[0001] 本发明涉及生物检测技术领域，特别是涉及犬冠状病毒N蛋白的单抗、免疫胶体金试纸条及其制备方法。

[0002] 犬冠状病毒(Canine coronavirus,CCoV)病是一种由犬冠状病毒引起的急性肠道感染性疾病，在全球广泛分布，其中中国流行的基因型主要是CCoV‑IIa型。当前，我国宠物饲养量逐年增加，而CCoV常与犬细小病毒(CPV)、犬轮状病毒(CRV)、犬瘟热病毒(CDV)等混合感染，诊断较为困难且容易引起大规模传播。因此，建立一种快速诊断犬冠状病毒病的检测方法具有重要的公共卫生学意义。目前，有几种方法可用于检测CCoV，Elia等利用II型CCoV的重组M蛋白(rMP)建立了ELISA检测法，然而这种方法是耗时耗力的，不适合快速和现场检测；Decaro等开发了一种针对M基因的RT‑qPCR检测方法，用于检测和定量狗粪便中的CCoVRNA，该方法灵敏性高，但是通常需要特定的引物、熟练的技术人员和特定的设备。

[0003] 因此，研制一种快速、灵敏的检测技术意义重大。国内目前用于检测CCoV的技术通常为RT‑qPCR、胶体金免疫层析技术和RT‑PCR。其中对于犬冠状病毒胶体金试纸条的研发较少，试纸条价格昂贵、成本较高。因此降低检测成本，实现技术的国产化，建立一种快速检测方法意义重大。

[0052] CCoV分离株、pET‑30a原核表达载体由武汉科前生物股份有限公司提供，并承诺自申请日起20年内向公众发放RNA提取试剂盒购自武汉科前生物股份有限公司；BeyoECLStar(特超敏ECL化学发光试剂盒)购自上海碧云天生物公司；Page凝胶快速制备试剂盒购自上海雅酶生物公司；DNA胶回收试剂盒购自Magen公司；小量提取质粒试剂盒购自Omega公司。其它实验材料，若无特别说明，均可通过常规购买获得。

[0053] 实施例1

[0054] 1重组质粒pET‑30a‑CCoV‑N的构建与鉴定

[0055] 1.1N基因扩增

[0056] 对实验室CCoV分离株的N基因序列和原核表达载体pET‑30a的序列进行了优化分析，设计出带有载体同源臂的引物序列，并将其送往擎科生物进行基因合成。

[0057] 表1CCoV‑N的扩增和鉴定引物

[0058] 引物名称 引物序列pET‑30a‑CCoV‑F GAAGGAGATATACATATGATGGCCAACCAGGGAC(SEQ ID NO.1)
pET‑30a‑CCoV‑R ATTGATGAGGTAACGAACCTCGAGCACCACCACCACCACCA(SEQ ID NO.2)

[0059] 以CCoV‑N基因的cDNA为模板扩增N基因。

[0060] 1.2胶回收

[0061] 取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，对CCoV‑N的目的条带进行切割，根据DNA胶回收试剂盒说明书回收PCR产物。

[0062] 1.3CCoV‑N基因与pET‑30a线性化载体的连接

[0063] 于冰上配制以下20μl的反应体系：CCoV‑N基因1μl(20ng)，pET‑30a线性化载体1μl(100ng)，5×CE Multis Buffer 4μl，Exnase Multis 2μl，ddH2O 12μl。接着使用移液器轻轻吸打混匀，短暂离心将反应液收集至管底。在37℃条件下反应30min后降至4℃或立即置于冰上冷却。

[0064] 1.4重组产物转化

[0065] 在冰上解冻BL21感受态细胞，取10μL重组产物加入到100μL感受态细胞中，轻弹管壁混匀，冰上静置30min。42℃水浴热激45s后，立即置于冰上冷却2‑3min。加入900μL LB液+体培养基(不添加抗生素)，在37℃、转速200‑250r/min条件下摇菌1h。将含有K的LB固体培养基平板在37℃培养箱中预热，取出摇菌完成的菌液，5000r/min离心5min，弃掉900μL上+
清。用剩余培养基将菌体重悬，用无菌涂布棒在含有K 的平板上轻轻涂匀，37℃培养箱中倒置培养12‑16h。

[0066] 1.5菌液PCR的鉴定

[0067] 取细菌瓶，做标记，加4mL LB液体培养基和4μLK+(终浓度50μg/mL)，混匀，挑取五个单菌落，37℃，200r/min过夜振荡培养。取培养后的菌液使用CCoV‑N的鉴定引物进行菌落PCR鉴定。

[0068] 1.6重组质粒pET‑30a‑CCoV‑N的提取与鉴定

[0069] 挑取菌液PCR中的阳性菌液进行扩大培养，按照小量提取质粒试剂盒说明书提取大肠杆菌DH5α中的重组质粒并测定质粒浓度，阳性重组质粒命名为pET‑30a‑CCoV‑N。取10ng重组质粒pET‑30a‑CCoV‑N使用NdeI酶和XhoI酶对质粒进行双酶切鉴定，鉴定结果应为CCoV‑N基因大小约为1149bp，pET‑30a线性化载体大小约为5238bp。另外取5μL重组质粒送往武汉擎科生物公司进行测序。

[0070] 1.6.1CCoV‑N的小量表达与优化

[0071] 1.6.2pET‑30a‑CCoV‑N的小量表达

[0072] 将测序正确的重组质粒pET‑30a‑CCoV‑N按照转化方法转化进BL21感受态细胞，转+ +化菌液涂布的含有K的平板上轻轻涂匀，于37℃培养箱内培养12h，挑取单菌落接种于含K+
的LB液体培养基中，37℃180r/min培养过夜。过夜培养后，按1：100稀释过夜菌，转接于含K(50ng/mL)的液体LB中，37℃180r/min，大量培养至OD600nm＝0.6‑0.8左右取出。接着取出
1mL菌液作为未诱导对照，剩余培养液加入诱导物IPTG至终浓度为1mmol/mL后，37℃继续培养3‑5h。将诱导完成后的菌液及未诱导的菌液倒入离心管，12000r/min离心1min，弃上清，瞬离，用移液器将LB吸干，4℃收集菌液，集菌后先用1×PBS重悬，洗去多余的培养基：按照
1：10(PBS：菌液)加入PBS重悬。然后超声破碎(650W，破碎5s，停止5s，振幅30％，共6min)，破碎后，4℃，12000r/min离心10min，收集上清到另一管中，沉淀用相同体积的PBS重悬。接着用SDS‑PAGE电泳检测目的蛋白的表达和可溶性鉴定，根据制胶说明书配制蛋白胶，SDS‑PAGE电泳检测上清和沉淀中目的蛋白的含量。

[0073] 1.6.3优化诱导温度

[0074] 取5个细菌瓶做标记，加入20mLLB培养基。按1：100每瓶加入200μL的重组质粒转化的菌液，37℃，200r/min培养至OD600nm＝0.6，取出加入终浓度为1mmol/mol的IPTG，分别在16℃，20℃，24℃，30℃，37℃温度下诱导6h。

[0075] 1.6.4优化诱导时间

[0076] 取5个细菌瓶做标记，加入20mLLB培养基。按1：100每瓶加入200μL的重组质粒转化的菌液，37℃，200r/min培养至OD600nm＝0.6，取出加入终浓度为1mmol/mol的IPTG，分别在37℃温度下诱导2h，4h，6h，8h，10h。

[0077] 1.6.5优化IPTG诱导浓度

[0078] 取5个细菌瓶做标记，加入20mLLB培养基。按1：100每瓶加入200μL的重组质粒转化的菌液，37℃，200r/min培养至OD600nm＝0.6，取出分别加入终浓度为0.2mmol/mL，0.6mmol/mL，1mmol/mL，1.5mmol/mL，2mmol/mL的IPTG，在37℃温度下诱导6h。

[0079] 1.7CCoV‑N的大量表达、纯化和WB鉴定

[0080] 1.7.1重组N蛋白的大量表达

[0081] 同1.6.2。

[0082] 1.7.2重组N蛋白的纯化

[0083] 取重组N蛋白表达上清，用0.45μm滤器过滤。准备好5mLNiNTA高速层析介质(6FF)预装柱纯化蛋白，按照说明书操作。

[0084] 1.7.3对重组N蛋白进行Westernblot鉴定。

[0085] 1.7.4动物免疫

[0086] 使用纯化后的CCoV‑N蛋白作为免疫抗原，佐剂选用弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂。取3只6周龄的健康雌性BALB/c小鼠，免疫剂量为100μg/只。首次免疫将对应剂量纯化后的CCoV‑N蛋白与等量的弗氏完全佐剂混匀，乳化后，对小鼠进行背部皮下肌肉多点注射，之后每隔14d免疫一次，使用CCoV‑N蛋白与等量的弗氏不完全佐剂混匀，乳化后采取首免方法对小鼠进行二免和三免。第三次免疫后3d，采取断尾采血法对免疫小鼠进行采血，并且使用CCoV‑N蛋白进行抗原包被，使用间接ELISA方法测定免疫小鼠血清效价，设置空白小鼠作为阴性对照。选取小鼠血清效价高的小鼠进行加强免疫，采用腹腔冲击免疫的方法，不加佐剂，50μg/只，冲击免疫后3d进行细胞融合。具体免疫程序如表2所示。

[0087] 表2小鼠免疫程序

[0088]免疫次数 免疫剂量 佐剂 免疫时间 免疫途径
首免 100 弗氏完全佐剂 0 背部皮下肌注
二免 100 弗氏不完全佐剂 14 背部皮下肌注
三免 100 弗氏不完全佐剂 28 背部皮下肌注
加强免疫 50 ‑ 36 腹腔注射

[0089] 1.7.5间接ELISA检测小鼠免疫后血清效价

[0090] 1.7.5.1间接ELISA检测方法的建立

[0091] 使用间接ELISA方法检测阳性杂交瘤细胞进行筛选，建立间接ELISA方法，具体步骤如下：

[0092] 1)用纯化的CCoV‑N蛋白做抗原包被酶标板，取2块96孔酶标板，在第1‑7列依次设置不同浓度的抗原包被量，蛋白初始浓度为4mg/mL，依次进行1：2、1：4、1：8、1：16、1：32、1：64的梯度稀释，分别依次加入第1‑7列进行包被，每孔100μl，4℃包被过夜；

[0093] 2)弃去酶标板中的包被液，使用PBST清洗3次，200μl/孔，在吸水纸上拍干，使用封闭液进行封闭，200μl/孔，37℃封闭2h；

[0094] 3)弃去酶标板中的封闭液，使用PBST清洗3次，200μl/孔，在吸水纸上拍干，在第一块板中第1‑6行依次加入1：50、1：100、1：200、1：400、1：800、1：1600倍稀释的阳性血清，100μl/孔；在第一块板中第1‑6行依次加入1：50、1：100、1：200、1：400、1：800、1：1600倍稀释的阴性血清，100μl/孔，37℃孵育1h；

[0095] 4)弃去酶标板中的一抗，使用PBST清洗3次，200μl/孔，在吸水纸上拍干，每孔加入1：7000稀释的HRP标记的IgG酶标羊抗鼠二抗，100μl/孔，37℃孵育1h；

[0096] 5)弃去酶标板中的二抗，使用PBST清洗3次，200μl/孔，在吸水纸上拍干，加入100μl TMB系统显色液，避光显色15min后，每孔加入50μl终止液终止反应，并在酶标仪上读取OD630nm的吸光值，根据酶标仪显示结果分析数据选取最适抗原包被浓度和血清最佳稀释比。

[0097] 1.7.5.2小鼠免疫后血清ELISA效价

[0098] 第三次免疫后7d，采取断尾采血法对免疫小鼠进行采血，并且使用CCoV‑N蛋白进行抗原包被，使用间接ELISA方法测定免疫小鼠血清效价。

[0099] 1.8阳性杂交瘤细胞的制备筛选与亚克隆

[0100] 1.8.1SP2/0骨髓瘤细胞的复苏与培养

[0101] 选择在融合前两周复苏SP2/0细胞，将含20％FBS的RPMI‑1640培养基放入37℃水浴锅中水浴加热备用；将SP2/0细胞迅速从液氮中取出，并立即将冻存管管身浸入37℃水浴锅中，轻轻晃动，使细胞快速融化。待细胞完全融化后，将冻存管置于水平离心机，1000r/min离心5min后取出，在超净台中弃去上清；取提前水浴好的含20％FBS的RPMI‑1640培养基重悬细胞，并加入T25细胞培养瓶中，用含20％FBS的RPMI‑1640培养基定容至5mL，轻轻晃动瓶身混匀细胞后，静置于5％CO2，37℃恒温培养箱中培养12h后换液，加入新鲜培养基，观察细胞状态，等到细胞状态良好，长满培养瓶底部80％，即可进行传代操作。

[0102] 1.8.2饲养细胞的制备

[0103] 在融合前一天，取正常BALB/c小鼠一只，眼球取血后处死。将小鼠全血室温静置2h后，4000r/min离心10min，取上清后56℃，30min灭活血清后保存于4℃。将处死的小鼠立即浸泡在75％酒精中消毒30s。固定小鼠四肢，暴露腹部，撕开腹部皮肤，暴露腹腔。用空白RPMI‑1640培养基反复冲洗小鼠腹腔以获得巨噬细胞。将细胞‑培养基混合液离心，1200r/min离心5min。弃上清，用50mL HAT完全培养基重悬，轻轻吹打混匀，于96孔板中铺板，100μl/孔。37℃，5％CO2培养箱培养，备用。

[0104] 1.8.3细胞融合

[0105] 免疫小鼠脾细胞的准备：取加强免疫小鼠，眼球取血处死，收集阳性血清作为阳性对照。将小鼠浸泡在75％酒精中30s后取出，左侧卧位，取出小鼠脾脏，轻轻去除脾脏周围的脂肪组织，置于细胞筛中。用压力灌注法分离脾细胞，将脾细胞悬液离心，1200r/min离心10min。弃上清，用空白RPMI‑1640培养基重悬。进行细胞计数；收集SP2/0细胞，用空白RPMI‑
1640培养基洗一遍，进行细胞计数。细胞融合：将脾细胞与SP2/0细胞以5：1的比例在50mL离心管中进行混合，1200r/min离心10min。弃上清，轻敲离心管底部，使细胞均匀散开。在37℃水浴条件下，在1min内缓慢加入1mLPEG4000并轻摇离心管后，静止45s。在第一秒内往离心管中缓慢加入空白RPMI‑1640培养基1mL，边添加边摇晃离心管；在第二秒内往离心管中缓慢加入空白RPMI‑1640培养基2mL，边添加边摇晃离心管；第三秒内往离心管中缓慢加入空白RPMI‑1640培养基3mL，边添加边摇晃离心管，最后补齐培养基至50mL。1200r/min离心
10min，弃上清，加入50mL HAT完全培养基。取出前一天铺好饲养细胞的细胞板，用排枪将融合好的细胞均匀加入每个细胞孔中。37℃，5％CO2培养箱培养。

[0106] 1.8.4阳性杂交瘤细胞的筛选与亚克隆

[0107] 融合后每天观察细胞，于第3天进行半换液，即吸取每个细胞孔中的部分培养基，补充新的HAT完全培养基。在细胞集落长到适当大小时，取细胞上清进行间接ELISA检测，将阳性杂交瘤细胞进行亚克隆并再次筛选直至确保细胞为单克隆来源。

[0108] 1.8.5阳性杂交瘤细胞的冻存与复苏

[0109] 阳性杂交瘤细胞的冻存：将阳性的单克隆杂交瘤细胞进行扩大培养，将96孔板中的细胞转移至24孔板中进行培养。当细胞长至80％左右时，将细胞转移至6孔板中继续进行培养。当细胞再次长至80％时，将细胞转移至细胞瓶中进行扩大培养。当细胞在细胞瓶中长至70‑80％时，轻轻将细胞吹下，1200r/min离心5min，弃上清，加入1mL细胞冻存液，吹打混匀后转入细胞冻存管中，15min内将细胞冻存管冻于‑80℃冰箱中，24‑48h内转入液氮罐中长期保存。定期复苏细胞，检查细胞的活性及分泌抗体的能力。

[0110] 阳性杂交瘤细胞的复苏：取出液氮中冻存的杂交瘤细胞，在37℃水浴锅中快速晃动直至冻存液完全融化，1000r/min离心5min，弃去冻存液，用RPMI‑1640完全培养基将细胞沉淀完全重悬，转移至细胞板中，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养。24h后细胞大部分贴壁后进行换液，并每日观察复苏后的细胞生长状态。

[0111] 1.9杂交瘤细胞的鉴定

[0112] 1.9.1杂交瘤细胞染色体数目鉴定

[0113] 采用秋水仙素法进行胞核学检验。

[0114] 1.9.2单克隆抗体的亚型鉴定

[0115] 按小鼠单抗Ig类亚类鉴定，用酶标二抗即用套装说明书进行。

[0116] 1.9.3杂交瘤细胞上清效价测定

[0117] 用间接ELISA方法检测小鼠腹水抗体效价，同时SP2/0骨髓瘤细胞上清液作为阴性对照，检测杂交瘤细胞上清效价。

[0118] 1.9.4杂交瘤细胞腹水的制备和效价测定

[0119] 1)在腹腔注射杂交瘤细胞7d前，选8周龄状态良好的BALB/c小鼠，每只小鼠的腹腔注射0.5mL弗氏不完全佐剂；

[0120] 2)将状态良好的杂交瘤细胞轻轻吹起，1000r/min离心3min，弃上清，用RPMI‑16406
基础液重悬细胞沉淀并调节细胞数至1×10 个/mL，同时以SP2/0细胞作为阴性对照，每只
6
腹腔注射0.5mL，即0.5×10个/只；

[0121] 3)接种10‑14d后，每天观察小鼠腹腔状态，待腹部明显膨大即可收集腹水；

[0122] 4)将收集的腹水在4℃1500r/min离心10min，收集上清；

[0123] 5)4℃过夜后，在4℃12000r/min离心5min，取出下层液体，弃去脂肪，保存于‑20℃备用；

[0124] 6)用间接ELISA方法检测小鼠腹水抗体效价。

[0125] 1.10单抗的纯化及鉴定

[0126] 1.10.1腹水纯化

[0127] 1)腹水的稀释：准备一个50mL离心管，向离心管中加1×平衡Buffer10mL和12mL2×平衡Buffer，取一只单抗腹水(约2mL)，化冻后将其转移到上述的离心管中，混匀后，用0.45μm滤器滤过；

[0128] 2)纯化柱的预处理：将纯化柱竖直放置(填料在下方)。取下上端黑色旋塞，取组装好的进水管，插入到纯化柱的上端口，拧紧，连接蠕动泵，调整好流的速度。先用ddH2O洗10个柱体积，流速1.0‑2.0，再用PBS洗10个柱体积，流速1.0‑1.5，然后用1×平衡Buffer洗10个柱体积；

[0129] 3)过夜上样：将稀释好的并过滤的腹水，置于冰盒放置，由进水管插入，流速0.1‑0.4，出水管连接50mL离心管，收集流穿液。过完柱后将流穿液重新倒入腹水离心管，重复上样，重复两次；

[0130] 4)纯化柱的再平衡和洗涤：首先用1×平衡液Buffer清洗10个柱体积，速度为1.5；然后用除杂Buffer清洗10个柱体积，速度为1.5；

[0131] 5)洗脱：首先清洗纯化仪，不连接纯化柱，左右AB泵的进水管都放在1×平衡Buffer里，然后用10mL注射器分别在AB泵的下端口抽出约10mL的液体；机器操作步骤：点开软件→openmethod→wq文件夹→wash。平衡+洗脱：连接上纯化柱，A泵的进水管插入到1×平衡Buffer里，B泵的进水管插入到洗脱液里，然后准备40个2mL的EP管，加入预冷的Tris‑HCl(pH9.0)，200μL/管，然后放置在管架上。

[0132] 6)清洗纯化仪和纯化柱：洗脱结束后，用PBS清洗10个柱体积，纯化柱用泵用1×平衡Buffer进行平衡10个柱体积，速度1.5，然后纯化柱再用泵用PBS进行平衡，10min，速度1.5；

[0133] 7)使用SDS‑PAGE对纯化后的腹水的纯度进行鉴定。

[0134] 1.10.2单抗的超滤浓缩

[0135] 离心机预冷至4℃，设置为4500r/min离心60min，升速和降速均为8。将超滤管配平后对称放入离心机内，开始离心，每隔一段时间观察一下，以防将所有液体离心下来。当超滤管内液体仅剩1.5mL时，停止离心，用蛋白浓度测定仪器检测内管里是否含有单抗，然后向超滤管中补加预冷过的PBS(0.22μm过滤)至15mL，配平后再次进行离心，总共需要用PBS置换3次，最后一次保证超滤管内的液体在1‑1.5mL。用200μL的移液器吸取超滤管内的液体，然后反复轻柔地冲洗超滤膜(10‑20次)，然后吸出超滤管里的液体于2mL的EP管中。

[0136] 1.10.3单抗的间接免疫荧光实验(IFA)

[0137] 1)F81细胞使用10％FBSDMEM培养基，T25细胞培养瓶，37℃5％CO2中培养；

[0138] 2)当细胞长成致密单层后，弃掉培养基，用PBS洗两次，不含EDTA的胰酶消化后，每孔100μL分装96孔板至长成致密单层，弃培养液，接种2％FBS的DMEM培养基稀释的CCoV病毒液，100μL/孔，培养大约48h后收取；

[0139] 3)弃去96孔细胞板的培养液，PBS洗涤一次，加入甲醇室温固定15min后弃去，空干。然后每孔加入1％TritanX‑100100μL，37℃反应15min后弃去，PBS洗涤三次。每孔加入100μL2％BSA，37℃封闭15min，弃封闭液，PBS洗涤三次；

[0140] 4)杂交瘤细胞上清作一抗，羊抗鼠IgGAlexaFluor488作二抗，每孔加100μL[0141] 5)在倒置荧光显微镜下观察荧光。同时设未接病毒细胞孔作为阴性对照。

[0142] 1.10.4单抗的Westernblot鉴定

[0143] CCoV病毒液制样，进行SDS‑PAGE电泳后电转印到PVDF膜上，用单克隆抗体作一抗，HRP标记羊抗鼠IgG作二抗，后成像。

[0144] 1.10.5胶体金溶液的制备

[0145] 1.10.5.1玻璃制品预处理

[0146] 对玻璃仪器进行清洗消毒后待用。

[0147] 1.10.5.2胶体金溶液的制备

[0148] 取氯金酸1.0g，加蒸馏水定容至100mL，用0.22μm滤膜过滤后装入洁净的玻璃容器中，冷藏避光保存。取100mL蒸馏水在经硅化处理过的锥形瓶中，再加入1mL1％氯金酸溶液使终溶液的浓度为0.01％，置于磁力加热搅拌器上煮沸7min后，在搅拌状态下迅速一次性加入1％柠檬酸三钠水溶液1.4mL，继续加热8min冷却至室温后用蒸馏水恢复到原体积，用0.22μm滤膜过滤后装入洁净的玻璃瓶中，胶体金溶液置于2‑8℃保存，肉眼观察胶体金溶液的颜色，同时测量所合成的胶体金纳米粒子紫外吸光值。

[0149] 1.10.6金标结合物的制备

[0150] 1.10.6.1最佳金标pH和最佳标记蛋白量的摸索

[0151] 采用方阵滴定试验，取8个15mL离心管分别加入2mL胶体金溶液并标记，分别加入4μL、6μL、8μL、10μL、12μL、14μL、16μL、18μL的0.2mol/LK2CO3溶液来调节胶体金溶液pH，将离心管放置于旋转仪上，旋转10min后备用。取8个1.5mLEP管，并分别加入160μL超纯水，吸取浓度为2mg/mL的抗体160μL加入第一个EP管中，混匀后2倍倍比稀释至第8管，弃去第8管多余抗体，保留160μL；取血清稀释板，每一竖列标记对应的K2CO3添加量，每一横列标记对应的抗体浓度，做好标记后，每孔添加相对应的带有0.2mol/mL K2CO3的胶体金溶液200μL，温和混匀，室温静置5min；然后每孔加入相对应浓度的抗体20μL，温和混匀，室温静置5min，使胶体金颗粒与抗体充分结合；使用排枪每孔加入20μL 10％NaCl溶液，温和混匀，室温静置5min后观察颜色变化，同时测量所合成的金标抗体纳米粒子紫外吸光值，选择板中液体未变色的最后一个孔对应抗体投入量作为最佳标记抗体量，对应的0.2mol/LK2CO3溶液添加量所代表的pH值为标记的最佳pH。根据上述的步骤分别对筛选得到的6株单抗和实验室现存的2株单抗作为金标抗体确定其最佳金标pH和最佳标记蛋白量。

[0152] 1.10.6.2金标结合物的制备

[0153] 先向离心管中加入2mL的金溶液，将离心管放置于旋转仪上，旋转5min，观察是否出现死金(及金颗粒沉淀)，如若没有死金，加入单抗对应最适pH的0.2mol/mLK2CO3溶液，旋转混匀5min后，加入对应最适浓度的单抗200μL，旋转混匀5min后，室温静置30min。金标溶液静置30min后，加入10％BSA 0.244mL，使得BSA的终浓度为1％，旋转混匀5min后，封闭30min，封闭后的溶液于4℃以2000r/min离心5min，弃沉淀，将上清转移至另一离心管中，4℃9000r/min离心10min，小心弃去上清，沉淀用重悬缓冲液洗涤1次后1/10重悬。得到的即为金标结合物，4℃冷藏保存备用。

[0154] 1.11试纸条的组装和制备

[0155] 1)金标结合垫和样品垫的预处理：将玻璃纤维膜使用结合垫处理液润湿。润湿后，放置于37℃烘箱烘干过夜(至少8h)；

[0156] 2)包被膜的制作(划线)：将NC膜粘贴到PVC底板上，使用喷膜仪喷涂，将单抗使用划线稀释液稀释，按照1.0mL/cm喷于NC膜上，作为检测线。将羊抗鼠IgG用划线稀释液稀释，按照1.0mL/cm喷于NC膜上检测线下4.0mm处，作为质控线。将包被好的NC膜37℃干燥3h后，密封保存；

[0157] 3)组装试纸条，将样品垫、结合垫、NC膜、吸水纸等依次裁剪为合适宽度，按次序粘贴在洁净的PVC底板上，每个部分保证重叠2mm左右，确保样本液体的流动；

[0158] 4)切条取大板，使用切条机，将其切割成宽为4.0mm的试纸单条；

[0159] 5)组装把切好的试纸单条装配到塑料卡的底座凹槽，盖上塑料卡的上盖，压紧，再用压壳机进行压卡，形成试纸条，进行下一步实验。

[0160] 1.11.1胶体金抗体的筛选配对

[0161] 将本发明筛选得到的8株单抗分别作为金标抗体和拦截抗体进行交叉配对实验，4
按照金标抗体最适条件去制备试纸条，用10TCID50/mL的CCoV病毒液进行检测，观察试纸显色情况以确定备选的抗体配对组合。

[0162] 获得备选的抗体配对组合后，使用104TCID50/mL的CCoV病毒液、103TCID50/mL的CCoV病毒液、样本处理液、F81细胞上清，对上述备选的抗体配对组合进行检测，根据试纸条显色情况挑选灵敏度高，特异性强的配对即为最适抗体配对，用于后续实验。

[0163] 1.11.2金标结合物添加量的确定

[0164] 制备试纸条，其中检测线包被5B7抗体浓度为1mg/mL，质控线包被羊抗鼠抗体浓度为2mg/mL。往结合垫上滴加体积为2、4、6、8、10、12、15μL的金标结合物，制备CCoV‑N检测试纸条。用制备的试纸条检测同一份阴性样品和阳性样品，重复3次，根据试纸显色情况以确定金标结合物最佳添加量，同时用免疫分析仪检测T线胶体金信号强度，选择灵敏度高和特异性强的添加量为最佳添加量，用于后续实验。

[0165] 1.11.3NC膜的确定

[0166] NC膜根据其孔径和爬速可分为不同规格，影响着试纸条的灵敏度和特异性。购买市面上常见的4种NC膜型号，分别为Pall90、Pall120、CN95、CN140。制备试纸条，用相同C、T线浓度的抗体来划线4种NC膜，检测同一份阳性样品和阴性样品，重复3次，根据试纸显色情况以确定最佳NC膜的种类，同时用免疫分析仪检测T线胶体金信号强度，选择灵敏度高和非特异性弱的NC膜种类为最佳NC膜，用于后续实验。

[0167] 1.11.4检测线最佳包被抗体量的确定

[0168] 制备试纸条，固定质控线包被羊抗鼠抗体浓度为2mg/mL，分别将抗体稀释至1、1.5、2、2.5、3、4mg/mL来划线NC膜，组装成试纸条后，使用不同检测线(T线)包被浓度的试纸条检测同一份阳性样品，重复3次，根据试纸显色情况以确定T线最佳包被浓度。同时用免疫分析仪检测T线胶体金信号强度。T线信号达到稳定所需的最小抗体包被浓度为最佳检测线包被抗体量，用于后续实验。

[0169] 1.11.5质控线最佳包被抗体量的确定

[0170] 制备试纸条，固定检测线包被抗体浓度为2mg/mL，分别将抗体稀释至0.5、1、1.5、2、2.5、3mg/mL划线NC膜，组装成试纸条后，使用不同质控线(C线)包被浓度的试纸条检测同一份阳性样品，重复3次，根据试纸显色情况以确定C线最佳包被浓度。同时用免疫分析仪检测C线胶体金信号强度。C线信号达到稳定所需的最小羊抗鼠抗体包被浓度最佳质控线包被抗体量，用于后续实验。

[0171] 1.11.6反应时间的优化

[0172] 制备试纸条，检测线和质控线划线抗体浓度为最佳包被抗体量，金标结合物添加量为最佳添加体积。用所制备的试纸条检测同一个阳性样品，点样后于3min、6min、9min、12min、15min、20min、25min时间点，分别用免疫分析仪检测检测线和质控线处聚集胶体金信号，重复3次。取检测线和质控线信号稳定所需的最短时间为最佳反应时间。

[0173] 1.12胶体金试纸条质量检测

[0174] 1.12.1试纸条敏感性的确定

[0175] 使用上述实验的最佳条件制备试纸条，使用同一批试纸条，检测病毒含量为5 4
10 TCID50/mL的CCoV标准品，并且使用样本处理液10倍比稀释病毒液获得10 TCID50/mL、
3 2
10TCID50/mL、10TCID50/mL的样品，分别检测样品，观察显色结果，来确定样品的最低检测限。

[0176] 1.12.2试纸条特异性检测

[0177] 使用上述实验的最佳条件制备试纸条，使用同一批试纸条，分别检测犬常见病毒CCoV、CPV、CDV、CPIV、F81细胞上清以及阴性样品，观察显色结果，来检测试纸条的特异性。

[0178] 1.12.3试纸条稳定性检测

[0179] 制备试纸条，于37℃保存。分别在0d、10d、20d、30d用制备的试纸条检测同一份阳性样品，重复3次，观察试纸条的显色情况，同时用免疫分析仪检测T线胶体金信号强度，进行试纸条稳定性分析。

[0180] 1.12.4临床样品的检测

[0181] 用所研制试纸条检测47份犬粪便拭子，记录样品检测结果，与RT‑PCR检测结果比较，计算符合率。

[0182] 1.12.5与商业试纸条的比较

[0183] 使用病毒含量为105TCID50/mL的CCoV阳性样品和阴性样品，并且使用样本处理液4 3 2
10倍比稀释CCoV标准品获得10TCID50/mL、10TCID50/mL、10TCID50/mL的阳性样品。购买市面上某进口犬冠状病毒抗原检测胶体金试纸条，与本发明研制胶体金试纸条同时检测倍比稀释后的样品，比较检测结果并拍照记录比较。

[0184] 2结果与分析

[0185] 2.1CCoV‑N目的基因扩增

[0186] 以CCoV为模板扩增N基因，通过PCR获得带有NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点的扩增片段(1149bp)(图1)，与预期大小片段一致，由此表明CCoV‑N目的基因扩增成功。

[0187] 2.2pET‑30a‑CCoV‑N重组质粒的鉴定

[0188] 挑取五个单菌落进行培养，取培养后的菌液使用引物进行PCR鉴定结果如图2中的A所示，在1149bp处出现目的条带，与预期大小一致。将扩增的N基因与线性化载体pET‑30a同源重组连接，CCoV‑N重组表达载体双酶切鉴定结果如图2中的B所示，N基因和线性化载体pET‑30a分别在1149bp、5238bp处出现目的条带，与预期大小一致。扩大培养后提取质粒后测浓度，测序后比对序列显示100％正确，由此表明pET30a‑CCoV‑N重组质粒构建成功。

[0189] 2.3CCoV‑N重组蛋白的表达鉴定

[0190] 在阳性转化菌中加入IPTG进行诱导，SDS‑PAGE结果如图3中A显示在43kDa左右有目的蛋白条带，与预期大小一致，加入IPTG可以明显提高目标蛋白表达量；进一步将菌液超声破碎后分离上清和沉淀，SDS‑PAGE结果如图3中B显示，目的蛋白大部分存在于菌液上清中，以可溶性表达形式存在，有利于蛋白纯化。

[0191] 2.4CCoV‑N蛋白表达条件的优化

[0192] 2.4.1诱导温度对蛋白表达量的影响

[0193] 结果如图4所示，加入终浓度为1mmol/mL的IPTG，分别在16℃、20℃、24℃、30℃、37℃温度条件下诱导6h，超声破碎后以上清进行SDS‑PAGE，发现在37℃条件下，蛋白表达量最高。

[0194] 2.4.2诱导时间对蛋白表达量的影响

[0195] 结果如图5所示，加入终浓度为1mmol/mL的IPTG，分别在37℃温度下诱导2h，4h，6h，8h，10h后将菌液超声破碎，将上清进行SDS‑PAGE，得到在37℃诱导8h时，蛋白表达量最高。

[0196] 2.5不同浓度IPTG诱导对蛋白表达量的影响

[0197] 分别加入0.2mmol/mL、0.6mmol/mL、1mmol/mL、1.5mmol/mL、2mmol/mL终浓度IPTG后的结果如图6所示，在37℃诱导8h后的条件下，可以得到在终浓度为0.6mmol/mL的IPTG，蛋白表达量最高。

[0198] 2.6CCoV‑N重组蛋白的纯化鉴定

[0199] 根据优化后的条件对菌液进行大量表达，将菌液以Ni+亲和层析纯化后，经SDS‑PADE鉴定结果如图7所示。在43kDa左右有目的蛋白条带，与预期大小一致，流穿液和洗杂液对照结果正常，100％Elution Buffer洗脱的蛋白量较高，且纯化效果良好，获得了纯度较高的N蛋白。

[0200] 2.7CCoV‑N重组蛋白的抗原特异性分析

[0201] 以CCoV小鼠阳性血清做一抗，对CCoV‑N重组蛋白的抗原性进行WesternBlot验证。结果如图8所示，在43kDa左右有目的蛋白条带，与预期大小一致，表明CCoV‑N重组蛋白具有良好的抗原特异性。

[0202] 2.8建立间接ELISA检测方法

[0203] 以阳性血清的OD值作为P值，阴性血清的OD值作为N值，计算每个孔的P/N值。如表3所示，P/N值最大时的条件为血清稀释度为1：800，抗原稀释度为0.5μg/mL，选取此条件用于后续阳性杂交瘤的筛选。

[0204] 表3间接ELISA检测方法的建立

[0205]

[0206]

[0207] 2.9免疫小鼠血清效价测定结果

[0208] 用建立的间接ELISA法检测免疫小鼠血清效价，如图9所示，3只小鼠的血清效价均5
达到10，均符合融合条件，其中选取血清效价最高的2号小鼠进行细胞融合。

[0209] 2.10阳性杂交瘤细胞筛选与亚克隆

[0210] 如图10中A‑C所示，细胞融合后第3d开始可以观察到融合成功的杂交瘤细胞开始聚团，之后在第6d的时候杂交瘤细胞变得透明，清亮，到第10d的杂交瘤细胞聚集成一个大的细胞团，收集杂交瘤细胞上清通过间接ELISA进行筛选，将OD值高的细胞孔通过有限稀释进行亚克隆培养。经过三次亚克隆后获得了8株杂交瘤细胞株，将其命名为3D10、4A8、6D9、5B7、7E2、5A6、4H2、4B6。其中，3D10，4A8，6D9，7E2，5B7，5A6的阳性杂交瘤细胞形态良好，如图10中D所示；4H2、4B6阳性杂交瘤细胞形态见图31。

[0211] 2.11阳性杂交瘤细胞染色体数目鉴定

[0212] 3D10，4A8，6D9，7E2，5B7，5A6阳性杂交瘤细胞的染色体数目结果如图11所示，通过对染色体计数可以得出6株阳性杂交瘤细胞的染色体数目均在98±5条之间，符合杂交瘤染色体数目，说明属于杂交瘤细胞。4H2、4B6的染色体数目结果如图32，通过对染色体计数可以得出2株阳性杂交瘤细胞的染色体数目均在98±5条之间，符合杂交瘤染色体数目，说明属于杂交瘤细胞。

[0213] 2.12杂交瘤细胞上清测定结果

[0214] 通过间接ELISA对杂交瘤细胞上清进行效价检测，3D10，4A8，6D9，7E2，5B7，5A6的12 4
杂交瘤细胞上清效价检测结果如图12所示，3D10的效价最高为2 ，5A6的效价最低为2，其
9 11 10 11
余抗体效价在2‑2 之间。4H2、4B6杂交瘤细胞上清效价检测结果显示效价分别为2 、2 。

[0215] 2.13单抗的腹水效价测定结果

[0216] 3D10，4A8，6D9，7E2，5B7，5A6单抗腹水效价检测结果如图13所示：3D10、4A8、5A6的6 4 5 5
效价最高为10，5B7、7E2的效价最低为10，6D9的效价为10。4H2、4B6的效价均为10。

[0217] 2.14单克隆抗体的亚型鉴定

[0218] 如表4所示，3D10，6D9，7E2，5B7，5A6的抗体亚型均为IgG1，4A8为IgG2a，轻链类型均为κ链。4H2、4B6的抗体亚型均为IgG1，轻链类型均为κ链。

[0219] 表4单抗的亚型结果

[0220]抗体 亚型 轻链
3D10 IgG1 κ
4A8 IgG2a κ
6D9 IgG1 κ
5B7 IgG1 κ
7E2 IgG1 κ
5A6 IgG1 κ
4H2 IgG1 κ
4B6 IgG1 κ

[0221] 2.15单克隆抗体的间接免疫荧光实验

[0222] 如图14所示，筛选到的CCoV‑N蛋白单克隆抗体3D10，4A8，6D9，7E2，5B7，5A6能与CCoV感染细胞反应，在倒置荧光显微镜下呈现特异性荧光。4H2(A)、4B6(B)的CCoV‑N蛋白单克隆抗体，能与CCoV感染细胞反应，在倒置荧光显微镜下呈现特异性荧光，如图29所示。

[0223] 2.16单克隆抗体的Westernblot鉴定

[0224] 3D10，4A8，6D9，7E2，5B7，5A6的结果如图15所示，筛选到的CCoV‑N蛋白单克隆抗体均能识别病毒的特异性蛋白条带，分子量约为70kDa(磷酸化N蛋白)。筛选到的4H2(A)、4B6(B)CCoV‑N蛋白单克隆抗体均能识别病毒的特异性蛋白条带，分子量为70kDa(磷酸化N蛋白)，结果如图30所示。

[0225] 2.17纯化的腹水鉴定

[0226] 3D10，4A8，6D9，7E2，5B7，5A6的鉴定结果如图16所示，腹水纯化后的单抗在50kDa处有一条带，为单抗重链，20‑25kDa之间有一条带为单抗轻链，符合实验预期结果，且纯化效果良好。纯化后的单抗经过超滤浓缩浓度都在1mg/mL以上。4H2、4B6的鉴定结果如图33所示。

[0227] 2.18胶体金溶液的制备及检验

[0228] 本发明计划采用的是40nm粒径的胶体金溶液，如图17中的A所示，肉眼观察胶体金溶液其外观为酒红色、透明状；使用紫外可见分光光度计进行仪器鉴定，在400‑600nm之间进行扫描，分析胶体金溶液的吸收光谱，如图17中的B所示，其为一个单峰，且最大吸收峰波长为524nm。结果表明，本发明制备的胶体金溶液性能良好，符合试验要求。

[0229] 2.19金标抗体的最佳pH值与最佳标记抗体浓度

[0230] 在加入20μl10％NaCl溶液，温和混匀，室温静置5min后，如图18所示可以观察到不同孔内的金标结合物之间的颜色发生了变化，选择金标结合物颜色更接近原来胶体金溶液的酒红色和紫外吸光值最高的孔对应的条件为最佳条件，以每2mL的胶体金溶液对应的0.2MK2CO3添加量和添加200μl的抗体浓度为基准，筛选得到的8株单抗作为金标抗体时的最佳金标pH和最佳标记蛋白量如表5所示。

[0231] 表5单抗的最佳金标pH和最佳标记蛋白量

[0232]

[0233]

[0234] 1.20胶体金最适抗体对的选择

[0235] 抗体两两配对后，选取最适条件制备成试纸条，用104TCID50/mL的CCoV病毒液进行检测，选如图18所示，选择抗体对组合：金标抗体：4A8，拦截抗体：4B6，进行进一步实验。对4 3
初步选择的两组抗体对，使用10 TCID50/mL的CCoV病毒液、10TCID50/mL的CCoV病毒液、阴性样品、F81细胞上清进行检测，如图18所示。

[0236] 2.21最佳NC膜的确定

[0237] 不同种类的NC膜其灵敏度和特异性都不同，为了确定试验最佳NC膜，检测同一份阳性样品和阴性样品，反应结果如图19所示，选择灵敏度较高和特异性较高的CN95作为最佳NC膜，用于后续实验。

[0238] 2.22金标结合物最佳添加体积的确定

[0239] 随着金标结合物添加体积的增加，T线检测线的抗体捕获量金标结合物的量也增加，敏感性也会随之上升；但是如果金标结合物的添加体积过多，则试纸条非特异性吸附也会增加。预处理的金标结合垫喷金不同体积的金标结合物检测相同的阳性和阳性样品，比较试纸条显色情况及检测信号。反应结果如图20所示，选择8μl作为最佳添加体积，用于后续实验。

[0240] 2.23T线拦截抗体最佳包被浓度的选择

[0241] 制备试纸条后检测同一份阳性样品和阴性样品，比较试纸条显色情况及检测信号。如图21所示，随着T线浓度的增加，试纸条显色程度和检测信号都会随之增加，在T线浓度处于较高水平时，其可以完全捕获抗原，试纸条显色程度和检测信号差异不大，但同时T线非特异性吸附也会增强。考虑到成本浪费和非特异性的情况，选择2mg/mL浓度为最佳T线包被抗体浓度。

[0242] 4.24C线抗体最佳包被浓度的选择

[0243] 分别以0.5、1、1.5、2、2.5、3mg/mL浓度的羊抗鼠IgG抗体包被NC膜，同时固定T线抗体浓度为2mg/mL，进行C线包被浓度的优化。制备试纸条后检测同一份阳性和阴性样品，比较试纸条显色情况及检测信号。结果如图22所示，随着C线抗体浓度的增加，试纸条显色程度和检测信号都会随之增加，在T线浓度处于较高水平时，其可以完全捕获抗原，试纸条显色程度和检测信号差异不大。因此选择2.5mg/mL抗体浓度为C线最佳抗体包被量。

[0244] 2.25最佳反应时间的确定

[0245] 使用上述试验试纸条优化后的条件制备一批试纸条，检测同一批阳性样品，比较试纸条显色和检测信号，来优化反应时间，获得试纸条最佳观察检测效果。结果如图23所示，随着反应时间的增加，T线和C线试纸条的显色程度和检测信号都会随之增加，当反应时间为15min时，T线和C线试纸条显色程度和检测信号差异不大，因此选择15min作为试纸条结果判读的最佳反应时间。

[0246] 2.26胶体金试纸条的敏感性评价

[0247] 使用上述试验试纸条优化后的条件制备一批试纸条，将病毒含量为105TCID50/mL的CCoV标准品，分别按原液，1：10，1：100，1：1000使用样本处理液进行稀释，样本处理液作为阴性对照，用试纸条进行检测，观察试纸条显色情况。结果如图24所示，按1：100稀释的CCoV标准品用试纸条检测时T线仍有微弱条带，而按1：1000稀释的CCoV标准品用试纸条检3
测时T线仍已无条带。因此该试纸条敏感性良好，病毒含量为10 TCID50/mL时为本发明试纸条的最低检测限。

[0248] 4.27胶体金试纸条的特异性评价

[0249] 按照优化后的条件进行试纸条的制备，检测样品鉴定试纸条特异性。结果如图25所示，只有待检样品中含CCoV抗原时，检测线(T线)和质控线(C线)均显色且T/C值较高，而检测含其他病毒抗原时，仅质控线(C线)显色，而检测线(T线)不显色，由此表明本发明抗原检测试纸具有较高的特异性。

[0250] 2.28胶体金试纸条的稳定性评价

[0251] 对放置在37℃的胶体金试纸条，分别在0d、10d、20d、30d检测同一份阳性样品，结果如图26所示，该试纸条在不同天的C、T线亮度没有明显区别，由此表明本发明试纸条的稳定性良好。

[0252] 2.29临床样品的检测

[0253] 对收集的47份犬粪便拭子分别使用本发明研制的试纸条和RT‑PCR方法进行检测，对结果进行分析比较，RT‑PCR检测结果如图27所示，47份犬粪便拭子中有18份阳性，29份阴性。在对本发明研制的试纸条的检测结果比较后，结果如表6所示，试纸条检测47份犬粪便拭子中有21份阳性，26份阴性，因此本发明研制的试纸条与RT‑PCR方法的总符合率有89.36％。

[0254] 表6临床样品检测

[0255]

[0256] 2.30与商品化试纸条比对

[0257] 购买某进口品牌犬冠状病毒胶体金试纸条，与本发明研制出的试纸条检测不同病3
毒量的CCoV病毒液，结果如图28所示，当检测病毒量为10TCID50/mL的CCoV病毒液时，本发明研制的试纸条仍有肉眼可见条带，而商品化试纸条已无条带。由此可见，本发明试纸条的敏感性优于商品化试纸条，约10倍。即本发明研制的试纸条的检测效果优于商品化试纸条。

[0258] 本发明成功构建pET‑30a‑CCoV‑N重组质粒，并原核表达CCoV‑N重组蛋白，免疫后筛选得到6株高效、高亲和力、高特异性的抗CCoV‑N单克隆抗体，分别命名为3D10、4A8、6D9、5B7、7E2、5A6，后续使用4A8作为金标抗体时具有良好的特异性和敏感性。本发明利用4A8和
4B6抗体对分别作为金标抗体和拦截抗体，建立了犬冠状病毒胶体金试纸条检测方法，杂交瘤细胞株4A8，保藏编号为CCTCCNO：C2024304，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学；杂交瘤细胞株4B6，保藏编号为CCTCCNO：C2024305，保藏于中国典
3
型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。最低检测限为10 TCID50/mL，且与CDV、CPV和CPIV无交叉反应，15min内可以提供结果，具有良好的敏感性及特异性。将本发明的试纸条进一步对47份临床样本进行检测，结果显示本发明胶体金试纸条的总符合率为
89.36％。

[0259] 实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。