[0001] 本发明涉及一种动物胚胎的培养液及其应用，尤其涉及胚胎冷冻前降脂的培养液及其制备方法和在提高胚胎冷冻‑解冻后的存活率或孵化囊胚率中的应用，属于动物胚胎的培养液领域。

[0002] 体内胚胎是指雌性动物配种后，体内的卵母细胞受精发育形成的胚胎。首次配种后第6天，使用冲胚液冲洗子宫角，并在体式显微镜下镜检冲胚液，可获得胚胎龄为第6天的胚胎，发育时期以桑葚胚为主。

[0003] 猪胚胎中高脂质含量是物种相关的细胞特性。然而，高脂质含量也被认为是制约猪胚胎冷冻效率提升的重要因素。胚胎冷冻保存技术主要通过将早期胚胎在极低温度的条件下保存，能够长期维持其活力和发育潜力。目前，冷冻胚胎的移植已在20多个物种上获得存活后代；牛、羊的胚胎冷冻已成熟的应用于商业化引种。胚胎冷冻保存中，胞内大量的脂质阻碍了冷冻保护剂的渗透，限制了胚胎玻璃化的效果，是猪胚胎冷冻后细胞活性与发育潜能丧失的主要原因之一，造成了猪的胚胎冷冻效率低于牛、羊等家畜的现状，是猪繁殖与种质资源保护中亟待突破的难题。在保证胚胎发育潜能不受损的前提下，实现胚胎降脂，改善降脂后的胚胎冷冻效果，是猪胚胎冷冻保存亟待解决的问题。

[0004] 胚胎降脂主要分为侵入式显微操作与非侵入式脂质调控。早期的侵入式显微操作方法是，通过高速离心使脂质极化并经显微注射针抽出，以此达到去脂的目的。尽管该方法去脂效果显著，但高速离心导致胚胎发育不良，显微注射造成的透明带破损会损害细胞发育潜能，亦会增加病原污染风险。因此，利用胚胎生物学活性，实现非侵入式的降脂，是兼顾猪胚胎降脂与冻胚存活发育的最佳解决办法。

[0025] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

[0026] 实施例1胚胎冷冻前降脂的培养液的制备

[0027] (1)取60mL超纯水，加入0.6356g氯化钠，0.2106g碳酸氢钠，0.0356g氯化钾，0.0162g磷酸二氢钾，0.0294g七水合硫酸镁，0.0250g二水合氯化钙，0.1000g D‑葡萄糖，
0.0876g牛磺酸，0.0546g亚牛磺酸，1.0000mL浓度为10000IU/mL的青霉素链霉素溶液，调节pH值为7.2，超纯水定容至100mL；

[0028] (2)0.22μm滤器过滤，加入0.4000g牛血清白蛋白；

[0029] (3)0.0018g苯扎贝特加入500μL无水胆酸(10mM in DMSO)，溶解后加入100mL NCSU23培养液，即得；

[0030] (4)该培养液4℃保存不超过1个月。

[0031] 试验例1动物胚胎培养液在降低胚胎内的脂质含量、提高胚胎冷冻‑解冻后的存活率和孵化囊胚率的试验

[0032] 1试验方法

[0033] 1.1供试验用的胚胎培养液：

[0034] (1)胚胎培养液1：实施例1制备的胚胎培养液1；(2)胚胎培养液2：除了没有胆酸，其他的成分以及制备方法均与实施例1制备的胚胎培养液1完全相同；(3)胚胎培养液3：除了没有苯扎贝特，其他的成分以及制备方法均与实施例1制备的胚胎培养液1完全相同；(4)胚胎培养液4：将实施例1制备的胚胎培养液1中苯扎贝特替换为同浓度的L‑肉碱得到的胚胎培养液；(5)胚胎培养液5：将实施例1制备的胚胎培养液1中苯扎贝特替换为同浓度的烟酸得到的胚胎培养液；(6)胚胎培养液6：将实施例1制备的胚胎培养液1中胆酸替换为同浓度的L‑肉碱得到的胚胎培养液：(7)胚胎培养液7：将实施例1制备的胚胎培养液1中胆酸替换为同浓度的烟酸得到的胚胎培养液；(8)NCSU23培养液(作为对照)。

[0035] 1.2试验方法

[0036] 猪体内胚胎的获取、孵育及冷冻处理：

[0037] 采用配种或人工授精的方法使母猪受孕。配种或人工授精后第6天，使用冲胚液以常规外科手术方法母猪实施子宫角冲洗，或处死母猪后立即完整取出子宫与卵巢，并以冲胚液冲洗子宫角；收集冲洗后的冲胚液，体式显微镜下镜检，即可获得发育时期为桑葚胚期的猪体内胚胎。

[0038] 将冷冻前降脂的培养液置于38.5℃、5％二氧化碳环境下预热1h。将桑葚胚从冲胚液中转移所述冷冻前降脂的培养液中，置于38.5℃、5％二氧化碳环境下孵育6h，用常规胚胎培养液洗3遍，即可用于冷冻。

[0039] 冷冻：胚胎转移至玻璃化冷冻液Ⅰ(NCSU23培养液中添加20％胎牛血清、7.5％二甲基亚砜和7.5％乙二醇)中维持3min，转移至玻璃化冷冻液Ⅱ(NCSU23培养液中添加20％胎牛血清、15％二甲基亚砜、15％乙二醇和397mM蔗糖)中维持10s，装载至冷冻载杆上，投入液氮中。

[0040] 解冻：将冷冻载杆提出液氮，胚胎装载端立即浸入解冻液Ⅰ中使胚胎脱离冷冻载杆，胚胎在解冻液Ⅰ(NCSU23培养液中添加20％胎牛血清和300mM蔗糖)中维持5min，转移至解冻液Ⅱ(NCSU23培养液中添加20％胎牛血清和150mM蔗糖)中维持5min，用常规胚胎培养液洗3遍，置于常规胚胎培养液中孵育6～12h。

[0041] 利用尼罗红荧光染料对胚胎内的脂滴染色，利用Hoechst33342荧光染料对胚胎内的细胞核染色，利用激光扫描共聚焦显微镜拍摄并定量胚胎内的脂滴和细胞核，采用Image J软件将图像数据化，IBM SPSS Statistics软件执行单因素ANOVA分析，结果以平均值±标准误表示并作统计图。

[0042] 2试验结果

[0043] 2.1降低胚胎内的脂质含量试验结果

[0044] 由图1‑A，图1‑B可知，单独添加苯扎贝特或单独添加胆酸的培养液孵育胚胎，均能略微降低胚胎脂质含量，但与采用NCSU23培养液(不添加其他任何成分)孵育的胚胎对照组统计学差异不显著；然而，实施例1制备的胚胎培养液1同时含有苯扎贝特与胆酸，孵育猪体内胚胎6h能显著降低胚胎内脂质含量；因此，实施例1制备的胚胎培养液1中苯扎贝特与胆酸的联合应用对猪胚胎降脂有协同增效作用。

[0045] 由图1‑A，图1‑C可知，发挥降脂作用的药剂配伍是苯扎贝特和胆酸时，孵育后的胚胎脂质含量是各种药剂配伍结果中最低的，降脂效果最高；当苯扎贝特与胆酸中任意一种被替代时，孵育后的胚胎脂质含量均与新鲜对照无显著差异，降脂效果不如实施例1制备的胚胎培养液1。

[0046] 胚胎在冷冻解冻后的脂质含量测定的试验结果如图2‑A，图2‑B所示，实施例1制备的培养液孵育的胚胎在冷冻解冻后，胚胎内脂质含量显著少于冷冻胚胎对照。

[0047] 2.2胚胎冷冻‑解冻后的存活率和孵化囊胚率的试验结果

[0048] 胚胎细胞分裂能力测定的试验结果如图2‑A，图2‑C所示，实施例1制备的胚胎培养液1孵育的胚胎在冷冻解冻后置于NCSU23培养液中培养12h，胚胎细胞分裂能力显著高于采用NCSU23培养液(不添加其他任何成分)孵育后冷冻解冻再在NCSU23培养液中培养12h的胚胎。

[0049] 对冷冻解冻的胚胎进行形态学观察鉴定，若胚胎胞质由聚缩的玻璃态恢复扩张并出现囊胚腔，且胚胎形态完整、轮廓清晰、色调及细胞密度良好，则视为存活。观察鉴定结果如图3所示，实施例1制备的胚胎培养液1孵育胚胎6h后，91.30％的桑葚胚发育为早期囊胚或囊胚。经实施例1制备的胚胎培养液1孵育的胚胎冷冻解冻后6h存活率达75.76％，显著高于使用NCSU23培养液孵育的胚胎冷冻解冻后6h存活率60.61％。经实施例1制备的胚胎培养液1孵育的胚胎冷冻解冻后12h，66.67％的胚胎发育为扩张囊胚和孵化囊胚，显著高于使用NCSU23培养液孵育的胚胎冷冻解冻后12h存活率42.42％。