[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种酶活性提升的非特异性过氧化酶突变体及其应用。

[0002] 茶树菇（Agrocybe aegerita）的非特异性过氧化酶（AaeUPO）是高度糖基化的硫代血红素酶，UPO是以H2O2为电子受体，不需要任何辅因子，与P450酶相比具有独特的优势。AaeUPO可催化脂肪族和芳香族化合物的羟基化、环氧化、脱烷基等反应。除此之外，AaeUPO也成功应用于医疗行业，AaeUPO催化胆钙化醇和麦角钙化醇生成25‑单羟基维生素，该产物既是维生素，也是一种类固醇激素，它在促进钙的吸收利用、调节激素分泌和免疫功能等方面均发挥重要作用，是人类健康重要的化合物。

[0003] PaDa‑I的血红素结合区由两个保守区域构成，在这些区域中，PCP超二级结构3+
（Pro35‑Cys36‑Pro37）与血红素口袋中的Fe 形成轴向连接，这种结构使得血红素能够稳定地存在于口袋中，并参与到催化反应中。另一方面，EGD超二级结构（Glu122‑Gly123‑
2+
Asp124）则参与绑定血红素残基附近的Mg 。精氨酸（Arg189）与邻近的谷氨酸（Glu196）则分别发挥电荷稳定剂和酸碱催化剂作用，Cys278 和Cys319则形成二硫键，二硫键的形成有助于稳定蛋白质的结构，使其能够正确地折叠并发挥其功能。

[0004] 用维生素D3作为底物，通过茶树菇来源的非特异性过氧合酶催化，并以过氧化氢（H2O2）为氧化剂，成功实现C‑H键的活化和羟基化反应，从而可以一步制备25‑羟基‑维生素D3。然而，目前非特异性过氧合酶催化C‑25羟化的活性较低。

[0019] 下面结合实施例对本发明作进一步的描述。本领域普通技术人员在基于这些说明的情况下将能够实现本发明。此外，下述说明中涉及到的本发明的实施例通常仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。因此，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

[0020] 实施例1 单点突变体的构建与筛选首先用MOE软件对底物维生素D3与下载好的非特异性过氧合酶的晶体结构(PDB ID:5OXU)进行分子对接。将非特异性过氧合酶的血红素通道及底物结合口袋与预测结果对比，将与底物有相关作用力的氨基酸进行定点突变，通过在线网站Hirespot Wizard筛点以及虚拟突变，将得分高的点先进行突变，待测序成功后导入酵母表达系统，后续通过上摇瓶得到粗酶液上反应验证。单点突变体的构建与表达按如下步骤进行：
（1）构建突变体
采用Snapgene设计突变引物，利用全质粒PCR技术，以重组载体pPICZαA‑PaDa‑I‑SPGma为模板，对非特异性过氧合酶的氨基酸序列(该序列如SEQIDNO.1所示)引入单点突变，所用引物如表1所示。各单点突变体为：
T192S：第192位的苏氨酸突变为丝氨酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
G243Q：第243位的甘氨酸突变为谷氨酰胺，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
V244I：第244位由缬氨酸突变为异亮氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；
R257K：第257位由精氨酸突变为赖氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；
S272A：第272位的丝氨酸突变为丙氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；
A317D：第317位的丙氨酸突变为天冬氨酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

[0021] 表1其中，PCR反应体系为：2×phanta Max buffer25μL，正/反向引物1μL，模板DNA1μL，加入ddH2O至50μL。PCR扩增条件见表2。

[0022] 表2向PCR产物中加入DpnI酶（限制性核酸内切酶）1μL、Buffer5μL，然后在37℃处理
1h、70℃处理10min。取10μL的PCR产物，加入100μL冰浴的感受态大肠杆菌悬液中，冰上静置
20min后立即42℃热激90s，冰浴3min后加入LB培养基800μL复苏1h，5000rpm离心2min，弃掉部分上清，将剩余的菌液悬浮后涂板，37℃倒置培养12h。

[0023] （2）重组工程菌的诱导表达从步骤（1）涂板培养后的平板上挑取单克隆于10mL LB培养基(含博莱霉素，终浓度25 μL/mL) 中，于37℃、180rpm培养12小时。将质粒提取出来线性化后电转到毕赤酵母GS115中，取出100 μL涂在含有100 μL/mL 博莱霉素的YPD 固体培养基上，30℃培养3天后进行毕赤酵母GS115的菌落PCR，验证成功后挑菌纯化划线，30℃培养3天，接着以2%的接种量（体积比）将种子液接种至30mLBMGY培养基中，每24小时添加2%（体积比）的甲醇诱导，30℃培养96小时获得诱导培养液，再将培养液于4℃、8000 rpm条件下离心8min，收集上清液得到粗酶液。

[0024] 并以突变体的起始酶非特异性过氧合酶（申请公布号为CN117947077A的专利的实施例1中构建的PaDa‑I‑SPGma）作为对照酶，制备对照酶的粗酶液，制备方法与上述相同。

[0025] （3）酶活检测将步骤（2）获得的突变体与对照酶的粗酶液用ABTS法测定酶活，方法如下：在96孔板中依次加入浓度为100mM的磷酸盐缓冲液(pH 4.4) 158μL、浓度为3mM的ABTS 20μL、粗酶液20μL，充分混匀后加入浓度为0.2M的H2O22μL，在418nm波长检测其吸光值变化。代入公式计算酶活，计算公式如下：
其中，Vsample是要测量的反应溶液的酶体积(20µL)；ε是ABTS在420 nm处的消光−1 −1
系数（ε = 36000 M × cm ）；d是比色皿直径（d = 1cm）；Vtotal是测定系统的总体积（200µL）；Ew是样品吸光度。

[0026] 酶活定义：在25℃和pH 4.4条件下，每分钟水解1μmol底物(ABTS)生成对应产物(ABTS自由基)所需的酶量，为1个酶活单位(U)。

[0027] 相对酶活定义：酶活/对照酶的酶活*100%。

[0028] 本步骤经检测，各个单突变体及对照酶的酶活结果见表3。

[0029] 表3酶 酶活（U/mL）
T192S 7.08
G243Q 5.58
V244I 7.50
R257K 7.19
S272A 7.99
A317D 8.35
对照酶 4.65
由检测酶活结果可知，突变体A317D的酶活最高，其次是突变体S272A。

[0030] 各突变体相对酶活结果如附图1所示。

[0031] 实施例2两点组合突变体的构建与筛选根据实施例1 构建的单突变体序列设计组合突变，利用全质粒PCR技术，以实施例
1构建的单点突变为模板，对非特异性过氧化酶的氨基酸序列的进行两两组合突变得到突变体T192S/G243Q、V244I/R257K、V244I/S272A、T192S/R257K、V244I/A317D。其中，突变体T192S/G243Q的氨基酸序列如SEQIDNO.8所示；突变体V244I/R257K的氨基酸序列如SEQIDNO.9所示；突变体V244I/S272A的氨基酸序列如SEQIDNO.10所示；突变体T192S/R257K的氨基酸序列如SEQIDNO.11所示；突变体V244I/A317D的氨基酸序列如SEQ IDNO.12所示。

[0032] PCR反应体系及反应条件与实施例1步骤（1）相同。

[0033] 粗酶液的制备与实施例1步骤（2）相同。

[0034] 酶活检测方法、酶活及相对酶活定义与实施例1步骤（3）相同。

[0035] 本步骤经检测，各个双突变体及对照酶的酶活结果见表4。

[0036] 表4酶 酶活（U/mL）
T192S/G243Q 5.41
V244I/R257K 7.58
V244I/S272A 8.90
T192S/R257K 7.02
V244I/A317D 7.59
对照酶 4.65
 经过本实施例检测，突变体V244I/S272A的酶活提升最高，为8.90U/ mL，其相对酶活如图2所示。

[0037] 实施例3 突变体V244I/S272A在催化1mM维生素D3羟基化反应中的应用为了鉴定非特异性过氧合酶AaeUPO突变体V244I/S272A催化维生素D3的能力，取4mL实施例2制备得到的粗酶液与实施例1制备得到的对照酶的粗酶液催化1 mM维生素D3，
10mL催化体系为：40%丙酮、终浓度为1mM维生素D3、20% 100 mM磷酸缓冲液（pH 8）、40%粗酶液、1mM/h 过氧化氢。为了充分反应维生素D3，反应12 h后取样，并通过HPLC液相色谱分析方法进行检测。

[0038] HPLC 液相色谱分析方法为：取500μL样品与500μL正己烷萃取摇匀后静置6min，待分层后将上层吸出，挥发后加入500μL甲醇复溶，后用0.22μm有机相过滤器过滤。通过HPLC分析方法对产物25(OH)VD3进行定量分析。流动相的配置：流动相分为两瓶，其中流动相A为纯甲醇，流动相B为纯水，后过膜超声。色谱柱：WelchromC18柱(4.6mm×250mm，5μm)；工作温度：30℃。 紫外检测波长：264nm；流速：1mL/min 流动相为：甲醇：纯水=90:10（v/v）。

[0039] 本实施例HPLC检测结果显示，对照酶的粗酶液的转化率为4.8%，突变体V244I/S272A12h的粗酶液催化维生素D3转化率为72.0%，比对照酶的粗酶液的转化率提升了14倍。其中，突变体V244I/S272A12h催化反应12小时后维生素D3和骨化二醇的HPLC检测结果如图
3所示，维生素D3的保留时间为25.638min，骨化二醇的保留时间为10.016min。

[0040] 本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法；本发明中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法，比如，基因克隆操作具体可参见J.萨姆布鲁克等编的《分子克隆实验指南》。

[0041] 以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。