[0001] 本申请属于烟草基因组解析技术领域，具体涉及一个烟草NtEXT1基因及其在植物生长调节中应用。

[0002] 烟草（Nicotiana tabacumL.）主要以叶片为收获对象，不仅是我国、也是世界上重要的经济作物之一。但近年来，受气候变化、极端气象等因素影响，在烟草栽培种植过程中，季节性干旱对于烟草种植、产量及品质构成了严重影响。

[0003] 干旱作为植物生长过程中的主要环境压力之一，对植物的呼吸、光合作用、气孔运动、植株生长等生理方面影响是全方位的。当植物受到干旱胁迫时，叶片上的的气孔会关闭，导致胞间二氧化碳浓度升高，从而降低光合作用及蒸腾作用，从而最终影响植物生长发育。烟草正常生长过程中，发育良好的烟叶的含水量也较高、叶片开片也较好。而烟叶叶片作为主要收获对象，对于干旱这一不利环境条件极为敏感。在面临干旱环境时，不仅叶片含水率会直接下降，叶片大小、重量、内含物成分等指标也会受到较大影响，因此，充分研究烟草中抗旱生理机制及相关调控基因，对于稳定烟草品质及抗旱烟草新品种培育具有十分重要的技术意义。

[0017] 下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，就下述实施例中部分实验背景情况简要介绍说明如下。

[0018] 生物材料：烟草K326，现有烟草栽培及研究中常见和常用材料，可由公开渠道获得；
相关引物合成及测序，由武汉艾迪晶生物科技有限公司提供完成。

[0019] 实施例1发明人前期在对干旱逆境情况下外源硒能够缓解干旱对烟草生长影响研究过程
中，基于对烟草miRNA转录组测序分析结果，发明人筛选获得了一个在干旱条件下表达量有显著的变化的NtEXT1基因（该基因是参与细胞壁变化的Extensin蛋白家族成员），但对于该基因究竟仅是响应干旱变化（可以作为干旱指示基因）还是具有实际的抗旱功能（功能基因），仍需进一步深入研究。为此，为进一步明确该基因的实际功能和应用前景，发明人对该基因进行了进一步克隆和相关功能验证分析。本实施例仅就该基因的克隆获得过程简要介绍如下。

[0020] （一）提取总RNA并反转录为cDNA以K326叶片为样品（三叶期幼苗叶片），提取总RNA并反转录成单链cDNA。相关操作
参考相关试剂盒说明书进行即可，或者可具体参考如下。

[0021] 提取总RNA时（采用物RNA快速提取试剂盒，易思得公司产品，货号DR0409050）：取50 mg 的叶片样品，加液氮研磨成粉末，研磨完成后转移至无RNA 酶的离心管
（2 mL规格）中；
加入 600 μL Buffer PR1(NT)，涡旋震荡1 min后静置5min（期间颠倒混匀2次，以
使植物组织充分裂解）；
静置结束后，室温、12000 rpm离心5 min；离心完成后，将400 μL上清转移至新的
无RNA酶离心管中，加入等体积的无水乙醇，混匀后将所有溶液转移至套放于收集管（2 mL规格）中的RNA吸附柱中，室温、12000 rpm离心30 s；
将吸附柱重新放回收集管中，内柱加入500 μL Buffer PR2(NT)，室温、12000 rpm
离心30s，弃废液（可重复洗涤1次，确保洗涤干净）；
再次将吸附柱重新放回收集管中，室温、12000 rpm离心1min后，将吸附柱转入洁
净的无RNA酶的离心管（15 mL规格）中，加30 60 μLRNA Elution Buffer，室温放置1 min~
后，室温、12000 rpm离心30s后，洗脱液即为回收的含所提取总RNA的溶解液。

[0022] 反转录制备cDNA时（采用PrimeScript™ II 1st Strand cDNA Synthesis Kit，Takara公司产品，货号：6210A）：首先，按如下比例配制反应混合液：
Oligo dT Primer，1 μL (50 μM)；
dNTP Mixture，1 μL(10 mM each)；
总RNA，5 μg；
RNase Free dH2O，加至10 μL；
65℃保温5min后，冰上迅速冷却；
随后，在上述反应混合液基础上配制反转录反应体系：
上述反应混合液，10 μL；
5×PrimeScript II Buffer，4 μL；
RNase Inhibitor，0.5 μL(40 U/μl)；
PrimeScript II RTase (200 U/μl)，1 μL；
RNase Free dH2O，加至20 μL；
缓慢混匀后，42℃反应60 min后，95℃保温5min，随后再立即冰上冷却（制备所得
即为cDNA）。

[0023] （二）设计引物及进行PCR扩增参考现有烟草基因组，设计PCR扩增用引物对如下：
NtEXT1‑CDS‑F: 5’‑actagggtctcgcaccATGAAAAGCTCAGGAAAGCTGGGGC‑3’，
NtEXT1‑CDS‑R: 5’‑actagggtctctaccgTTAGTAGTAGGTTGGTGGAGGAGATGCTGA‑3’；
随后，以步骤（一）中所制备cDNA为模板，采用KOD ONE高保真酶（TOYOBO公司产
品），利用上述引物进行PCR扩增；50μl扩增体系参考设计如下：
KOD ONE，25 μL；
NtEXT1‑CDS‑F，1.5 μL；
NtEXT1‑CDS‑R，1.5 μL；
cDNA模板，2 μL；
ddH2O，20 μL；
PCR扩增程序为：94℃、2 min；98℃、10 sec，56℃、5 sec，68℃、5sec，30个循环；68℃、5 min；扩增结束后对扩增产物进行电泳检测。

[0024] （三）基因测序分析对步骤（二）中的PCR扩增产物电泳检测后，回收目的条带并进行提纯后，与pMD18‑
T载体连接后，转化大肠杆菌DH5α后，挑取阳性单克隆测序。相关操作参考相关产品说明书或者现有分子生物学技术操作常规操作，或者可参考如下。

[0025] 回收纯化扩增产物的目的条带时（采用试剂盒Easy Gel Extraction&Clean‑up Kit，易思得公司产品，货号：DR0101250）：切下含目的DNA条带的凝胶块后，置于离心管（1.5 mL规格）中，加入 400 μL 
Buffer A1，65℃保温10min（期间每2‑3 min摇匀一次，直至凝胶块完全溶化）；
将上述溶液吸至HiPure DNA吸附柱（置于2 mL规格收集管）中，室温、12000 rpm离
心30s，弃废液；
将吸附柱放回收集管中，加500 μL Buffer A2，室温、12000 rpm离心30s，弃废液
（可重复洗涤一次）；
将吸附柱放回收集管中，12000 rpm室温离心1 min后，将吸附柱转入离心管中，加
30‑50 μL的Elution2.0，室温放置2min后，室温、12000 rpm离心1min，洗脱液即为回收纯化后含PCR扩增产物（目的DNA）的溶液。

[0026] 将上述回收纯化的PCR扩增产物（目的DNA）与pMD18‑T载体（Takara公司产品）连接后，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞时，采用热激法转化，具体转化操作可参考如下：事先冰上溶解DH5α感受态细胞，溶解后加上目的DNA（即NtEXT1基因）与pMD18‑T载
体连接液10 μL，混合均匀后，先冰上静置5min，再42℃热激45s，再迅速置冰上静置2min；
随后，在上述转化液中加入700 μL不含抗生素的LB液体培养基，混匀后，均匀涂布
于LB固体平板培养基上，37℃、倒置培养过夜；
培养结束后，挑取单克隆，接种至LB（含有氨苄抗生素）液体培养基中，37℃、200 
rpm摇床上摇4 h后，进行菌液PCR鉴定，对鉴定正确的阳性单克隆进行进一步测序分析，以获得NtEXT1基因的实际序列信息。

[0027] 测序后分析结果表明，NtEXT1基因CDS全长1092bp（序列如SEQ ID No.1所示），共编码363个氨基酸，该蛋白分子量为41.27 KDa，等电点为9.72。

[0028] 实施例2在实施例1成功克隆获得EXT1基因基础上，为便于对基因功能进行进一步研究和
明确，发明人构建了相关重组过表达质粒载体。具体构建过程简介如下。

[0029] （一）扩增目的基因NtEXT1基因参考实施例1说明，PCR扩增制备NtEXT1基因；
（二）酶切‑连接反应
以pEGOEP35S‑H为基本骨架载体，对其进行Bsa I‑HF酶切线性化并利用T4 DNA连
接酶将线性化处理后空载质粒与NtEXT1基因进行连接；
具体15μl酶切‑连接体系参考设计如下：
10×CutSmart Buffer，1.5μl；
10 mM ATP，1.5μl；
pEGOEP35S‑H空载质粒，100 ng；
目的片段（NtEXT1基因），50 ng；
Bsa I‑HF，10 U；
T4 DNA ligase，35 U；
H2O，加至15μl；
反应条件为（一步操作下的golden gate的连接重组方式）：先37℃酶切5min；再20
℃连接5min；15个循环。

[0030] （三）质粒转化、筛选及鉴定参考前述实施例1的操作说明，采用热激法，将上述连接体系转化DH5a大肠杆菌感
受态细胞，并进一步进行抗性（Kana抗性）筛选和菌液PCR检测；
菌液PCR检测时，20μl扩增体系参考如下：
2XTaq MIX，10 μL；
35S‑F引物，0.5 μL；
NOS‑R引物，0.5 μL；
菌液，适量；
ddH2O，加至20 μL；
反应程序为：95℃、5 min；95℃、30sec，55℃、30 sec，72℃、90sec，25个循环；72℃、5 min；
上述35S‑F、NOS‑R引物序列具体如下：
35S‑F:5’‑CACGGGGGACTCTTGCCACC‑3’，
NOS‑R: 5’‑ATCATCGCAAGACCGGCAAC‑3’；
目的条带长度1190bp；
对菌液PCR鉴定正确的重组质粒，进一步提取质粒后进行测序（Sanger测序）鉴定，
确保重组过表达质粒载体构建正确。

[0031] 提取质粒时，具体操作可参考如下：将鉴定的含有正确重组质粒的单克隆，接种至LB液体培养基（50 μg/mL的卡那抗
性）中，37℃培养过夜；
取4 mL培养菌液，室温、10000 rpm离心2 min后，弃上清，加250μL的Solution Ⅰ试
剂（含核糖核酸酶A）重悬菌体沉淀后，加入250μL的Solution Ⅱ试剂，上下轻轻颠倒数次直至菌体透明（充分裂解菌体）；再加入350 μL 的Solution Ⅲ 试剂，颠倒数次，直至形成白色紧实絮状物；室温、12000 rpm离心10min后，留上清；
将上述上清加至核酸纯化柱（置于收集管中）中，室温、12000 rpm离心1 min，弃滤
液；
取500 μL的Buffer W1加至核酸纯化柱中，室温、12000 rpm离心30s，弃滤液；
取700 μL的Buffer W2加至核酸纯化柱中，室温、12000 rpm离心30 s，弃滤液（可
重复此操作一次）；
将核酸纯化柱置于收集管中，室温、12000 rpm离心2 min，去除残留液体后，将核
酸纯化柱转入EP管中（1.5mL规格），加入50 μL洗脱液进行洗脱，加入洗脱液后，室温、静置2 min后，室温、12000 rpm离心2 min，剩余液体即为含有重组质粒溶液（可‑40℃保存备用）实施例3
基于实施例2所构建的过表达重组质粒载体，发明人进行了进一步的转化和表型
验证，相关实验过程及结果简介如下。

[0032] （一）制备侵染液取实施例2中所提取的重组超表达质粒，参考前述操作说明及现有技术常规操作，
采用热激法转化农杆菌，并进一步使用含有50mg/L Kan的YEB培养基筛选转化正确的农杆菌菌株；
对转化正确的农杆菌菌株扩增（30℃、150r/min培养）后，使用含有20mg/L乙酰丁
香酮的AAM培养基（酷来博公司产品）调节OD600=0.30左右。

[0033] （二）浸染、转化及筛选将生长至3‑4叶期、叶片生长2‑3cm（时间约为4周）的K326烟草植株叶片在无菌条
件下用手术刀切割成约0.5cm×0.5cm左右大小的叶盘小块置于步骤（一）所制备农杆菌悬浮液中侵染，侵染15分钟；
浸染结束后，用滤纸吸干叶片表面液体后，转入含有0.5mg/L NAA，2.0mg/L 6‑BA
和20mg/L乙酰丁香酮的MS培养基中，暗培养48小时；
暗培养结束后，转入诱导培养基（含有0.5mg/L NAA、2.0mg/L 6‑BA、100mg/L特美
汀、20mg/L潮霉素MS培养基）中，在25℃、湿度50%与16 h光照/8h黑暗的光周期（色温4000K）的培养条件下培养10天左右以诱导形成愈伤组织；
将诱导形成的愈伤组织进一步转接至分化培养基（含有0.5mg/L NAA、2.0mg/L 6‑
BA、100mg/L特美汀、30mg/L潮霉素的MS培养基）上，在25℃、湿度50%与16 h光照/8h黑暗的光周期（色温4000K）的培养条件下培养30天左右（期间每隔15天换一次培养基）以诱导分化形成烟草幼苗；
最后，待愈伤组织长出绿芽时（叶盘放入愈伤分化培养基约1个月后开始出现），切
下绿芽（ 1‑2cm 高）将分化后烟草幼苗进入转接至生根培养基（100mg/L特美汀、20mg/L潮霉素与100mg/L Kan的MS培养基）中，在25℃、湿度50%与16 h光照/8h黑暗的光周期（色温
4000K）的培养条件下诱导生根。

[0034] （三）模拟干旱实验基于上述步骤（二）的筛选，发明人成功筛选获得了两个NtEXT1过表达株系L6、L7，
基于这两个过表达株系（株系进一步培养收获纯化种子），以烟草品种K326（野生型，WT）作为对照，对NtEXT1过表达情况下对烟草生长情况、及抗逆（干旱）影响情况进行了进一步实验研究，具体实验情况简介如下。

[0035] 实验过程：将烟草种子消毒后，置于人工气候箱内进行种子萌发，继续培养至小十字期烟叶
逐渐成型后转入穴盘土培，继续培育一个月左右后，选择长势均匀、健康的烟草幼苗移栽至水培箱（20L基础营养液，pH5.8）中继续培育；
移栽6天后，处理组用20%PEG处理（模拟干旱）5天。实验采用随机设计，3株为一个
重复，重复三次。表型明显变化后，采样进行各项指标分析。

[0036] 基于上述实验过程，具体实验结果简介如下。

[0037] （1）生长表型对比直观生长表型对比如图1所示，进一步对部分生长指标测定结果如图2（叶片数量、
茎节长度、根长）、图3（鲜重、干重、相对含水量）所示。分析可以看出：
正常生长条件下，过表达株系L6和L7长势与野生型没有显著差异；但在20%PEG处
理（模拟干旱）5天后，叶片数量虽无显著差异，但茎节长度分别提高38.10%和19.05%，根长分别提高24.00%和41.33%；也即，NtEXT1过表达后可影响茎节长度（影响蒸腾势）和根长等表型变化；
另外，在20%PEG处理（模拟干旱）5天后，与野生型相比，过表达株系的耐旱性显著
提高，具体表现为：L6和L7地上部鲜重显著提高39.09%和43.98%，地上部干重显著提高
22.35%和23.77%，地上部含水量显著提高2.57%和2.80%，地下部鲜重显著提高56.26%和
84.35%，地下部干重显著提高64.81%和80.99%，地下部含水量显著提高0.54%和0.65%。

[0038] 这一结果表明，超表达NtEXT1基因有助于提高烟草在面对PEG处理时植株中的含水量，从而增强植物的抗旱能力。

[0039] （2）蒸腾速率和气孔导度由于气孔导度与蒸腾速率往往与植株的抗旱性能直接相关，因此，发明人对不同
处理下植株的气孔导度和蒸腾速率情况进行了进一步测定（采用LI‑600测定仪测定，参考其说明书进行操作即可）。

[0040] 蒸腾速率和气孔导度的测定结果如图4所示。分析可以看出：与野生型相比，过表达株系L6和L7的表观蒸腾速率显著降低27.81%和29.14%，气孔导度显著降低28.52%和25.16%。

[0041] 这一结果表明，在面临干旱胁迫时，过表达NtEXT1株系通过降低烟草叶片气孔导度和蒸腾速率方式来提高烟草植株的耐旱性。

[0042] （3）相关生理指标由于植物在面临逆境过程中，各种生理代理物质及生物酶活性也会发生较大变
化，因此，以20%PEG处理5 d的烟草地下部为样品，发明人进一步测定了MDA（丙二醛）、POD（过氧化物酶）、SOD（超氧化物歧化酶）、CAT（过氧化氢酶）等代谢物及生物酶活性。

[0043] 结果如图5、图6所示。可以看出：与野生型相比，L6和L7丙二醛（MDA）含量显著降低45.92%和46.16%，过氧化氢含量显著降低59.40%和60.13%，超氧阴离子产生速率显著降低
59.78%和57.17%，过氧化氢含量显著降低50.6%和51.4%。与野生型相比，L6和L7的SOD活性显著上升119.55%和107.86%，CAT活性显著上升81.94%和73.26%，POD活性显著上升61.74%和58.14%。

[0044] 综合而言，上述结果表明，过表达NtEXT1能够通过影响抗氧化酶活性而降低干旱引起的氧化胁迫。

[0045] 各指标测定过程中，具体方法参考如下：将烟草地下部样品匀浆处理后，4℃、12000 g离心20 min，取上清液进行各项指标
测定；
丙二醛（MDA）测定，参考测试盒（派瑞曼公司产品，货号：BH‑961153）说明书进行，具体可参考如下：
取0.3 ml检测试剂和0.1 mL待测样本，混合均匀后，95℃保温30min；保温结束后，
迅速降至25℃左右后，10000g离心10 min，分光光度计下，在532 nm和 600 nm的波长下，记录吸光度为A532和A600；
过氧化物酶（POD）测定，参考过氧化物酶（POD）活性测试盒（派瑞曼公司产品，货
号：BH‑961149）说明书进行，具体可参考如下：将试剂盒内试剂配制成工作液后，用工作液稀释待检样品溶液合适倍数，在470 nm的波长下测定反应进行1分钟时的吸光值A1以及反应进行2分钟后的吸光值A2；
超氧化物歧化酶（SOD）测定：参考超氧化物歧化酶（SOD）活性测试盒（派瑞曼公司
产品，货号：BH‑961146）说明书，用WST‑8法进行测定；
过氧化氢酶（CAT）测定：参考过氧化氢酶（CAT）活性测试盒（派瑞曼公司产品，货
号：BH‑961148）说明书进行，具体参考如下：将50 μL待检样本液与30 μL试剂一混匀并25℃反应10 min后，再加试剂二、三（100 μL、265 μL），测定405 nm下的测定样吸光度和对照样吸光度；
超氧阴离子（Superoxide Anion Content）含量测定：参考超氧阴离子含量测试盒
（派瑞曼公司产品，货号：BH‑961162）说明书进行；
过氧化氢（H2O2）含量测定：参考过氧化氢（H2O2）含量测试盒（派瑞曼公司产品，货
号：BH‑961167）说明书进行。

[0046] （4）激素含量由于激素在信号转导、抗逆调节中具有十分重要的作用，因此，发明人对于不同处
理条件下植株中部分激素变化情况进行测定。20%PEG处理5d后野生型和过表达株系L6和L7烟草叶片的内源激素含量变化情况如图7所示。可以看出：与野生型相比，干旱条件下，L6和L7植株的细胞分裂素类2MeScZR激素、脱落酸ABA、茉莉酸类激素12‑OH‑JA和赤霉素类激素GA20含量分别显著下降37.18%、26.02%、58.04%和28.27%（L6），和37.04%、39.94%、68.88%和
38.42%（L7）。

[0047] 也即，面临干旱胁迫时，过表达NtEXT1株系通过下调：细胞分裂素类2MeScZR激素、脱落酸ABA、茉莉酸类激素12‑OH‑JA和赤霉素类激素GA20等激素含量来增强植株的抗旱性。

[0048] 相关激素含量测定时，以20%PEG处理5d后烟草自上而下第一片展开叶为样品，委托武汉市东湖新技术开发区迈维代谢公司采用LC‑MS/MS方法检测测定。

[0049] （5）烟叶化学成分由于逆境条件下会对烟草内容物、烟草品质构成一定影响，因此，实验过程中，发
明人进一步对不同处理条件下烟草中与烟草品质相关的若干化学成分指标进行了测定。结果如图8所示。可以看出：
干旱条件下，与野生型相比，L6和L7总植物碱显著下降16.89%和29.14%，钾氯比下
降24.7%和17.56%；L6和L7总糖显著升高31.05%和30.08%，氯含量升高38.07%和21.71%，糖碱比升高103.12%和103.10%。

[0050] 上述化学成分指标测定过程中，以烟叶为样品，风干磨碎后，用连续流动分析仪（AA3型）分别测定烟叶总糖和还原糖（YC/T159—2019）、总氮（YC/T161—2002）、烟碱（YC/T468—2021）、钾（YC/T217—2007）和氯（YC/T162—2011）的含量，并计算糖碱比、氮碱比和钾氯比。

[0051] （四）模拟盐胁迫和镉胁迫实验基于上述步骤（二）的筛选，以两个NtEXT1过表达株系L6、L7为实验材料（株系进一
步培养收获纯化种子），以烟草品种K326（野生型，WT）作为对照，对NtEXT1过表达情况下对烟草生长情况、及抗逆（盐胁迫、镉胁迫）影响情况进行了进一步实验研究，具体实验情况简介如下。

[0052] 实验过程：将培养至三叶期的K326移栽至1/2的Holgland营养液中，预培养5天后，进行盐胁
迫和镉胁迫处理，共分为三个处理：对照、100 mM盐处理（NaCl）和5 μM 镉处理（CdCl）2 ；
处理24h后取叶片，提取叶片RNA，反转录成cDNA，采用qRT‑PCR技术检测NtEXT1基
因表达量变化。参考现有烟草基因组，设计PCR扩增用引物对如下：
NtEXT1‑qRT‑F: 5’‑AAAGCTCAGGAAAGCTGGGG‑3’，
NtEXT1‑qRT‑R: 5’‑TGCGAGGGTTGGAAATTTGT‑3’。

[0053] 结果如图9显示，盐胁迫和镉胁迫均显著诱导NtEXT1上调表达，与对照相比，盐胁迫和镉胁迫后表达量分别显著上升4.0和5.3倍。

[0054] 换言之，NtEXT1基因与盐胁迫、镉胁迫响应，以及对于植物发挥抗盐、抗镉功能也具有十分重要的影响。