[0001] 本发明属于中药种苗离体快繁生物技术领域，具体涉及一种白前组培成苗与栽培的方法与应用。

[0002] 白前，白前始载于汉魏《名医别录》，列为中品，包括萝藦科植物柳叶白前[Cynanchumstauntonii(Decne.)Schltr.exLévl]或芫花叶白前[Cynanchumglaucescens(Decne.)Hand.‑Mazz.]具有降气，消痰，止咳的功效。用于肺气壅实，咳嗽痰多，胸满喘急。长期以来，白前处于野生状态，关于白前种质资源、繁育与栽培研究报道较少。野生白前生长在低山丘陵，河滩砂渍、平原的湖边、溪边、沟边或山谷潮湿处。目前，白前主要以收集成熟的角果，并通过种子播种进行传统的繁殖。繁殖系数低，经营周期长，效率比较低，严重制约了白前的人工栽培发展。所以有必要探索高效的柳叶白前快繁产业化技术。

[0003] 目前，国内外通过组织培养技术来实现白前良种壮苗快速繁殖报道较少，且没有完整的栽培种植技术支持。建立白前快速繁殖体系与优良的栽培方式对一步建立白前的工厂化繁育，并实现对白前栽培与生理生化研究奠定基础。

[0031] 本发明具体实施方式中，所采用的试剂或培养基若无特殊说明，均为市售产品。

[0032] 实施例1

[0033] 白前的外植体的采集与准备

[0034] 试供材料为柳叶白前与芫花叶白前茎部分，采自湖北中医药大学药植园，采集时间为每年的3‑6月期间。剪取白前当年生健康茎段，去掉叶片，将保留叶腋的较为粗壮的茎段(2‑3mm)剪切成1.0‑2.0cm。在外植体的制备过程中，均要消毒处理，虽然现有技术中的消毒过程为采用75％乙醇消毒与升汞或者次氯酸钠再次消毒除菌，但不同外植体需要经过考察不同的消毒时间及消毒剂种类的影响。

[0035] 本发明将外植体放入超净工作台的无菌瓶中，75％乙醇对茎段消毒30s与60s，之后转入2％次氯酸钠(NaClO)进行二次消毒处理，分别消毒5min、10min、15min、20min、25min。消毒后的外植体在无菌水中清洗三次，将外植体转移到无菌的滤纸上吸干多余水分。茎段切去两端约0.3cm部分，将外植体材料接入培养基MS固体培养基，在25℃条件下培养14d，统计不同消毒处理的外植体污染率、白化率与发芽率，选出最佳的消毒方式。

[0036] 结果表明：对两种白前的不同消毒剂和消毒时间组合对白前茎段的影响进行考察，以污染率、白化率和腋芽萌发率为考察指标如表1所示。观察14d后的茎段和叶片污染和白化情况。对表1进行分析，发现不同消毒剂和时间的组合对白前外植体消毒效果有显著影响。对于白前茎段；处理A1、A2和A6虽然白化率低，但其污染率也很高，故不能作为最适消毒方法；处理A5、A10虽然污染率低，但其白化率也很高，也不能作为最适消毒方法；综合各种处理，可与看出A8和A9处理明显优于其他处理，故可以得出白前茎段最佳消毒法为75％乙醇1.0min，再用2％ NaClO消毒时间处理15‑20分钟效果最佳。

[0037] 表1不同消毒剂和消毒时间组合对白前茎段的影响

[0038]

[0039] a,b,c,d,e标有不同字母者表示差异显著(P<0.05)

[0040] 实施例2

[0041] 不同激素培养基诱导白前芽伸长生长

[0042] 将实施例1获得的无菌健康的材料(以柳叶白前)接种在不同的培养基上，考察不同激素配比培养基对材料的影响。以MS为基础培养基，采用表2表格中的培养基配方配制培养基。在超净工作台倒置平板，每组接种6个茎段，重复5组。接种14d开始观察萌发情况。

[0043] 表2不同激素配比培养基配方

[0044]

[0045] 通过表2中不同激素配方的培养基诱导，所添加的激素为6‑苄氨基腺嘌呤(6‑BA)、α‑萘乙酸(NAA)、吲哚‑3‑乙酸(IAA)。可以看出在外植体脱菌成功后，各种配比均可诱导成功柳叶白前的叶芽萌发如表3所示，通过观察，配方之间生长状态并不相同。首先出芽速率，以空白A0的萌发生长为出芽正常速度(14‑16d)，A1、A2、A3和A6出芽速度显著提升(10d内)，其中A2配方诱导出的材料，叶片增大，叶色浓绿，茎秆增粗。其他配方诱导出芽状态显著低于A0，因此不作为备选培养基。A4与A5在出现芽的萌发伸长后，茎段基部还生长出不定根。作为诱导成苗的根系分化的一个参考，不同培养基促进腋芽萌发的状态如图1所示。从图1中发现激素配方以MS为基础培养基，0.5‑1.0mg/L 6‑BA、0.1mg/L NAA，蔗糖30g每升，琼脂
7g每升效果最佳。

[0046] 表3不同激素配比培养基对柳叶白前茎段生长的影响

[0047]

[0048]

[0049] 实施例3

[0050] 不同激素培养基诱导白前根的生长

[0051] 利用MS、1/2MS基础培养基加上不同植物调节激素组合对白前诱导生根的情况进行探讨，结果如表4所示，在7d和21d分别对各组生根率及生根情况进行观察对比，得出白前最佳生根培养基。1/2MS较MS更适合于白前诱导生根，1/2MS培养基培育白前植株长势良好，未出现不生根现象。6‑BA(6‑苄基腺嘌呤)、NAA(萘乙酸)和IAA(吲哚乙酸)是植物生长调节剂，它们在植物组织培养中扮演着重要的角色。这些化合物属于植物激素，可以影响植物细胞的生长、分化和发育。在组织培养中，它们通常被用来诱导脱分化(去分化)和再分化(重新分化)过程，以及调节植物生长和发育。6‑BA属于细胞分裂素类植物生长调节剂，主要作用是促进细胞分裂和增殖。在组织培养中，6‑BA常用于促进愈伤组织的形成和维持，以及提高芽的诱导率。它可以与生长素(如IAA和NAA)协同作用，影响细胞分化和器官形成。

[0052] NAA对白前生长具有显著影响，适宜浓度可使白前长势良好，浓度过高不仅抑制白前生根，且可能使植株呈现异常颜色。IAA对NAA可能具有协同作用，其对白前植株生长状况具有积极影响，植株长势好如图2所示。以1/2MS为基础培养基，0.3mg/L NAA，或0.1mg/L NAA与0.1mg/L IAA，蔗糖30g每升，琼脂7g每升。

[0053] 表4不同培养基诱导白前生根情况

[0054]

[0055] 注：*代表改配方使用的基础培养基类型。

[0056] 实施例4

[0057] 水培的定植

[0058] 我们在栽培时发现水培定植成活率高，但是长期的清水培养白前的苗整体生长慢，且叶片茎干等颜色发黄。因此我们尝试采用营养液与改良营养液的方式，探究水培白前的最佳方式如图3所示。无处理为空白对照：水；处理1：每升硝酸钙(Ca(NO3)2)：0.8g、硝酸钾(KNO3)：0.5g、硫酸镁(MgSO4·7H2O)：0.5g、磷酸二氢钾(KH2PO4)：0.25g、硫酸铁(FeSO4·7H2O)：0.05g、螯合铁(EDTA铁)：2.5mg、硼酸(H3BO3)：2.86mg、氯化锰(MnCl2·4H2O)：1.81mg、硫酸锌(ZnSO4·7H2O)：0.86mg、硫酸铜(CuSO4·5H2O)：0.08mg、钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)：
0.02mg，调整pH值至5.5‑6.5；处理2：处理1中各成分每升加1倍，调整pH值至5.5‑6.5。

[0059] 表5为白前不同栽培方式及处理对植株生长的影响，由表5可知，白前组培种与栽培种在叶片数及长度、苗高、茎节及其长度方面无明显差别，而白前组培种的分蘗数远多于栽培种。30d可以观察到白前植株的茎节部位有花萼绿色、花冠紫色、五深裂的花。60d可以观察到植株根系发达，大量白色不定根长出；在植株茎节处可以观察到有些许幼嫩侧枝长出。

[0060] 表5白前不同栽培方式及处理对植株生长的影响

[0061]

[0062] 以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。