[0001] 本发明提供一种润喉糖提取物在制备抗乙型溶血性链球菌感染产品中的应用，具体涉及公共卫生领域。

[0002] 乙型溶血性链球菌(Group B Streptococcus,GBS)是一种重要的人类病原体，它主要定植在人类的上呼吸道和皮肤表层，在某些情况下，它可能导致各种感染，包括咽炎、猩红热、肺炎、皮肤脓肿等。在极少数情况下，GBS还可能引起更严重的侵袭性感染，如败血症、中毒性休克综合症和坏死性筋膜炎。

[0003] 中国专利CN115886116B公开了一种低固形物植物基浓缩液制备硬质糖果的方法，其中包括润喉糖浓缩液的组成和制备过程。该润喉糖具有清热解毒、清喉利咽的功效。但是经过多年研究现发现该润喉糖浓缩液还有抗乙型溶血性链球菌感染的功效。

[0004] 中国专利CN117599100A公开了一种润喉糖浓缩液治疗细菌性炎症的新用途。润喉糖浓缩液由以下重量百分比的原料制备而成：仙草50‑56％、甘草19‑23％、菊花13‑17％、罗汉果7‑11％和金银花1‑4％。专利中使用LPS诱导炎症反应，建立斑马鱼细菌性炎症模型验证润喉糖浓缩液炎症(LPS诱导)消退功效。该专利为模拟细菌性炎症，证明润喉糖浓缩液存在抗炎的潜在疗效，但是细菌种类繁多，引起的疾病也多种多样，该专利未对具体细菌和具体病症进行评价。

[0033] 以下将结合优选实施例来对本发明进行进一步详细描述，但是本领域技术人员将领会的是，这些仅是出于解释优选实施例的目的，并且因此不应当作为对本发明范围的限制。

[0034] 一、润喉糖提取物制备

[0035] 实施例

[0036] 取仙草50份、甘草20份、菊花12份、金银花2份和罗汉果8份，将原料与其质量15倍的85℃热水混合、浸提1.5h，过滤得浸提液。浸提液经板式换热器冷却至25℃后离心，离心的速率10000r/min，离心机流量在5吨/h，将离心后的浸提液经过多级连续的膜元件分离浓缩，得到浓缩液；浓缩液的固形物含量为25％，将浓缩液进行超高温瞬时灭菌，灭菌的温度为136‑140℃，时间为15‑40s，得到润喉糖提取物原药液(RHTE)。

[0037] 二、体内实验

[0038] 1、实验材料

[0039] 受试药物：实施例制得的原药液(RHTE)；

[0040] 阳性对照药：阿莫西林胶囊，珠海联邦制药股份有限公司中山分公司产品，批号：39002211，生产日期：2023.09.22，有效期至：2026.03，规格：0.25g/粒。

[0041] 实验动物：SD大鼠，290±10g，SPF级，60只，雌雄各半，均由北京华阜康生物科技有限公司提供，动物许可证号：SCXK(京)2020‑0004，合格证号：110322241101274778。

[0042] 细菌菌株：乙型溶血性链球菌，购自北纳创联生物科技有限公司，实验室传代，‑80℃冰箱保存备用。

[0043] 2、剂量设计及药液配制

[0044] 实验中设置3个给药剂量：以RHTE为高剂量，以蒸馏水稀释1/2倍RHTE为中剂量，以蒸馏水稀释1/4倍RHTE为低剂量，大鼠给药量为10ml/kg。根据称量，RHTE原药液1ml＝1g，则高、中、低大鼠给药剂量分别为10g/kg/d、5g/kg/d、2.5g/kg/d，按照人与大鼠体表面积系数为6，换算成人用剂量为1.8g/kg/d、0.9g/kg/d、0.45g/kg/d。

[0045] 根据企业提供信息，每100g RHTE含金银花2.3g，菊花12g，则本试验所设高剂量折算为成人剂量，以金银花计为2.48g/人/d，以菊花计为12.96g/人/d，符合一般临床用药剂量，故本试验剂量设计合理。

[0046] 阿莫西林胶囊：成人临床用量为1g/60kg/d，按照人与大鼠体表面积系数为6，换算为大鼠剂量为0.1g/kg/d，相当于人临床用量的等倍。

[0047] 3、实验方法

[0048] 取SPF级SD大鼠60只，体重290±10g，随机分为6组：正常对照组、模型对照组、阳性对照组、RHTE高剂量组、RHTE中剂量组、RHTE低剂量组，每组10只。

[0049] 除正常对照组外，其余各组动物麻醉后，使用灭菌镊子翻开口腔，将吸有1×8
10cfu/ml浓度乙型溶血性链球菌菌液的注射针头点刺咽部，并注射菌液，每只0.2ml，连续感染2天，正常对照组在同等条件下注射营养肉汤。

[0050] 第一次感染后4h给阳性对照组、RHTE高剂量组、RHTE中剂量组、RHTE低剂量组大鼠灌胃给药，10ml/kg，每日一次，连续5天，正常对照组和模型对照组在同等条件下给予蒸馏水。

[0051] 4、体内实验结果

[0052] (1)大鼠血常规

[0053] 第6天对正常对照组、模型对照组、阳性对照组、RHTE高剂量组、RHTE中剂量组、RHTE低剂量组的大鼠眼眶取血，约0.5ml置于EDTA K2抗凝采血管中，用于血常规检测，结果见表1。

[0054] 表1结果显示，乙型溶血性链球菌感染后，模型对照组大鼠白细胞(WBC)、中性粒细胞百分比(NEUT％)和中性粒细胞绝对值(NEUT#)与正常组比较显著升高(P<0.01)，模型对照组大鼠乙型溶血性链球菌感染成功。

[0055] RHTE高剂量组可显著降低WBC、NEUT％和NEUT#，与模型对照组比较有显著性差异(P<0.01，P<0.05)，RHTE高剂量可有可降低乙型溶血性链球菌感染后大鼠白细胞(WBC)、中性粒细胞百分比(NEUT％)、中性粒细胞绝对值(NEUT#)指标。

[0056] 表1六组大鼠血常规结果

[0057] 组别 动物数(只) 剂量(g/kg/d) WBC(10^9/L) NEUT(％) NEUT#(10^9/L)正常对照组 10 / 9.55±1.39 12.20±4.18 1.42±0.63**
模型对照组 10 / 18.13±2.76## 27.57±5.74## 5.94±2.12
阿莫西林组 10 0.1 13.24±2.30** 13.79±3.14** 2.08±0.67**
RHTE高剂量组 10 10 12.85±1.21** 15.96±5.89** 3.19±2.35*
RHTE中剂量组 10 5 18.86±4.09 22.74±6.54 5.28±2.87
RHTE低剂量组 10 2.5 17.36±3.48 25.51±7.68 4.54±1.84

[0058] 注：##为与正常对照组比较P<0.01；**为与模型对照组比较P<0.01；*为与模型对照组比较P<0.05。

[0059] (2)大鼠血清炎症因子

[0060] 第6天大鼠眼眶取血，约1ml置于普通离心管中，4℃过夜，1000×g离心20min，取上清液，‑80℃保存，用于炎症因子检测，结果见表2。

[0061] 表2结果显示，乙型溶血性链球菌感染后，模型对照组大鼠血清中IL‑1β、IL‑6、TNF‑α含量与正常对照组比较显著升高(P<0.01)，模型对照组大鼠乙型溶血性链球菌感染成功。

[0062] RHTE高、中剂量组均可降低乙型溶血性链球菌感染后，大鼠血清中IL‑1β、IL‑6、TNF‑α含量IL‑1β、IL‑6、TNF‑α血清含量，与模型对照组比较有显著性差异(P<0.01)。

[0063] RHTE低剂量组可降低TNF‑α的血清含量，与模型对照组比较有显著性差异(P<0.01)。

[0064] 表2六组大鼠血清炎症因子

[0065]

[0066] 注：##为与正常对照组比较P<0.01；**为与模型对照组比较P<0.01。

[0067] (3)对大鼠咽部组织病理变化

[0068] 大鼠取血后称重，CO2麻醉处死，取咽部黏膜组织固定，用于病理检测。

[0069] 按照表3标准对大鼠咽部病理变化进行分级评分，并采用SPSS20.0统计学软件对结果进行秩和检验，以“‑”计0分，“+”计1分，“++”计2分，“+++”计3分，“++++”计4分对结果单因素方差分析；以P＜0.05为差异显著性检验标准。

[0070] 表3分级评分表

[0071]

[0072]

[0073] 六组大鼠咽部组织病理学改变分级评分结果见表4，mean±SD为均值加减方差。

[0074] 表4六组大鼠咽部组织病理学改变分级评分结果

[0075]

[0076]

[0077] 注：##为与正常对照组比较P<0.01；**为与模型对照组比较P<0.01；*为与模型对照组比较P<0.05。

[0078] 正常对照组：大鼠咽部黏膜上皮结构完整，未见变性、坏死或增生，表层无炎性渗出物，黏膜下层未见水肿及炎细胞浸润，腺体无增生，组织结构正常。

[0079] 模型对照组：镜下咽部黏膜上皮明显增生，黏膜下层结缔组织松散，间质轻度至重度充血、水肿，大量炎性细胞浸润，以淋巴细胞和单核巨噬细胞为主，也可见中性粒细胞和嗜酸性粒细胞，部分区域有肉芽肿组织增生，腺体明显肥大、增生，分泌增加，局部出现坏死或囊性变，较正常对照组有明显差异(P＜0.01)。

[0080] 阳性药组：多数大鼠咽部黏膜上皮增生不明显，黏膜下层结缔组织紧密，间质轻微或轻度水肿伴少量炎细胞浸润，腺体未见明显异常改变，较模型对照组明显减轻(P＜0.01)。

[0081] RHTE中、高剂量组：大鼠咽部黏膜上皮较薄，可见节段性增生，黏膜下结缔组织较为紧密，可见轻度水肿和少量炎细胞浸润，组织增生和炎性水肿程度较模型对照组明显减轻(P＜0.05)。

[0082] RHTE低剂量组：大鼠咽部组织损伤的范围和程度与模型对照组相比差异不明显。

[0083] RHTE中、高剂量可减轻因乙型溶血性链球菌感染带来的组织病理学损伤。

[0084] 三、体外实验

[0085] 1、实验材料

[0086] 受试药物：实施例制得的润喉糖提取物原药液(RHTE)。

[0087] 阳性对照药：阿莫西林胶囊，珠海联邦制药股份有限公司中山分公司产品，批号：39002211，生产日期：2023.09.22，有效期至：2026.03，规格：0.25g/粒。

[0088] 试验用菌：乙型溶血性链球菌，购自北纳创联生物技术研究院；金黄色葡萄球菌，购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

[0089] 2、实验方法

[0090] 试验前取乙型溶血性链球菌和金黄色葡萄球菌的菌液各200μL，分别接种于装有7
30ml肉汤培养基的试管中，置37℃培养箱中培养18h。用比浊仪调整至1×10/mL。

[0091] 分别对乙型溶血性链球菌和金黄色葡萄球菌设置正常对照管、细菌对照管、阳性药对照管和不同稀释比例RHTE对照管。正常对照管和细菌对照管加入2mL肉汤培养基，阳性药对照管加入2mL肉汤培养基和阿莫西林，配置为阿莫西林25mg/ml，取9个离心管，用营养肉汤培养基将RHTE稀释2倍‑512倍，每管最终体积为2mL，作为不同稀释比例RHTE对照管。

[0092] 将0.2mL培养好的乙型溶血性链球菌和金黄色葡萄球菌的菌液本别加入各自组别除正常对照管的各管中,正常对照管加等量营养肉汤培养基，同时置于36℃恒温震荡培养箱中。24小时后观察各管中细菌生长情况，确定无细菌生长的最低药物浓度(MIC)。

[0093] 3、实验结果

[0094] 体外抑菌试验结果见表5。

[0095] 表5体外抑菌试验结果

[0096]

[0097] 注：“‑”表示无细菌生长“+”表示有细菌生长

[0098] 结果显示：经24小时培养后，细菌对照组有显著的细菌生长，正常对照组液体澄清透明，无细菌生长。

[0099] RHTE在所试浓度范围内对金黄色葡萄球菌无显著抑菌作用；RHTE稀释2倍和4倍对乙型溶血性链球菌具有一定的抑制作用，故最低抑菌浓度为将RHTE稀释4倍。

[0100] 最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。