[0001] 本发明属于细胞器分离技术领域，具体涉及一种基于微流控芯片的过氧化物酶体分离富集方法。

[0002] 过氧化物酶体由J. Rhodin（1954年）首次在鼠肾小管上皮细胞中发现，是一种具有异质性的细胞器，在不同生物及不同发育阶段有所不同；直径约0.2‑1.5μm，通常为0.5μm，呈圆形，椭圆形或哑呤形不等，由单层膜围绕而成；共同特点是内含一至多种依赖黄素（flavin）的氧化酶和过氧化氢酶（标志酶），已发现40多种氧化酶，如L–氨基酸氧化酶，D–氨基酸氧化酶等等，其中尿酸氧化酶（urate oxidase）的含量极高，以至于在有些种类形成酶结晶构成的核心。科学研究中对于过氧化物酶体及其中微量物质的研究通常需要将其从胞浆中分离进行详细研究，目前过氧化物酶体的分离技术主要原理是通过超速离心实现。

[0003] 现有的基于超速离心的分离方法，虽然能分离出大多数过氧化物酶体，但需要大量的细胞以及超速离心之前进行细胞膜破碎，耗时较长且精密度不高；过氧化物酶体分离试剂盒步骤繁琐且价格较高。

[0027] 以下结合具体实施方式和附图对本发明的技术方案作进一步详细描述。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

[0028] 实施例1微流控芯片
参照图1‑2，本实施例提供一种微流控芯片，包括芯片主体，芯片主体设有微流道，微流道包含有依次连通的裂解模块10、孵育模块20和分选模块30；
裂解模块10配置有第一入口13，用于细胞悬液进液；裂解模块10配置有第一流道
11，用于连接第一入口13与孵育模块20，第一流道11的内部设有若干缩口12；
孵育模块20的起始端配置有第二入口14，用于磁珠颗粒的进样；磁珠的磁珠表面包被有抗体、抗原或二抗；
分选模块30配置有第一出口31和第二出口32用于出液；分选模块30配置有磁体
33，用于吸附磁珠，磁体33设于分选模块30远离第一出口31的一侧。

[0029] 进一步的，第一出口31与第二出口32成Y型分布。

[0030] 进一步的，第一流道11内的若干缩口阵列设置，并且靠近第一入口13的缩口12尺寸大于靠近孵育模块20的缩口12尺寸。

[0031] 进一步的，多个第一流道11并列设置。

[0032] 进一步的，孵育模块20包括第二流道21，第二流道21弯曲设置。

[0033] 具体的，芯片主体长123mm，宽51mm；包括设于底板和盖板，底板为厚度1mm的载玻片，盖板为厚度4mm的PDMS层，微流道设于盖板的内部；第一入口13、第二入口14、第一出口31、第二出口32均与外界连通。

[0034] 具体的，裂解模块10中设置有上下对称的两个第一流道11，第一流道11的内部包括30个沿细胞悬液流向阵列设置的缩口12；沿细胞悬液流向依次设置的缩口12每10个缩口12为一个单位；其中，靠近第一入口13的10个缩口12尺寸为20μm，靠近孵育模块20的10个缩口12尺寸位5μm，位于这两部分阵列之间的10个缩口12尺寸为10μm。

[0035] 实施例2微流控芯片
本实施例提供的微流控芯片与实施例1相比而言，区别在于：
芯片主体长120mm，宽50mm；底板为厚度2mm的载玻片，盖板为厚度6mm的PDMS层。

[0036] 第一流道11的内部包括48个沿细胞悬液流向阵列设置的缩口12；其中，沿细胞悬液流向依次设置的缩口12每8个缩口12为一个单位；并且沿细胞悬液流向依次设置的的6个缩口单位的尺寸依次为30μm、15μm、8μm、4μm、2μm、1.5μm。

[0037] 实施例3表面结合有PMP70抗体的磁珠的制备
使用磁珠捕获细胞内的过氧化物酶体，是基于非竞争结合测定中的双抗体夹心
法，以及竞争法测定抗体或抗原。通常，这一方法包括以下步骤：1）将特异性抗体与固相载体联接，形成固相抗体，洗涤出去未结合的抗体以及杂质。2）加入待检试样，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物，洗涤出去其它未结合物质。3）加入酶标抗体，保温反应。固相抗原抗体复合物上的抗原与酶标抗体结合，洗涤出去未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。4）加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物，通过比色测知标本中抗原的量。

[0038] 本例采用购自海狸纳米科技(苏州)有限公司的Strep‑Tag II 蛋白纯化磁珠，悬液浓度为10%（v/v）磁珠悬液，磁珠粒径30 150 μm，配基含量为：6 mg Strep‑Tactin /mL ~ ~Gel；融合蛋白结合量为：7 mg Strep‑tag II 蛋白 /mL Gel。具体包括以下步骤：
~
S(1)：取1mL上述磁珠悬液，加入1:1000稀释的IgG 1mL，此处IgG为小鼠来源的抗PMP70抗体，稀释液为缓冲溶液Ⅰ（缓冲溶液Ⅰ以PBS作为溶剂，并含有PMSF 1mM，DTT1mM，EDTA5mM）；漩涡混匀器上，150r/min，漩涡振荡15s，使磁珠重新悬浮后，37℃温育30min，使得Strep‑tag II 蛋白与IgG结合。

[0039] 然后，将上述混合液置于磁性分离器上，待溶液澄清后，移去上清液，然后加入2mL缓冲溶液Ⅰ，漩涡混匀器上，150r/min混合1min后，将上述混合液置于磁性分离器上，待溶液澄清后，移去上清液，如此洗涤2次除去未结合的IgG。

[0040] S(2)：在S(1)中所得磁珠中加入1:1000稀释的PMP70抗体 1mL，此处PMP70抗体为小鼠来源，稀释液为缓冲溶液Ⅰ；漩涡混匀器上，150r/min，漩涡振荡15s，使磁珠重新悬浮，37℃温育30min，使得PMP70抗体定向连接到IgG的Fab结构域，形成表面结合有PMP70抗体的磁珠‑抗抗体‑抗体复合物。

[0041] 然后，将上述混合液置于磁性分离器上，待溶液澄清后，移去上清液，然后加入2mL缓冲溶液Ⅰ，漩涡混匀器上，150r/min混合1min后，将上述混合液置于磁性分离器上，待溶液澄清后，移去上清液，如此洗涤2次除去未结合的PMP70抗体。然后再在其中加入加入2mL缓冲溶液Ⅰ，漩涡混匀器上，150r/min混合10min后，即得表面结合有PMP70抗体的磁珠复合物悬液。

[0042] 实施例4过氧化物酶体分离方法
采用实施例1中的微流控芯片分选HepG2细胞中的过氧化物酶体；包括以下步骤：
S1. 配制细胞悬液：取购自广州艾迪基因科技有限责任公司的HepG2细胞，经复苏、传代培养后，在超净台内消化至单细胞悬液，经吹打混合均匀后进行细胞计数；然后
1100 rpm，25℃离心4min，弃去上清液，用1 2mL 4℃预冷的冻存液重悬细胞，随后加入冻存~
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液调整至密度为1×10个细胞/mL的细胞悬液，备用。

[0043] S2. 加样：采用电子泵，将S1中所得细胞悬液经第一入口13泵入微流控芯片内部，流速1mL/min，进样量为2mL；经第二入口14向微流控芯片内部泵入分离系统悬液，流速1mL/min，进样量为2mL。

[0044] 其中，分离系统悬液为采用实施例3中配置的表面结合有PMP70抗体的磁珠复合物悬液，磁珠的表面结合有PMP70抗体。

[0045] HepG2细胞悬液经第一入口13进入裂解模块10后，在通过第一流道11内部的缩口12时，在剪切力作用下破裂，释放其中的过氧化物酶体。

[0046] S3. 反应：自第一流道11进入微流道的细胞裂解液与自第二入口14进入微流道的分离系统悬液在孵育模块20汇合，形成混合液，细胞裂解液中的过氧化物酶体可通过过氧化物酶体膜上的抗原与分离系统悬液内磁珠表面的PMP70抗体进行强结合，从而结合在磁珠表面。

[0047] S4. 分选：S3中的混合液进入分选模块30，磁珠以及附于其表面的结合物在磁体33的作用下经由第二出口32流出，混合液中的其余成分经由第一出口31流出。

[0048] S5. 洗脱：收集第二出口32的混合液，将上述混合液置于磁性分离器上，待溶液澄清后，移去上清液，然后加入2mL缓冲溶液Ⅰ，漩涡混匀器上，150r/min混合1min后，将上述混合液置于磁性分离器上，待溶液澄清后，移去上清液，如此洗涤2次后，在其中加入2.5mM的生物素Biotin，分离系统悬液用量与生物素溶液用量的体比为1:5；漩涡混匀器上，150r/min，混合10min，进行竞争性洗脱；然后将混合液置于磁性分离器上，磁性分离，收集上清液，实现对过氧化物酶体的富集。

[0049] 本例采用基于微流控芯片，采用表面结合有PMP70抗体的磁珠实现对过氧化物酶体的分离和富集，操作过程简单，无需超速离心处理，并且具有有较强的特异性与便捷性，适用于细胞过氧化物酶体分离，对于小量细胞也可特异分离，在芯片中还可达到无菌分离的目的，对于后续无菌需求的研究具有潜在应用价值。

[0050] 本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。

[0051] 以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。