技术领域
[0001] 本发明属于生物检测技术领域，具体涉及定量检测基质金属蛋白酶7(MMP‑7)的荧光层析试纸条、试剂盒及应用。
相关背景技术
[0002] 基质金属蛋白酶7(MMP‑7)是基质金属蛋白酶家族中重要的一员，以酶原形式分泌，正常生理条件下，MMP‑7联合其特异的基质金属蛋白酶抑制物共同维持细胞外基质的稳态。MMP‑7在正常健康肝脏组织中存在较少，但在胆道闭锁(Biliary Atresia，BA)和肝纤维化的肝组织中表达水平大大增加，主要分布在BA患儿的胆管上皮Kuffer细胞及内皮细胞。当胆管受梗阻或炎症损伤时，胆管上皮细胞向管腔内释放MMP‑7，此时血清学可检测到MMP‑
7水平的升高。最新多项研究已经证实，将血液中的MMP‑7作为标志物，用于BA的诊断具有良好的准确性和临床应用前景。
[0003] BA是严重威胁婴儿生命的胆道梗阻性疾病，2023年9月被列入国家卫生健康委员会、国家药品监督管理局等6部门联合发布的《关于公布第二批罕见病目录》。葛西手术是目前治疗胆道闭锁的有效手段，但手术时患儿的年龄起关键作用，早期明确诊断并且施行手术可显著改善患儿预后，否则预后大多不良，因此胆道闭锁的早期诊断尤为重要。我国2022年发布的《胆道闭锁诊断与治疗循证实践指南》推荐胆汁淤积患儿行基质金属蛋白酶7(MMP‑7)诊断胆道闭锁。对于胆道闭锁患儿而言，手术后的定期随访也具有非常重要的意义，可及早发现康复过程中出现的问题，提高自体肝生存率。
[0004] 由于BA是一种进行性肝内、外胆管纤维化疾病，该病表现为黄疸、肝肿大、胆汁性便，这些临床症状与其它非BA的胆汁淤积性肝病非常相似，国际上尚无可靠的无创诊断方法将BA与其它原因引起的胆汁淤积症区分开来。目前，临床上用于BA诊断的金标准确诊方法为术中胆管造影和肝活检，均属于侵入性检测，该检测手段易使病人遭受痛苦，且需由临床经验非常丰富的专家医师结合医疗影像等辅助设备手工操作，对于经济欠发达地区，由于医疗设施资源相对落后，诊疗水平有限的医疗单位，将难以开展上述医疗诊断工作，不利于BA患者的及时确诊，容易错过施行葛西手术的最佳窗口期。为此，开发一种安全、有效、快捷的可无创诊断BA的方法，将会让非BA的胆汁淤积性肝病患者避免侵入性手术检查等过度诊疗，减轻病人痛苦，并且可尽早识别BA患者，及时施行葛西手术，改善患儿预后提高自体肝生存率。
[0005] 中国申请CN108267585A公开了一种基于血清标志物MMP‑7的胆道闭锁诊断试剂盒，其中包含抗人单克隆抗体包被的酶标板、阴性对照液、阳性对照液、酶标试剂、酶底物溶液、封闭液、样品稀释液、洗涤液和终止液。所述试剂盒能定量测定人血清中MMP‑7水平，有助于早期诊断BA。但是，该试剂盒仅适用于检测血清样本类型，不能用于检测血浆和全血样本。其次，该试剂盒基于酶联免疫吸附实验方法(ELISA)，该方法操作步骤繁琐，涉及多次的加样孵育反应和洗涤操作，如果洗涤不彻底极易造成假阳性结果，并且每次检测都需同时设置校准品孔和制备标准曲线，增加了检测操作者的工作负担，降低了试剂盒的使用效率。另外，操作费时，不包含样本预处理时间，仅完成1份样本的检测时间，至少需要耗费3.5小时以上，且需要专业检测人员在实验室借助酶标仪等设备进行操作，不适合床旁即时诊断(POCT)的推广使用。
[0006] 中国申请CN115561458A公开了一种用于诊断胆道闭锁的胶体金快速检测卡，所述检测卡包括顺次搭接于底板上的样品垫、金标结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫等组分。所述检测卡可用于对人血清/血浆或全血样本中MMP‑7的快速检测，适用于现场对胆道闭锁患者的快速筛查和辅助诊断。但是，该申请中的检测方法只能做为胆道闭锁的定性检测，系采用双抗体夹心法原理检测样本中MMP‑7抗原，涉及的检测抗体和捕获抗体，均为利用传统小鼠杂交瘤细胞融合技术制备得到的鼠源单克隆抗体，而应用双鼠单克隆抗体建立的夹心检测抗原的方法，待检样本中可能会存在人抗小鼠抗体的干扰反应(HAMA)，导致产生假阳或假阴性的检测结果。另外，由于本申请中的试剂盒检测方法仅用于定性检测，因此对处于BA诊断临界值附近的灰区样本，诊断结果难以判定，容易出现假阴或假阳结果，造成误诊。
[0007] 荧光免疫层析检测方法，相校于现有的用于诊断BA的临床金标准方法，如术中胆管造影、肝活检方法，克服了需侵入性检测，需配备昂贵的仪器设备，需专业临床医师进行检测操作等弊端。同时，相较于基于免疫学原理的其它检测方法，如酶联免疫法、胶体金法，克服了检测过程操作步骤繁琐，需专业检测人员进行检验操作，以及临界值灰区样本的检测准确度不高和检测结果难以判读等不足。另外，由于MMP‑7属于MMP大家族成员，与其它主要家族成员具有类似的结构和特性，容易产生交叉反应性。因此，对用于建立夹心法检测MMP‑7抗原所使用的抗体，就要求具有较高的灵敏度和特异性，且抗干扰能力强，而兔子相较于其它常用动物模型如小鼠拥有更强大的免疫系统，产生的抗体具有更高的灵敏度、特异性、亲和力以及多样性。
[0008] 目前，获取较高灵敏度和特异性好的抗人MMP‑7兔单克隆抗体，并能够应用到双抗夹心荧光免疫层析方法，制备成抗干扰能力强、特异性好、线性范围宽、准确度高，可用于胆道闭锁辅助诊断用途的荧光免疫层析试纸条和试剂盒，还存在技术上的难题。
具体实施方式
[0047] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚和容易理解，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明；应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不应理解为对本发明的限定。
[0048] 本发明实施例中使用的试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
[0049] 实施例1抗人MMP‑7兔单克隆抗体的制备
[0050] 1)动物免疫：为了获得识别人MMP‑7的兔单克隆抗体，以自主生产的重组MMP‑7蛋白为免疫原，免疫新西兰大白兔；每只大白兔免疫200ug，首次免疫将免疫原与等量的完全弗式佐剂混合制成乳化剂，腹部及背部皮下多点注射，间隔3周取100ug免疫原与等量的不完全弗式佐剂混合制成乳化剂，腹部及背部皮下多点注射，加强免疫两次，三次免疫后用ELISA方法测定血清效价，取血清效价高的兔子，用200ug免疫原就皮下多点注射加强免疫一次，三天后取脾脏。
[0051] 2)脾脏细胞分离：为本领域已知的常规的方法，
[0052] 3)B淋巴细胞分选：为本领域已知的常规的方法，例如参见专利201910125091.4：从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法。
[0053] 4)编码兔单克隆抗体基因的克隆
[0054] 培养后的B细胞上清用抗原包被的ELISA来鉴定阳性克隆。阳性克隆的细胞收集裂解后提取RNA并反转录成cDNA。采用PCR方法，天然配对的兔单克隆抗体轻重链可变区基因(VH和VL)从对应阳性克隆的cDNA中被扩增出来，并经测序确定序列。
[0055] 5)单克隆抗体的生产和纯化
[0056] 为了获得多株识别人MMP‑7的兔单克隆抗体，将兔单克隆抗体重链、轻链基因分别装载在表达载体上，将质粒转染293F细胞；转染72‑96小时获得培养上清中含有重组的识别人MMP‑7的兔单克隆抗体。使用protein A亲和凝胶树脂从转染后的培养基上清中纯化出重组的识别人MMP‑7的兔单克隆抗体，抗体鉴定后分装，于‑20℃低温保存备用。
[0057] 本发明中涉及抗人MMP‑7兔单克隆抗体Ⅰ和抗人MMP‑7兔单克隆抗体Ⅱ。
[0058] 其中：
[0059] 抗人MMP‑7兔单克隆抗体Ⅰ的轻链氨基酸序列为SEQ ID NO:1；重链氨基酸序列为SEQ ID NO:2；轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:3；重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:4；轻链互补决定区CDR1，CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7；重链互补决定区CDR1，CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10。
[0060] 抗人MMP‑7兔单克隆抗体Ⅱ的轻链氨基酸序列为SEQ ID NO:11；重链氨基酸序列为SEQ ID NO:12；轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:13；重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:14；轻链互补决定区CDR1，CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17；重链互补决定区CDR1，CDR2和CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:18，SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20。
[0061] 实施例2定量检测MMP‑7的荧光层析试纸条的制备
[0062] 一种定量检测MMP‑7的荧光层析试纸条，所述试纸条包括依序搭接在PVC底板上的样本垫、结合垫、包被膜和吸水垫；所述结合垫包被有荧光微球标记抗人MMP‑7兔单克隆抗体Ⅰ；所述包被膜上设置有划线的检测区(T线)和质控区(C线)；所述检测区(T线)包被有抗人MMP‑7兔单克隆抗体Ⅱ，质控区(C线)包被有羊抗兔IgG；检测时，待检样本通过样本垫上样，样本中的MMP‑7与结合垫中的荧光微球标记抗人MMP‑7兔单克隆抗体Ⅰ结合形成免疫复合物，该复合物随着膜的毛细管作用向上迁移到达检测区(T线)，与膜上的抗人MMP‑7兔单克隆抗体Ⅱ发生免疫反应，经特定波长激发光源激发后产生荧光信号，信号的强弱与样本中的MMP‑7含量成正比。
[0063] 上述定量检测MMP‑7的荧光层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：
[0064] 1)样本垫的制备：将样本垫用处理液浸泡0.5～1h，置于湿度＜25％，温度为45℃～60℃的烘箱，干燥12～24h，密封后置于室温条件下保存。
[0065] 2)结合垫的制备：将荧光微球标记的抗人MMP‑7兔单克隆抗体Ⅰ偶联物，用微球保存液稀释至浓度为0.05～0.1mg/ml喷涂在结合垫上，喷量为3～5μl/cm，喷涂完成后，将结合垫置于湿度＜25％的45℃～60℃的烘箱，干燥12～24h，密封后置于室温条件下保存。
[0066] 3)包被膜的制备：将抗人MMP‑7兔单克隆抗体Ⅱ、羊抗兔IgG分别用包被液稀释至浓度为0.5～1.0mg/ml,然后分别喷涂到包被膜的检测区(T线)和质控区(C线)，喷涂量均为1.0μl/cm，T线和C线的间隔为5‑7mm，喷涂完成后，将包被膜置于湿度＜25％的45℃～60℃的烘箱，干燥12～24h，密封后置于室温条件下保存。
[0067] 4)试纸条的制备：将制备的样本垫、结合垫、包被膜，以及吸水垫依序搭接粘贴在PVC底板上，并切割成3～4mm宽度的试纸条，即得所述定量检测MMP‑7的荧光层析试纸条。
[0068] 所述处理液包括：0.2～1％的牛血清白蛋白，1％～5％的蔗糖，0.2～1％海藻糖、0.03～0.1％的Tween‑20，0.02～0.05％的Proclin300，pH7.4的0.02M PBS缓冲液；
[0069] 所述微球保存液包括：0.8～1.2％的牛血清蛋白，1～5％海藻糖，0.05～0.1％的Tween‑20，0.02～0.05％的Proclin300，pH8.5的0.25M Tris缓冲液；
[0070] 所述包被液包括：1％～2％的蔗糖，0.02～0.05％的Proclin300，pH7.4的0.1M PBS缓冲液。
[0071] 实施例3MMP‑7荧光免疫层析检测方法的标准曲线制备及空白限分析
[0072] 将MMP‑7重组蛋白用含0.5％酪蛋白、0.4％Tween‑20、0.02％Triton‑X100的磷酸盐缓冲液进行梯度稀释成不同浓度，分别为200ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、25ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、2ng/ml、0.5ng/ml，作为样本进行检测，每个浓度重复检测3次，取平均值。以MMP‑7重组蛋白理论浓度的对数值为横坐标，以艾格立特(武汉)科技有限公司生产的IGreat‑IF‑F10型荧光免疫层析分析仪读取的检测卡T/C光强比值为纵坐标取双对数拟合，建立方程并拟合标准曲线，拟合标准曲线如图1所示。由标准曲线可以看出，该标准曲线的2
R为0.997，线性良好，可以通过该标准曲线对样本中所含MMP‑7浓度进行定量分析。
[0073] 用0ng/ml空白对照品作为样本，重复测定20次，计算20次T/C光强比值的平均值(M)和标准差(SD)，计算出M+2SD的T/C光强比值，代入定标曲线中，计算出对应浓度值，即为空白限灵敏度，测试结果见表1。
[0074] 表1空白限灵敏度试验结果
[0075]
[0076]
[0077] 实验结果显示建立的MMP‑7荧光免疫层析方法空白限灵敏度达到0.115ng/ml。
[0078] 实施例4MMP‑7荧光免疫层析检测方法的可测量线性区间验证
[0079] 选取1份接近预期检测范围上限的MMP‑7临床高值血清样本，和1份浓度接近于0的临床低值血清样本，以不同比例混合得到160ng/ml、80ng/ml、40ng/ml、20ng/ml、10ng/ml、2.5ng/ml、1.25ng/ml的7个不同浓度线性样本，将每个浓度的样本重复检测3次，计算其浓度平均值，将测定浓度的平均值与标定理论浓度值用最小二乘法进行直线拟合，得到线性
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回归方程，并计算线性相关系数R。结果在1.25～160.0ng/mL范围内，其相关系数R＞0.99，可表明在选取的2.0～150.0ng/ml测量区间内，测量线性良好。测试结果及曲线图见表2和图2所示。
[0080] 表2可测量线性区间验证试验结果
[0081]
[0082]
[0083] 实施例5MMP‑7荧光免疫层析检测方法的交叉反应性分析
[0084] 7种与MMP‑7同属于MMP大家族的主要类似物为MMP‑3、MMP‑4、MMP‑5、MMP‑6、MMP‑8、MMP‑9、MMP‑10，被用于对MMP‑7荧光免疫层析检测方法的交叉反应性验证。将7种MMP‑7的同家族类似物重组蛋白，用临界值附近的MMP‑7血清样本(26.21ng/ml)分别稀释成200ng/ml，作为样本进行检测，每份样本重复检测3次。计算样本检测结果的均值和相对偏差即干扰率，评价检测含MMP‑7同家族类似物重组蛋白样本时，是否存在交叉反应性，测试结果见表3。
[0085] 表3交叉反应性试验结果
[0086]
[0087]
[0088] 结果显示MMP‑7荧光免疫层析检测方法，检测这7种同属MMP家族的主要类似物重组蛋白时，均未产生交叉反应。
[0089] 实施例6MMP‑7荧光免疫层析检测方法的抗干扰验证分析
[0090] 选取两份MMP‑7不同浓度水平的新鲜血清样本(无溶血、无脂血、非黄疸)，1#样本的MMP‑7浓度为26.21ng/ml，2#样本的浓度为75.36ng/ml。将干扰物质胆红素、甘油三酯、血红蛋白分别添加至两份不同浓度血清样本中，使干扰物质最终浓度为胆红素400μg/ml、甘油三酯32mg/ml、血红蛋白20mg/ml。用实施例1中制备得到的荧光免疫层析检测卡测试三种干扰物质添加前后的两份样本中的MMP‑7浓度，每份样本重复测试3次，计算样本检测结果的均值和相对偏差即干扰率，评价常规临床干扰物质是否对MMP‑7测定结果有显著影响，测试结果见表4。
[0091] 表4干扰物质试验结果
[0092]
[0093]
[0094] 由表4可知，添加干扰物质前后各样本中MMP‑7的检测结果相对偏差均在±10％范围内，属于可接受范围，即本发明制备得到的MMP‑7荧光层析试纸条具有优异的抗干扰性能。
[0095] 实施例7MMP‑7荧光免疫层析检测方法与金标准检测方法的一致性检测
[0096] 用MMP‑7荧光免疫层析法和MMP‑7胶体金法(参照专利CN115561458A一种用于诊断胆道闭锁的胶体金快速检测卡)，同时检测30例胆汁淤积性肝病患者血清样本，其中临床确诊的BA样本(P1‑P15)和非BA样本(N1‑N15)各占15例。将两种方法的检测结果与临床金标准诊断结果进行对比，考察它们与金标准检测方法的一致性。测试结果见表5。
[0097] 表5与金标准方法对比试验结果
[0098]
[0099]
[0100]
[0101] 根据上述对临床样本的测试，由表5可知，当MMP‑7荧光免疫层析检测方法的阳性判断值设置为26.0ng/ml时，15例BA样本(P1‑P15)，荧光免疫层析法测得MMP‑7的浓度值均＞26ng/ml，结果判定为BA，而胶体金方法检测结果出现2例假阴结果(P5号样本、P14号样本)；15例非BA样本(N1‑N15)，用荧光免疫层析法测得的结果中，N7号样本测得MMP‑7浓度值＞26.0ng/ml，结果判定为BA，而胶体金方法检测结果出现2例假阳结果(N7号样本、N8号样本)。上述对比检测结果表明，荧光免疫层析方法与临床金标准诊断方法具有更好的一致性，敏感性和特异性分别为100.0％、93.3％，总符合率为96.7％。而胶体金方法在检测临界值附近样本时，容易出现假阴或假阳结果，敏感性和特异性分别为86.7％、86.7％，总符合率为86.7％。
[0102] 综合以上实施例可以看出，本荧光层析试纸条、试剂盒提供一种可定量检测血液样本中MMP‑7含量的荧光免疫层析方法，可用于胆道闭锁的辅助诊断。空白检出限低至0.115ng/ml，在检测范围2.0～150.0ng/ml线性关系良好，抗干扰能力强，与其它同家族蛋白无交叉反应性，与临床金标准检测方法的符合率高，整个检测过程只需要15分钟，为胆道闭锁的辅助诊断提供了一种新颖的非侵入性的无创快速检测方法，具有广阔的市场应用价值。
[0103] 以上具体实施方式详细描述了本发明的实施，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节。在本发明的权利要求书和技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单改型和改变，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
