5、‑6 ‑710 、10 菌液分别均匀涂布于MRS平板中，置于厌氧培养箱中37℃恒温培养，24h后通过菌落形态和镜检对菌株进行初步鉴定，从中挑选出符合特征的菌株进行划线纯化培养。

[0053] MRS培养基配方(g/L)：葡萄糖20，牛肉膏10，蛋白胨10，酵母提取物5，无水乙酸钠5，柠檬酸二铵2，磷酸二氢钾2，硫酸猛0.19，硫酸镁0.58，吐温80 1mL，琼脂粉15，pH 6.5。

[0054] 2)菌株的形态学和16S rDNA鉴定

[0055] 本发明的植物乳杆菌ZW1菌落形态见图1。菌落呈圆形、乳白色、不透明，直径约1～2mm，边沿平滑，表面润湿突出有光泽。

[0056] 对挑选的目的菌株进行DNA提取与16S  rDNA鉴定。采用通用引物27F：5'‑AGAGTTTGATCCTGGCTCAG‑3'与1492R：5'‑GGTTACCTTGTTACGACTT‑3'PCR扩增其16S rDNA片段。采用1.0％凝胶琼脂电泳检测DNA提取情况以及PCR扩增产物大小。将获得的目的片段进行测序分析，测序结果在NCBI数据库中进行比对，结合同源分析确定所得菌株为植物乳杆菌，其分类命名为植物乳杆菌Lactobacillusplantarum，于2023年2月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.26685。

[0057] 实施例2：本发明植物乳杆菌ZW1的生长曲线与pH曲线

[0058] 将植物乳杆菌ZW1的活化种子液以1％接种量在无菌条件下接入100mL的MRS液体培养基中，37℃厌氧培养24h，每隔4h取样，测定OD600与pH，每个样品重复测试3次，以培养时间为横坐标，以OD600或pH数值为纵坐标，绘制菌体的生长曲线和pH曲线(见图2)。植物乳杆菌ZW1在4h进入对数生长期，12h之后进入稳定期，发酵周期较短。pH曲线在0～4h有缓慢的波动性下降，在4～12h急速下降，说明该阶段为ZW1大量产酸阶段，12h以后pH值保持在3.6左右。

[0059] 实施例3：本发明植物乳杆菌ZW1抑菌活性评价

[0060] 将植物乳杆菌ZW1的活化种子液以1％接种量在无菌条件下接入20mL的MRS液体培养基中，37℃厌氧培养24h，收取菌液，4500r/min离心15min，收取上清用0.22μm的滤膜过滤。

[0061] 抑菌试验采用牛津杯法，首先，活化大肠杆菌和表皮葡萄球菌2种指示菌；先向一次性无菌培养皿中加入20mL左右的LB琼脂培养基，水平静置；待其凝固后，接种0.1mL指示6
菌菌液(10CFU/mL)，涂布均匀；用无菌的镊子将牛津杯(直径8mm)置于平板上，取200μL上清液加入牛津杯中；将培养皿正向置于37℃培养24h，测定抑菌圈大小，每种指示菌进行三次重复。结果如图3和图4所示，以大肠杆菌为指示菌时，抑菌圈约为25mm；以表皮葡萄球菌为指示菌时，抑菌圈约为23mm。结果表明植物乳杆菌ZW1具有较好的抑菌效果。

[0062] 实施例4：本发明植物乳杆菌ZW1产细菌素的确认

[0063] (1)排除有机酸干扰

[0064] 测定植物乳杆菌ZW1发酵液上清的pH，用2mol/LNaOH溶液调节pH至5.0，之后进行抑菌实验。以1mol/L乳酸、乙酸调节成相同pH的空白培养基作为对照。结果显示，pH为5.0的发酵上清液在大肠杆菌生长平板上产生的透明圈约为20mm，明显小于原发酵上清液，但仍能产生一定大小的透明圈。另外，加入了乳酸和乙酸的MRS培养基，在指示菌生长平板上几乎没有产生透明圈。以上说明起抑菌作用的物质除有酸性产物外，还有其他物质。

[0065] (2)排除过氧化氢干扰

[0066] 以植物乳杆菌ZW1发酵上清为空白对照，在无菌上清液中加入1mg/mL的过氧化氢酶，评价处理后发酵上清抑菌活性的变化。结果显示，加入过氧化氢酶后，在大肠杆菌生长平板上产生抑菌圈约为26mm，与原发酵上清液无明显差异，因此可排除过氧化氢的干扰。

[0067] (3)蛋白酶敏感性

[0068] 用1mol/L HCl调节植物乳杆菌ZW1发酵上清液至pH 2.0，加入胃蛋白酶1mg/mL，在37℃金属浴中放置2h后煮沸灭酶，之后将pH调节到5.0，加入最终浓度为1mg/mL的过氧化氢酶进行抑菌活性测定。结果显示，在经过胰蛋白酶和胃蛋白酶处理后，在大肠杆菌生长平板上基本不产生抑菌圈，说明其产生的抑菌物质为蛋白类物质，可以初步确定植物乳杆菌ZW1产生的抑菌物质是细菌素。

[0069] 实施例5：本发明植物乳杆菌ZW1对人工胃肠液的耐受性

[0070] 人工胃液配方：取0.1mol/L HCl用蒸馏水调节pH至2.0，加入胃蛋白酶0.01g/mL，微孔滤膜除菌备用。

[0071] 人工肠液配方：用适当水溶解2.04g的KH2PO4再定容至150ml，用4％的氢氧化钠调节溶液pH至6.8后，加入0.01g/ml的胰蛋白酶，混匀后过滤除菌备用。

[0072] 将植物乳杆菌ZW1的24h发酵液按体积比1:10接种至人工胃液中，37℃恒温静置培养，分别在0、1、2、3h取样，对人工胃液中的活菌进行稀释和涂布计数；将接入人工胃液中作用3h的悬浊液进一步以体积比1:10加至人工肠液中，分别在4、5、6、7、8h取样计数获得活菌数，并求出其存活率：

[0073] 存活率/％＝(Ni/N0)×100％(1)，式(1)评价了菌株对模拟胃肠液的耐受能力。其中，Ni为不同时间对应的活菌数；N0为0h对应的活菌数。结果如图5，在人工胃液中，3时的存活率为83.92％；在人工肠液中，4h的存活率为60.07％，表明该菌具有优良的耐受胃肠液的能力。

[0074] 实施例6：本发明植物乳杆菌ZW1对胆盐的耐受性

[0075] 向MRS培养基中分别添加0.03％、0.06％、0.09％和0.12％的胆盐，灭菌备用。将植物乳杆菌ZW1分别接种到不同浓度的胆盐培养基中，以MRS培养基为对照，37℃静置培养24h，每8h取样进行活菌计数，并按照公式(1)求出其存活率。结果如图6所示，胆盐浓度为
0.03％时，24h后菌株的存活率达到72.1％，胆盐浓度为0.12％时，24h后菌株的存活率仍接近50％，表明该菌具有一定的耐受胆盐的能力。

[0076] 实施例7：本发明植物乳杆菌ZW1的肠道益生性能评价

[0077] 将正常小鼠粪便以10％的体积比于0.1mol/L的PBS溶液中匀浆，再以10％的终浓度接种于基础培养基中，作为发酵培养基。将目标菌株、模式益生菌鼠李糖乳杆菌LGG和一9 8
株不产细菌素的L.plantarum PL4活化，分别吸取1mL浓度为5×10和5×10 CFU/mL的发酵液至发酵培养基中，37℃厌氧培养48h，实验分组如表所示。取发酵后的样品沉淀进行16sr DNA扩增子测序分析后进行分析。

[0078] 表1实验分组

[0079]

[0080]

[0081] Simpson、Shannon、Observed species和Chao1为α多样性指数的主要组成部分。Simpson、Shannon指数与菌群多样性呈正比，而Observed species、Chao1表示此种测序深度下的操作分类单元(OTU)数目，可以反映出菌群中物种的丰富度。图7显示，与对照组相比，LGG低剂量组和LPPL4低剂量组的Observed species数目、Chao1多样性指数、Shannon指数和Simpson指数都无明显变化，说明添加低浓度的LGG和L.plantarum PL4对小鼠粪便菌群的丰富度和多样性无明显影响。而LGG高剂量组、LPPL4高剂量组和LPZW1低剂量组较阴性对照组的Observed species数目、Chao1多样性指数、Shannon指数和Simpson指数都有了一定的提升，说明高浓度的LGG、L.plantarum PL4与低浓度的L.plantarum ZW1对小鼠粪便菌群的影响相当，均增加了菌群的丰富度及多样性。LPZW1高剂量组的Observed species数目、Chao1多样性指数、Shannon指数和Simpson指数较NC组有了明显的提升，表明添加高浓度的产细菌素L.plantarum ZW1显著丰富了小鼠粪便中的菌群。

[0082] 对所有组别进行OTU统计，首先将NC组分别与添加不同浓度的LGG、L.plantarum PL4和L.plantarum ZW1的粪便菌群进行比较分析(图8a、8b、8c)，发现每种乳酸菌特有的OTU随添加浓度的增加而增加。将添加同一浓度下不同乳酸菌的粪便菌群进行比较分析(图8d、8e)，发现在添加低浓度时，三组中，添加L.plantarum ZW1的粪便菌群的特有OTU最多，达到231个，高于添加LGG的113个和添加L.plantarum PL4的104个；而添加高浓度时，添加L.plantarum ZW1的粪便菌群的特有OUT与添加LGG的非常接近，显著高于添加L.plantarum PL4，说明产细菌素的乳杆菌L.plantarum ZW1和公认的肠道益生菌一样，可以显著增加粪便菌群的丰富度。

[0083] 在属水平上，从图9可以看出，与对照组相比，其他组中的拟杆菌属(Bacteroides)、副杆菌属(Parabacteroides)、梭菌属(Clostridium_sensu_stricto_13)和乳杆菌属(Lactobacillus)相对丰度增加，LPZW1高剂量组出现了其他组没有的甲基杆菌属(Methylobacter)，而肠道有害菌志贺氏菌属(Escherichia‑Shigella)、变形杆菌属(Proteus)的相对丰度减小，其中LPZW1H组下降的幅度最大，分别下降了11.3％和1.5％，以上说明ZW1可以改善肠道微生物组成。

[0084] 显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。