[0001] 本发明属于植物研究领域，具体属于辣椒素合成研究实验领域，更具体的，属于一种验证光信号转录因子CaBBX2诱导辣椒素合成影响因素的实验方法。

[0002] 瞬时沉默和瞬时过表达是生物学实验中常用的两种技术，特别是在基因功能研究、疾病模型建立以及药物筛选等领域。瞬时转化不会将外源基因整合到目标受体的染色体中，是细胞水平的表达，转化后可直接观察鉴定，在植物中已有广泛应用。瞬时沉默是指将携带目的基因cDNA的病毒载体侵染寄主植物后，通过激活植物自身免疫系统促使病毒RNA降解，同时产生含内源目的基因的microRNA，这些microRNA与细胞质中同源RNA特异性互补结合，导致同源mRNA降解，从而发生转录后水平的基因沉默；瞬时过表达是指通过某种方法将外源基因导入细胞，使其在短时间内高效表达，从而研究该基因的功能或影响。这种技术通常利用质粒、病毒载体等将目的基因导入细胞，可应用在启动子和调控元件的分析，如研究不同启动子或调控元件对基因表达的影响，及蛋白质功能研究，利用过表达特定蛋白质来研究其在细胞内的功能和作用机制。

[0003] 辣椒是我们日常生活中常见的一种蔬菜，也是一味中药材，有温中散寒、开胃消食的功效。现代研究表明，辣椒具有抗炎、抗病毒、抗癌等功效，还具有较强的抗氧化作用和免疫调节作用，能够促进细胞因子的产生、保护肝脏、提高机体免疫力，辣椒素类物质是辣椒属植物特有的次生代谢产物，是决定辣椒品质的重要因素，纯辣椒素(类物质)价值高达数万元每千克，因此提高辣椒素的含量可显著提高辣椒的经济价值。

[0004] 辣椒素合成有苯丙烷代谢和脂肪酸代谢两条通路，辣椒中辣椒素主要有5种，分别是：辣椒素(Capsaicin)、二氢辣椒素(Dihydrocapsaicin)、降二氢辣椒素(Nordihydrocap‑saicin)、高辣椒素(Homocapsaicin)、高二氢辣椒素(Homodihydrocapsaicin)，辣椒素和二氢辣椒素二者约占辣椒素总量的90％，也提供了约90％的辣感和热感，其含量高低直接影响辣椒及辣椒制品的辣度。

[0005] 光信号转录因子BBX指在植物中，能够响应光信号并调控相关基因表达的BBX家族成员，CaBBX2在植物中参与多种生物过程，包括光信号转导、生长发育调控等，在现阶段对研究光信号转录因子CaBBX2是否能诱导辣椒素合成这一结论没有相关实验佐证，因此，需要一项新的技术改善这一现状。

[0059] 下面针对说明书附图及实施例对本发明做进一步的详细描述。

[0060] 实施例一

[0061] 活体植株沉默CaBBX2基因对辣椒素合成的影响

[0062] 实验步骤如下：

[0063] S1.TRV:CaBBX2沉默载体构建：从辣椒CaBBX2基因序列获取CaBBX2的特异性片段，以辣椒cDNA为模板，采用 Flash Master Mix高保真酶通过PCR对CaBBX2的特异性片段进行扩增，后纯化回收得到CaBBX2‑TRV2；使用限制性内切酶Xba I和Sma I对TRV2载体双酶切：分别加入反应试剂吸打混匀并瞬时离心进行反应，跑胶确认载体切开以后，进行纯化回收得到酶切过的TRV2载体；利用同源重组连接酶将CaBBX2‑TRV2与酶切过的TRV2载体进行连接，通过热激法将重组载体转化到大肠杆菌DH5α，用TRV2通用引物鉴定阳性单菌落，进行测序及分析，将测序成功的菌落进行扩繁并用质粒试剂盒提取质粒，获得重组质粒TRV:CaBBX2沉默载体；

[0064] S2.TRV:CaBBX2沉默载体组及TRV:00空载对照组的浸染液原料A、B的制备：将TRV:CaBBX2沉默载体、TRV:00空载和TRV1辅助表达载体分别涂板在含有卡纳和利福平的LB固体培养基上，倒置培养后进行单菌落PCR检测，挑取检测结果为阳性的单克隆接种至含有卡纳和利福平的液体LB培养基中进行过夜扩增培养，再从中吸取菌液至含有相应抗生素的液体LB培养基中进行扩繁，利用紫外分光光度计测定菌液的OD值，离心、收集菌体，使用预冷过的ddH2O清洗菌体，用含乙酰丁香酮的侵染液A重悬浮菌体得到含TRV:CaBBX2沉默载体的侵染液B及TRV:00空载侵染液B1，TRV1辅助表达载体侵染液B2，室温黑暗静置，再将浸染液B与浸染液B1分别与侵染液B2混合得到浸染液原料A及对照组浸染液原料B；

[0065] S3.遵辣一号辣椒的处理：待遵辣一号辣椒生长出子叶时，用无针头的注射器吸取侵染液浸染液原料A、浸染液原料B分别注入辣椒子叶背面；

[0066] S4.侵染后的处理：通过对辣椒采用先黑暗、弱光到正常光照方式提高沉默效率；

[0067] S5.授粉及取样：待四母斗开花时进行人工授粉，并挂牌记录授粉时间，授粉，取授粉后的辣椒果实，去除果柄、辣椒籽，将果皮及胎座剪碎液氮速冻，得到测定辣椒素含量及基因表达的样品；

[0068] S6.CaBBX2与辣椒素合成基因互作实验方法如下：构建载体：将基因的启动子片段连接到pAbai载体上，基因的启动子片段前引物前面加上KpnI的识别序列—GGTACC和接头，后引物前面加上XhoI识别的序列—TCTAGA，利用CM334的基因组DNA作为模板，扩增获得基因的启动子片段，热激转化大肠杆菌的方式连接到pAbai载体上作为钓饵，用BstBI和BbsI酶切pAbai重组质粒，同时加入磷酸化酶AP，一步法线性化和去磷酸化反应，将反应产物转入到Y1HGold酵母细胞中，涂布在SD/‑Ura培养基上，得到单克隆；挑选单克隆至YPDA液体培养基进行摇菌扩繁得到菌液，吸取2mL菌液离心集菌；将pGADT7空载质粒、pGADT7:CaBBX2重组载体转入到上述含启动子‑PAbai载体的单克隆酵母菌株中，涂布在SD/‑Ura‑Leu培养基上，得到阳性克隆；在存在Aureobasidin A(AbA)抗生素浓度梯度(0‑200ng/mL)的SD/‑Ura‑Leu培养基上点斑，筛选pGADT7不能正常生长但pGADT7:CaBBX2可以生长的AbA浓度[0069] S7.基因表达量检测：提取步骤S5的样品分子样的RNA，用琼脂糖凝胶电泳仪检验RNA质量，紫外分光光度计检测RNA浓度及纯度；使用逆转录试剂将所获得的RNA反转录为cDNA，放置于4℃保存；采用基因表达实时定量qRT‑PCR实验：以合成的cDNA第一链稀释3倍作为模板，采用qCaBBX2上游引物和qCaBBX2上游引物组成的引物对检测CaBBX2基因；以辣椒肌动蛋白为内参基因，设计内参基因的引物为qActin；

[0070] S8.辣椒素的测定：采用高效液相色谱法测定辣椒素；

[0071] S9.实验数据评价：首先，在点斑后的SD/‑Ura‑Leu培养基上，筛选pGADT7不能正常生长，但pGADT7:CaBBX2可以生长的AbA浓度；

[0072] 如图5‑图8所示，为通过步骤S6的方法构建的重组质粒PAbai:AT3、PAbai:PAL3、PAbai:ACS，PAbai:COMT及其空载组载入不同抗生素浓度梯度的培养基菌群图；

[0073] 其中，图5左边两幅图证明PGADT7和PGADT7:CaBBX2成功转入含有PAbai:AT3的Y1Hgold菌中，且菌的活性没问题，右侧两幅图PGADT7(阴性对照)不长，而PGADT7：CaBBX2可以正常生长，即可推测CaBBX2与AT3互作；

[0074] 图6左边两幅图证明PGADT7和PGADT7:CaBBX2成功转入含有PAbai:PAL3的Y1Hgold菌中，且菌的活性没问题，右侧两幅图PGADT7(阴性对照)不长，而PGADT7：CaBBX2可以正常生长，即可推测CaBBX2与PAL3互作；

[0075] 图7左边两幅图证明PGADT7和PGADT7:CaBBX2成功转入含有PAbai:ACS的Y1Hgold菌中，且菌的活性没问题，右侧两幅图PGADT7(阴性对照)不长，而PGADT7：CaBBX2可以正常生长，即可推测CaBBX2与COMT互作；

[0076] 图8左边两幅图证明PGADT7和PGADT7:CaBBX2成功转入含有PAbai:COMT的Y1Hgold菌中，且菌的活性没问题，右侧两幅图PGADT7(阴性对照)不长，而PGADT7：CaBBX2可以正常生长，即可推测CaBBX2与ACS互作；

[0077] 综上，可证明CaBBX2可以与辣椒素合成相关基因互作。

[0078] 其次，如图1‑3所示，根据TRV:CaBBX2沉默载体组及TRV:00空载对照组授粉后不同时间的辣椒素含量数据显示，在对活体辣椒授粉后33d，辣椒素的积累达到顶峰，沉默了CaBBX2基因以后辣椒素的含量相对于TRV2显著下调，可评价为CaBBX2与辣椒素的生物合成存在关联。

[0079] 最后，如图4所示，根据TRV:CaBBX2沉默载体组及TRV:00空载对照组授粉后不同时间的辣椒素合成相关基因表达量数据显示，CaBBX2被有效沉默，沉默效率为40％‑60％，且随着CaBBX2的沉默，辣椒素合成相关基因表达量也有不同程度的降低，在33d的数据中CaCOMT和CaAT3的表达量甚至与对照组相比下降了70％，可评价为CaBBX2可通过调控辣椒素合成相关基因的表达从而影响辣椒素的合成。

[0080] 在本实施例中，步骤S1中PCR反应程序为：98℃10s，55℃退火5s，72℃5s·1kb，34个循环；PCR反应体系：Mix 25μL、F 2μL、R 2μL、模板2μL、再加入ddH2O至50μL；反应试剂为质粒DNA 20μL、10×NEBbuffer 5μL、Xba I 1.5μL、Sma I 1.5μL、ddH2O 22μL；瞬时离心后的反应方式为37℃反应3h。

[0081] 在本实施例中，步骤S2的具体步骤如下：

[0082] 将TRV:CaBBX2沉默载体、TRV:00空载和TRV1辅助表达载体分别涂板在含有100mg/mL卡纳和利福平的LB固体培养基上，于28℃倒置培养2‑3d后进行菌落PCR检测；挑取检测结果为阳性的单克隆接种至含有100mg/mL卡纳和利福平的液体LB培养基中进行过夜扩增培养，按照28℃，200r/min的条件进行摇菌处理，利用紫外分光光度计测定菌液的OD值，直至OD600介于0.8‑1.0，离心、收集菌体，使用预冷过的ddH2O清洗两遍菌体，用含150μM乙酰丁香酮的侵染液A重悬浮菌体得到含TRV:CaBBX2沉默载体的侵染液B及TRV:00空载侵染液B1，TRV1辅助表达载体侵染液B2，室温黑暗静置3h，再将浸染液B与浸染液B1分别与侵染液B2按1：1混合得到浸染液原料A及对照组浸染液原料B，其中，侵染液A具体为10mM MES，10mM MgCl2，pH＝5.5。

[0083] 在本实施例中，步骤S4的具体步骤如下：

[0084] 辣椒先在18℃黑暗培养56h，然后光强50μmol·m‑2·s‑1的弱光光照条件下适应‑2 ‑124h，再按光照周期12h，昼夜温度22/20℃，光照为200μmol·m ·s 的条件在育苗室中栽培生长；待对椒开始长花苞时，按照步骤S3对对椒结位周围四片新叶进行沉默，保证沉默效果。

[0085] 在本实施例中，步骤S5的具体步骤如下：

[0086] 取授粉后16、25、33、38d的辣椒果实，每个时间点为25‑30个果，去除果柄、辣椒籽，将果皮及胎座剪碎液氮速冻，得到样品，备用。

[0087] 在本实施例中，步骤S6中一步法线性化和去磷酸化反应体系为：10×Fast Digst Buffer，2μL；BstBI和BbsI，各1μL；AP，1μL；pAbai重组质粒，10μL；ddH2O，5μL；一步法线性化和去磷酸化反应程序为：37℃，10min；65℃，15min；SD/‑Ura培养基、SD/‑Ura‑Leu培养基的培养条件为：30℃恒温箱，2‑3d；所述摇菌扩繁得到菌液其反应条件为30℃，180rpm，16h。

[0088] 在本实施例中，S7的具体反应参数如下：

[0089] 使用10μL的内参基因的qRT‑PCR反应体系：SYBR 5μL，ddH2O 3.4μL，10μM PrimerF0.3μL，10μM PrimerR 0.3μL，cDNA 1μL；使用10μL内参基因的qRT‑PCR反应条件为：95℃预变性3min，95℃变性10s，40次循环，58℃退火45s，72℃延伸30s，基因相对表达量用相对定量分析法2‑ΔΔCt的方法计算，步骤S7重复三次，得到最终试验数据。

[0090] 在本实施例中，步骤S8的具体步骤如下：

[0091] 准确称量样品10g于50mL离心管中，加入25mL 95％乙醇溶液，振荡，用超声波提取器提取30min，过滤，收集滤液；将滤渣连同滤纸重新用25mL95％乙醇溶液经超声波提取器提取30min后，过滤，收集滤液，再重复一次；将三次过滤收集的滤液合并，利用旋转蒸发仪浓缩至25mL，转移至新的50mL离心管，用95％乙醇溶液定容至30mL，经0.45μm有机相滤膜过滤后进行色谱分析；将制备好的试液按照色谱条件测定，以峰面积积分值定量，计算辣椒素、二氢辣椒素、总辣椒素的最终含量，其中，色谱参考条件为：色谱柱：Ultimate ODS‑3(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：乙腈：水＝7：3，用前过0.45μm滤膜，脱气；流速：1mL/min；紫外检测器：波长280nm；进样量：10μL；标准工作溶液的配置过程如下：称取天然辣椒碱、二氢辣椒碱分别用甲醇配置为1mg/mL的母液，并稀释成质量浓度为0.2mg/L、1mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L、80mg/L和160mg/L系列标准工作溶液。

[0092] 其中，步骤S1中CaBBX2‑TRV2上游引物序列、CaBBX2‑TRV2下游引物序列、TRV2上游引物序列、TRV2下游引物序列分别为：TGAGTAAGGTTACCGAATTCTCTAGAAAGGCAGAGAATTGAGTTTCCAG；

[0093] TTTAATGTCTTCGGGACATGCCCGGGTCATGATTGTTGCCACTACGCA；GATAATGGTTTGGTGGTC；GTTTAATGTCTTCGGGAC。

[0094] CaBBX2 Capana08g002625CDS序列为：

[0095] ATGAGAACTCTCTGTGATGTTTGTGAAAGTGCTGCTGCTATACTTTTCTGTGCTGCTGATGAGGCTGCTCTCTGCCGTTCCTGTGACCAAAAGGTCCATATGTGCAACAAGCTTGCAAGTCGACATGTAAGAGTTGGTCTTGCTGCCCCCAGTAAAATCCAGCGTTGCGACATATGTGAAAATGCACCTGCTTTTTTTTATTGTGAGATCGATGGAAGTTCCCTTTGTTTGCAATGTGATATGATTGTCCATGTTGGAGGTAAAAGAACCCATGGAAGATATCTCCTTATAAGGCAGAGAATTGAGTTTCCAGGGGATAAATTGGGCCCTTCAAATGAGCTAGGATTGCCATCTACAGAACAAGGTGATGGAAGAAGGGAGCCTGCACAGCCCTTTAAGCTCCCTATGATAGACAATCACCAACCAAACAGGGAGATTGCTATGGCAGGGTTAGAAAATAACGTGAATAACAGCGTGAAAATGGAGAATGAGTTAATTGACCTTAATTCCAGGCCTCAAAGGATACATGGTCAAACGTCAAATAATCAGGAACAAGGAATGGACATGCGTAGTGGCAACAATCATGAGTCAGTCGGCGTGGTTCCTGATGGACCCTTCAAAAGAGAACCAGAGAAGTGA。

[0096] CaBBX2的氨基酸序列为：

[0097] MRTLCDVCESAAAILFCAADEAALCRSCDQKVHMCNKLASRHVRVGLAAPSKIQRCDICENAPAFFYCEIDGSSLCLQCDMIVHVGGKRTH GRYLLIRQRIEFPGDKLGPSNELGLPSTEQGDGRREPAQPFKLPMIDNHQPNREIAMAGLENNVNNSVKMENELIDLNSRPQRIHGQTSNN QEQGMDMRSGNNHESVGVVPDGPFKREPEK*。

[0098] 对步骤S6构建载体的反应产物的基因启动子片段进行测序如下：

[0099] AT3‑PAbai‑F引物序列为AGCTTGAATTCGAGCTCGGTACCGAAAAAAGACAAGTAAATTGAGAAATCAA；

[0100] AT3‑PAbai‑R引物序列为ACATACAGAGCACATGCCTCGAGGATATTATAAATGGGTGATATCTTTCCA；

[0101] PAL3‑PAbai‑F引物序列为AGCTTGAATTCGAGCTCGGTACCGCTCTCCGTACCAAGATTTTTTTGT；

[0102] PAL3‑PAbai‑R引物序列为ACATACAGAGCACATGCCTCGAGGAAGATTAATCTTGAACGTTGGATTGCA；

[0103] ACS‑PAbai‑F引物序列为AGCTTGAATTCGAGCTCGGTACCATACTCAAATGTCATATGTTCTCTTTT

[0104] ACS‑PAbai‑R引物序列ACATACAGAGCACATGCCTCGAGACCCTAAGATGTAATATAATTACATAACT；

[0105] COMT‑PAbai‑F引物序列为AGCTTGAATTCGAGCTCGGTACCTGTTTGAATTCATACACCGGGC；

[0106] COMT‑PAbai‑R引物序列为ACATACAGAGCACATGCCTCGAGATTTTCGACGTCAAAGATCGATACCA；

[0107] CaBBX2‑AD‑F引物序列为GGACAGCCCACCACCCATATGATGAGAACTCTCTGTGATGTTTGT；

[0108] CaBBX2‑AD‑R引物序列CTGGTGATTTCAGCGCCCGGGCTTCTCTGGTTCTCTTTTGAAGGG。

[0109] S7中内参引物qActin上游引物序列、qActin下游引物序列、qCaBBX2上游引物序列、qCaBBX2下游引物序列分别为：GACGTGACCTAACTGATAACCTGAT；CTCTCAGCACCAATGGTAATAACTT；

[0110] CTCTCTGCCGTTCCTGTGA；GGCAGCAAGACCAACTCTTA。

[0111] 本实施例通过对比实验及CaBBX2与辣椒素合成基因互作实验，证明了CaBBX2可以与辣椒素合成相关基因互作，采取对活体植株沉默CaBBX2的基因的方式，得到了沉默CaBBX2授粉后16、25、33、38d的遵辣一号辣椒果实的辣椒素含量及辣椒素合成相关基因表达量实验数据，显示沉默了CaBBX2基因以后辣椒素的含量相对于TRV:00显著下调，随着CaBBX2的沉默，辣椒素合成相关基因表达量也有不同程度的降低，证实了CaBBX2可通过调控辣椒素合成相关基因的表达从而影响辣椒素的合成。

[0112] 实施例二

[0113] 离体辣椒瞬时过表达实验方法

[0114] 包括以下步骤：

[0115] S1.35S:CaBBX2‑flag过表达载体的构建，具体如下：

[0116] 采用高保真酶通过PCR对CaBBX2全长(CDS)进行扩增，后纯化回收，得到CaBBX2‑35‑flag；

[0117] 使用限制性内切酶EcoR I对35S:flag载体进行单酶切，分别加入质粒DNA 20μL、10×NEBbuffer 5μL、EcoR I 3μL、ddH2O 22μL后吸打混匀并瞬时离心，37℃反应3h，跑胶确认载体切开以后，进行纯化回收得到酶切过的35S:flag载体；

[0118] 利用同源重组连接酶将CaBBX2‑35‑flag与酶切过的35S:flag载体连接，从而获得重组载体35S:CaBBX2‑flag；

[0119] 通过热激法将重组载体转化到大肠杆菌DH5α，利用35S:flag通用引物鉴定阳性单菌落，进行测序及分析，最后将测序成功的菌落进行扩繁并用质粒试剂盒提取质粒，获得重组质粒过表达载体35S:CaBBX2‑flag。

[0120] S2.过表达载体35S:CaBBX2‑flag组及35S:flag空载对照组的浸染液原液A、B的制备：构建，将构建成功的过表达载体35S:CaBBX2‑flag及35S:flag空载分别转入GV3101农杆菌感受态中，涂板在含有100mg/mL壮观霉素的LB固体培养基上于28℃倒置培养2‑3d后进行菌落PCR检测；

[0121] 挑取检测结果为阳性的单克隆接种至含有100mg/mL壮观酶素的液体LB培养基中进行过夜扩增培养，按照28℃，200r/min的条件进行摇菌处理；利用紫外分光光度计测定菌液的OD值，直至OD600介于0.8‑1.0，离心、收集菌体，使用预冷过的ddH2O清洗两遍菌体；

[0122] 用含150μM乙酰丁香酮的侵染液A(10mM MES，10mM MgCl2，pH＝5.5)重悬浮菌体，得到含过表达载体35S:CaBBX2‑flag浸染液原液A及35S:flag空载对照浸染液原液B，28℃黑暗静置3h。

[0123] S3.无病害赣椒19号辣椒果实的处理：采取个体大小色泽均一的无病害赣椒19号辣椒果实，于消毒过的实验室干净桌面平铺散热一晚，室温23℃；用纸巾蘸取消毒酒精对果体及果柄进行擦拭，进行消毒处理；用1mL注射器吸取侵染液原液A、B，对辣椒果柄处进行注射，分别将侵染液原液A、B注入辣椒胎座中，取样时间为注射完12h、1d、3d、5d、7d，每个时间点取25个辣椒果实，取样部位为赣椒果实上半部分果皮及胎座，液氮速冻，均匀混匀磨样备用，每个处理称取4份0.5g样品于2mL离心管中作为分子样；以蓝墨水为阴性对照试验，证实从果柄处注射可以将侵染液注入胎座。

[0124] S4.基因表达量检测：用Trizol法提取步骤S3中得到的分子样的RNA，用琼脂糖凝胶电泳仪检验RNA质量，紫外分光光度计检测RNA浓度及纯度；使用逆转录试剂将所获得的RNA反转录为cDNA，放置于4℃保存；基因表达实时定量qRT‑PCR：以合成的cDNA第一链稀释3倍作为模板，采用qCaBBX2上游引物和qCaBBX2下游引物组成的引物对检测CaBBX2基因；以辣椒肌动蛋白为内参基因，设计内参基因的引物为qActin，使用10μL的内参基因的qRT‑PCR反应体系：SYBR 5μL，ddH2O 3.4μL，10μM PrimerF0.3μL，10μM PrimerR 0.3μL，cDNA 1μL；使用10μL的内参基因的qRT‑PCR反应条件为：95℃预变性3min，95℃变性10s，40次循环，58‑ΔΔCt
℃退火45s，72℃延伸30s，基因相对表达量用相对定量分析法2 的方法计算，步骤S7重复三次，得到最终试验数据。

[0125] S5.辣椒素测定方法：采用高效液相色谱法测定辣椒素，具体包括以下步骤：

[0126] 准确称量样品10g，于50mL离心管中，加入25mL 95％乙醇溶液，振荡，用超声波提取器提取30min，过滤，收集滤液；将滤渣连同滤纸重新用25mL 95％乙醇溶液经超声波提取器提取30min后，过滤，收集滤液，再重复一次；

[0127] 将三次过滤收集的滤液合并，利用旋转蒸发仪浓缩至25mL，转移至新的50mL离心管，用95％乙醇溶液定容至30mL，经0.45μm有机相滤膜过滤后进行色谱分析；

[0128] 将制备好的试液按照色谱条件测定，以峰面积积分值定量，计算辣椒素、二氢辣椒素、总辣椒素的最终含量。

[0129] S6.如图9‑13所示，对实验数据结果进行评价，具体如下：

[0130] 根据过表达载体35S:CaBBX2‑flag组及35S:flag空载对照组的辣椒素含量数据显示，在离体辣椒果实中瞬时过表达CaBBX2基因后，除第12h外，其余四个时间点在瞬时过表达CaBBX2以后，辣椒素、二氢辣椒素、总辣椒素含量相对于对照组35S:flag相比，含量都显著升高可评价为瞬时过表达CaBBX2可以使得辣椒果实辣度升高；

[0131] 由于辣椒素合成有苯丙烷代谢和脂肪酸代谢两条通路，对瞬时过表达3d和7d的辣椒果实进行基因表达的检测数据显示，3d和7d存在显著差异的基因都不一样，是因为这些基因存在于一条通路的不同位置，且基因表达的反应应该相较于次生代谢物反应更快；

[0132] 根据过表达载体35S:CaBBX2‑flag组及35S:flag空载对照组的辣椒素表达量数据显示，在离体辣椒果实中瞬时过表达CaBBX2基因后，瞬时过表达CaBBX2以后可以使得CaBBX2表达量提高到两倍以上，可评价为过表达载体35S:CaBBX2‑flag可使得辣椒素合成相关基因表达量也有不同程度的增加。

[0133] 在本实施例中，步骤S5的色谱参考条件为：色谱柱：Ultimate ODS‑3(4.6mm×250mm，5μm)；

[0134] 流动相：乙腈：水＝7：3，用前过0.45μm滤膜，脱气；流速：1mL/min；紫外检测器：波长280nm；进样量：10uL；标准工作溶液的配置过程如下：称取天然辣椒碱、二氢辣椒碱分别用甲醇配置为1mg/mL的母液，并稀释成质量浓度为0.2mg/L、1mg/L、10mg/L、20mg/L、40mg/L、80mg/L和160mg/L系列标准工作溶液。

[0135] 其中，步骤S1中，CaBBX2‑35‑flag的上游引物序列、CaBBX2‑35‑flag下游引物序列、35S:flag的上游引物序列、35S:flag的下游引物序列分别为：

[0136] GATGACGATGACAAGGAATTCATGAGAACTCTCTGTGATGTTTGT、

[0137] GTCCTTGTAATCCATGAATTCCTTCTCTGGTTCTCTTTTGAAGGG、ACGCACAATCCCACTATCCTTC、CATAAAAATACGATAGTAACGGGTG。

[0138] 本实施例通过对比实验方法，采取对离体辣椒瞬时过表达的方式，得到了离体辣椒过表达CaBBX2后12h、1d、3d、5d、7d无病害赣椒19号辣椒的辣椒素含量及表达量实验数据，显示了瞬时过表达CaBBX2可以使得辣椒果实辣度升高，辣椒素合成相关基因表达量也有不同程度的增加。

[0139] 实施例3

[0140] 离体辣椒瞬时沉默实验方法

[0141] 本实施中步骤S1、S2、S4、S5、同实施例2中一致。

[0142] 本实施例与实施例2的区别在于S3无病害赣椒19号辣椒果实的处理，具体为以下步骤：采取个体大小色泽均一的无病害赣椒19号辣椒果实，于消毒过的实验室干净桌面平铺散热一晚，室温23摄氏度；用纸巾蘸取消毒酒精对果体及果柄进行擦拭，进行消毒处理。用1mL注射器分别吸取侵染液B、B1，对辣椒果柄处进行注射，将侵染液注入辣椒胎座中，取样时间为注射完12h、1d、3d、5d、7d，每个时间点取25个辣椒果实，取样部位为赣椒果实上半部分果皮及胎座，液氮速冻，均匀混匀磨样备用，每个处理称取4份0.5g样品于2mL离心管中作为分子样。

[0143] 本实施例与实施例2的区别在于S6实验数据评价，如图14‑17所示，具体如下：

[0144] 根据沉默载体TRV:CaBBX2组及TRV:00空载对照组的辣椒素含量数据显示，在对离体辣椒瞬时沉默后，可以看见辣椒素、二氢辣椒素、总辣椒素含量相对于对照组TRV:00相比，含量都显著下降，这可评价为瞬时沉默CaBBX2可以使得辣椒果实辣度降低；

[0145] 根据沉默载体TRV:CaBBX2组及TRV:00空载对照组的辣椒素相关基因检测数据显示，由于瞬时沉默3d以后实验组与对照组的差异最大，故选取了瞬时沉默后3d的样品用于提RNA进行辣椒素合成相关基因检测，可以看到在瞬时沉默CaBBX2后，CaBBX2及辣椒素合成相关基因表达量显著下降，可评价为瞬时沉默CaBBX2会使得辣椒素合成相关基因的表达量降低从而使得辣椒素含量降低。

[0146] 根据以上实施例，通过对离体辣椒沉默及过表达基因CaBBX2的实验方法，结合活体辣椒沉默CaBBX2基因的实验方法，综合评价可得，CaBBX2的基因会影响辣椒素合成，CaBBX2通过调控辣椒素合成相关基因的表达从而影响辣椒素的合成。

[0147] CaBBX2结合到辣椒素合成基因启动子上，从而促进辣椒素合成基因表达，最终促进辣椒素合成的增加。